一种新的靶向抗磷脂综合征β2GPI/抗体复合物中β2GPI的二聚体抑制剂

二聚体抑制剂A1-A1与单体A1的比较。抑制β2GPI与心磷脂的结合

抗β2GPI抗体产生多价β2GPI/抗β2PPI复合物，与通常存在于血浆中的病理性非活性β2GP1单体相比，其具有病理特性。在抗β2GPI抗体存在的情况下，β2GP1与阴离子磷脂的结合是导致抗磷脂综合征血栓形成和妊娠损失的病理机制之一。我们比较了二聚体抑制剂A1-A1和单体A1对β2GPI/抗β2GPI抗体复合物与包被在平板上的心磷脂结合的抑制作用。首先，我们使用合并的正常人血清作为β2GPI的来源。血清中大多数β2GPI分子呈圆形[11]为了为抑制研究选择合适的β2GPI浓度，我们测量了结合曲线(图2A). 为了创建β2GPI/抗β2GPI复合物，在样品应用于心磷脂之前，将恒定浓度的抗β2GPS抗体添加到β2GP中。抗β2GPI抗体的存在显著增强了β2GP1与心磷脂的结合，在存在和不存在抗β2PPI抗体的情况下，分别在血清的0.028±0.004%和0.40±0.05%达到半最大结合。然后，我们比较了在存在抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1和A1抑制血清中β2GP1与心磷脂结合的效率(图2B). 0.04%的人血清（位于结合曲线的线性区域）在含有抗β2GPI抗体和抑制剂的心磷脂涂层表面上培养。在存在抗β2GPI抗体的情况下，二聚体分子A1-A1抑制血清中β2GPI与心磷脂的结合，其强度远强于单体A1。在10±2µM A1-A1和218±21µM A1存在抗β2GPI抗体的情况下，达到了半最大抑制。此外，我们还测量了在没有抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1和A1如何抑制血清中β2GP1的结合(图3). 用A1-A1或A1滴定1%的人血清溶液。随后用抗β2GPI抗体检测与心磷脂结合的β2GP1。在缺乏抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1和A1在抑制β2GP1方面同样无效。当β2GPI抑制50%时，抑制剂的浓度对于A1-A1为189±34µM，对于A1为176±37µM。总之，在有抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1抑制血清中β2GP1与心磷脂结合的效率显著高于无抗体的情况。无论是否存在抗β2GPI抗体，单体A1的抑制效率几乎相同且较弱。在存在抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1比A1更有效地抑制血清中的β2GP1。

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图2

正常人血清中β2GPI与心磷脂的结合和抑制。

A） 在缺乏抗β2GPI抗体（三角形）和存在抗β2PPI抗体（圆形）的情况下，血清中β2GP1与心磷脂涂层表面的结合。B） 二聚体抑制剂A1-A1（圆圈）和单体抑制剂A1（三角形）在存在抗β2GPI抗体的情况下抑制人血清中β2GP与心磷脂的结合。对原始数据进行单位点结合和抑制模型拟合。为了便于比较，测量的外径₄₀₅值和结合曲线被归一化为从拟合中获得的最大结合。

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图3

在缺乏抗β2GPI抗体的情况下抑制人血清中β2GPI与心磷脂的结合。

二聚体抑制剂A1-A1（圆形）和单体抑制剂A1（三角形）的抑制曲线。在图中，A1-A1的50µM和100µM处的数据点与A1的相应数据点部分重叠。为了便于比较，测量的外径₄₀₅将值和结合曲线归一化为通过将原始数据拟合到单位点抑制模型而获得的最大结合。

