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致癌物。作者手稿；PMC 2011年10月21日发布。
以最终编辑形式发布为：
致癌物。2011年4月21日；30(16): 1855–1867.
2010年12月13日在线发布。 数字对象标识：10.1038/onc.2010.561
预防性维修识别码：项目经理3081401
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院250870
PMID：21151168

自噬对抑制细胞应激和BCR-Abl介导的白血病发生至关重要

布莱恩·奥尔特曼,1 莎拉·雅各布斯,1 艾米丽·梅森,1 瑞安·D·米查莱克,1 安德鲁·麦金太尔,1 乔纳森·L·科尔夫,1 奥尔加·伊尔卡耶娃,1,2 魏佳,三 优文和,三和杰弗里·拉思梅尔1,2,三，*
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补充资料

摘要

造血细胞通常需要细胞外信号来维持新陈代谢和生存。相反，癌细胞可以表达构成活性的致癌激酶，如BCR-Abl，这些激酶可以独立于外源性生长因子促进这些过程。当细胞接收不到足够的生长信号或致癌激酶受到抑制时，葡萄糖代谢降低，自噬的自我消化过程升高，从而降解大量细胞质和细胞器。虽然自噬被提议为线粒体氧化代谢提供细胞内营养物质供应，并通过降解受损的细胞器或蛋白质聚集体来维持细胞内平衡，但其在生长因子剥夺或抑制致癌激酶方面的急性作用尚不清楚。因此，我们开发了一种生长因子依赖性造血细胞培养模型，在该模型中，自噬可以通过条件Cre介导的自噬必需基因Atg3的切除而被急性破坏。处理后的细胞迅速丧失了自噬能力，并经历了细胞周期阻滞和凋亡。虽然在提取生长因子时，Atg3对线粒体氧化途径的最佳上调至关重要，但自噬的这种代谢作用似乎对细胞存活并不重要，因为提供外源性丙酮酸或脂质并不能完全缓解Atg3的不足。相反，自噬抑制了应激反应，否则会导致p53磷酸化，p21和促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma上调。重要的是，BCR-Abl表达细胞自噬的基础水平较低，但高度依赖于这一过程，并且通过Atg3缺失或使用化学自噬抑制剂治疗，在自噬中断后迅速发生凋亡。这种对自噬的依赖性扩大了在体内，因为Atg3缺失也阻止了细胞移植模型中BCR-Abl介导的白血病发生。这些