接下来，我们分析了A1-A1和A1如何抑制纯化的β2GPI与心磷脂的结合。通过改变缓冲液中的pH值和NaCl浓度，β2GPI的闭合构象和扩展构象可以相互转化[11]表明纯化的β2GPI的构象可能取决于纯化过程。我们使用了从血液技术公司的人血浆中纯化的β2GPI，并分析了在存在和不存在抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1和A1对纯化的β2GPI的结合和抑制作用。在存在和不存在抗β2GPI抗体的情况下，纯化的β2GP分别在2.4±0.4 nM和43±4 nM时达到半最大结合(图4A). 我们在抗β2GPI抗体存在的情况下，用不同浓度的二聚体A1-A1和单体A1抑制剂培养10 nM的β2GP1。与我们在血清中观察到的β2GPI类似，在存在抗β2GP1抗体的情况下，A1-A1更有效地抑制β2GPI-心磷脂的结合。滴定数据与单位点抑制模型的拟合结果是，在存在抗β2GPI抗体的情况下，纯化的β2GP1的半最大抑制量为26±3µM A1-A1和191±34µM A1(图4B). 在另一个实验中，我们测量了抗体存在时β2GPI的抑制作用，并将测量值与滴定数据拟合预测值进行了比较(图4C). 测量值接近拟合的预期值，进一步证实，与A1相比，在存在抗β2GPI抗体的情况下，需要低得多的A1-A1浓度才能抑制纯化的β2GPI-心磷脂50%的结合。在没有抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1和A1都只能微弱地抑制纯化的β2GPI-心磷脂的结合(图5). 与我们在血清中观察到的β2GPI类似，二聚体抑制剂A1-A1比A1更强烈地抑制了纯化的β2PPI与抗心磷脂的结合。在缺乏抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1和A1对抑制β2GP1无效。

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图4

纯化β2GPI与心磷脂的结合。

A） 在缺乏（三角形）和存在（圆形）抗β2GPI抗体的情况下，从人血浆中纯化的β2GP1与心磷脂的结合。B） 二聚体抑制剂A1-A1（圆圈）和单体抑制剂A1（三角形）在存在抗β2GPI抗体的情况下抑制纯化的β2GP与心磷脂的结合。对原始数据进行单位点结合和抑制模型拟合。测量的外径₄₀₅值和结合曲线被归一化为从拟合中获得的最大结合。C） 比较根据抑制曲线拟合计算的β2GPI与心磷脂的预计结合率。在无抑制剂的抗β2GPI抗体（灰色条）、A1-A1（黑色条）和A1（白色条）存在下，纯化的β2GP1与心磷脂结合。外径₄₀₅值被归一化为OD₄₀₅在没有抑制剂的情况下测量。测量的相对结合度和标准偏差（±SD）值显示在条形图上方。预期相对结合值是根据滴定数据的拟合计算出来的，并在括号中给出。

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图5

在没有抗β2GPI抗体的情况下，A1-A1和A1抑制纯化的β2GPI-心磷脂的结合。

在没有抗β2GPI抗体的情况下，纯化的β2GP1与心磷脂结合，A1-A1（黑条）和A1（白条）的数量增加。外径₄₀₅值被归一化为OD₄₀₅在没有抑制剂的情况下测量。

β2GPI（β2GPI-DV）孤立结构域V的晶体结构

β2GPI通过其结构域V结合阴离子磷脂和A1模块[30],[31],[33],[34],[46]在延伸构象的全长β2GPI的晶体结构中[8],[9]，结构域V基本上不与相邻结构域形成接触。β2GPI中没有可能影响V结构域功能的糖基化位点，这表明从全长β2GPI-中分离出来的单个V结构域（β2GPI-DV）将以β2GPI.的扩展形式作为V结构域发挥作用。我们将孤立区域V的晶体结构解析为1.9º(表1). 如图所示图6β2GPI-DV的骨架构象与全长β2GPI中该结构域的结构几乎相同。结构之间的最大差异局限于C端回路。实验数据强烈表明，这个环在天然蛋白质中是灵活的。例如，在全长β2GPI（PDB ID 1QUB）的晶体结构之一中没有定义包含该环的311至317的残基[8]另一个具有较大的B因子值（PDB ID 1C1Z）[9]此外，环中的残基在溶液中β2GPI-DV的核磁共振谱中不是很弱就是缺失，这反映了其内部的灵活性[46]β2GPI-DV和全长β2GPI中V结构域之间的结构相似性提供了令人信服的证据，证明分离的重组β2GPI-DV以扩展形式模拟V结构域。

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图6

β2GPI（β2GPI-DV）孤立结构域V的晶体结构立体图。

β2GPI-DV链A（绿色）、链B（蓝色）的结构和全长β2GPI（PDB ID 1C1Z，残基从244到326）V域的晶体结构的主干叠加（红色）。域V中的N端和C端以及一个柔性环路都被标记。图是用PYMOL程序生成的[61]晶体不对称单元中的β2GPI-DV的两个分子链A和B具有几乎相同的结构，主链RMSD为0.23º。全长β2GPI中V结构域与β2GPI-DV结构的主干叠加，链A和链B的RMSD分别为1.04和0.97。

二聚体抑制剂A1-A1与单体A1的比较。在二聚化抗体存在下抑制β2GPI（β2GPI-DV）分离域V与心磷脂的结合

为了分析A1-A1和A1如何抑制β2GPI延伸形式与心磷脂的结合，我们使用了β2GPI-DV的纯化结构域V。我们在β2GPI-DV的N末端引入了一个肽标签，并使用直接指向该标签的抗体形成二聚体β2GPI-DV/抗体复合物。我们之前已经证明A1模块与β2GPI-DV的C末端部分结合[46]因此，β2GPI-DV上的N末端肽标签和结合的抗抗原抗体不会干扰A1模块与β2GPI-DV的结合。

与全长β2GPI的情况一样，二价β2GPI-DV/抗体复合物的存在增加了β2GPI-DV与心磷脂的结合(图7A). 将结合数据拟合到一个单位点模型中，在存在和不存在抗抗原抗体的情况下，β2GPI-DV的含量分别为19±1 nM和112±21 nM。当30 nMβ2GPI-DV在抗抗原抗体存在下与抑制剂孵育时，在A1-A1的12±2µM和A1的204±33µM处达到半最大抑制(图7B). 正如我们观察到的人血清中β2GPI和纯化的β2GPI-心磷脂涂层表面的结合受到抑制一样，在存在二聚β2GPI-DV/抗银抗体复合物的情况下，与单体A1相比，二聚抑制剂A1-A1对分离域V的抑制作用更强。

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图7

β2GPI（β2GPI-DV）单个结构域V与心磷脂的结合。

A） 在无二聚抗体（三角形）和有二聚抗体的情况下，β2GPI-DV与心磷脂的结合。B） 二聚体抑制剂A1-A1（圆圈）和单体抑制剂A1（三角形）在存在二聚体抗体的情况下抑制β2GPI-DV与心磷脂的结合。对原始数据进行单位点结合和抑制模型拟合。测量的外径₄₀₅值以及结合和抑制曲线被归一化为从拟合中获得的最大结合。

人血清中β2GPI与β2GPI-DV分离域V的比较。在无抗体的情况下，单体A1抑制与心磷脂的结合

我们研究了两种形式的β2GPI（圆形和延伸型）与心磷脂的结合是否受到A1的类似抑制。我们分析了单体A1对血清和分离结构域V中的单体分子β2GPI的抑制作用。正常人血清中大多数β2GPI呈环状构象[11]孤立结构域V以β2GPI的扩展形式模拟该结构域。需要相同浓度的A1来抑制人类血清中50%的β2GPI结合和β2GP1的单个结构域V(图8). 对于血清中的β2GPI，A1在半最大抑制时的浓度为176±37µM，对于结构域V，A1的浓度为188±44µM。该观察结果表明A1以相同的亲和力结合圆形和延伸的β2PPI，表明A1的结合位点在β2GP1的圆形中并不模糊。

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图8

在无二聚抗体的情况下，比较血清中β2GPI的抑制与单体A1对分离域V的抑制。

A1（圈）抑制β2GPI-DV结合；A1（三角形）对血清中β2GPI结合的抑制作用。

β2GPI-DV的结晶、数据收集和结构测定

在Hauptman-Woodward医学研究所进行的结晶筛选中确定了初始结晶条件[55]将1µLβ2GPI-DV（20 mM HEPES中为7 mg/ml，pH值为7.0）与1µL含有100 mM硫酸铵、40%PEG 1500、100 mM双Tris、pH值为7.2的储液溶液混合，在室温下用吊滴法获得最佳β2GPI-DV晶体。添加20%甘油的储液溶液用作低温保护剂。数据采集自布鲁克海文国家实验室（NSLS）光束线X29A处的单晶。晶体属于空间群P1，每个不对称单元有两个β2GPI-DV分子，溶剂含量为45%。使用MOSFLM处理数据[56]共有5%的反射被排除并用于R_自由的计算。通过PHASER分子替换解决了结构问题[57]使用从β2GPI（PDB ID 1C1Z）晶体结构中提取的V域坐标。PHASER确定的初始模型通过COOT程序进行了调整[58]并使用REFMAC5程序进行优化[59].使用PHENIX软件套装进行最终改进[60].

β2GPI和β2GPI-DV与心磷脂涂层表面结合和抑制的测定

将ImmunoWELL心磷脂IgG检测试剂盒（GenBio）中的心磷脂涂层96孔板用0.5%脱脂奶和2%BSA封闭在20 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM CaCl2、pH 7.4中。分析缓冲液含有20 mM Tris、100 mM NaCl、2 mM CaCl2、pH 7.4和2%BSA，洗涤缓冲液为20 mM Tris、100 mM-NaCl和2 mM CalCl2，pH 7.4。当在实验中使用纯化的β2GPI（血液技术公司）时，将27 mM甘氨酸添加到分析缓冲液中，以说明β2GP1储备溶液中存在的甘氨酸。用稀释1∶2500的过氧化物酶偶联抗β2GPI抗体（雪松，CL20021HP，2 mg/ml）检测与心磷脂结合的β2GP。为了检测与心磷脂结合的β2GPI-DV，我们使用了过氧化物酶结合的抗HA抗体（Abcam，ab1265，1 mg/ml），直接针对β2GPI-DV N末端的HA表位标签，稀释1∶2500。用2-2′-叠氮二-[3-乙基苯并噻唑啉]磺酸盐（ABTS）显色剂在405nm处测量OD，检测结合抗体的过氧化物酶活性。所有测量均一式三份，并在数据拟合前校正至空白。空白组含有除β2GPI、血清或β2GPI-DV外的所有成分。使用GNUPLOT程序中实现的非线性最小二乘Marquardt-Levenberg算法将结合和抑制数据拟合到单位点模型。然后将原始数据和滴定数据点的拟合归一化为根据拟合确定的最大结合力，以便于比较。

对于结合研究，将50µl浓度不断增加的β2GPI（血液技术公司）、混合正常人血清（创新研究）或纯化重组β2GPI-DV应用于微孔中，并在室温下培养1小时。清洗后，将抗-β2GPI或抗-HA抗体添加到微孔中，并在室温下培养1小时，然后进行检测。在第二组实验中，含有不同浓度β2GPI、混合正常人血清或β2GPI-DV的样品首先在室温下与抗β2GP1或抗HA抗体孵育1小时。然后，将样品应用于心磷脂，孵育1小时，清洗，并检测结合的β2GPI或β2GPI-DV。

在抑制研究中，将不断增加的A1或A1-A1浓度添加到等量的β2GPI（50 nM）、正常人血清（1%）或β2GPI-DV（130 nM）中，并在室温下培养1小时。然后，将50µl混合物在微孔上再培养1小时。清洗后，向微孔中添加50µl抗β2GPI或抗HA抗体，并在检测前培养1小时。在第二组实验中，首先在室温下用抗-β2GPI或抗-HA抗体将50µl含有浓度不断增加的A1或A1-A1以及恒定量的β2GP1（10 nM）、正常人血清（0.04%）或β2GPI-DV（30 nM）的样品培养1小时。然后，将样品在微孔上再培养1小时，清洗后，检测结合的β2GPI/抗-β2GPI或β2GPI-DV/抗银抗体复合物。

本研究的晶体数据是在国家同步辐射光源的光束线X29处测量的，该光束线主要由美国能源部生物与环境研究办公室和基础能源科学办公室以及国家卫生研究院国家研究资源中心提供支持。坐标和结构因子已存入蛋白质数据库，注册号为3OP8。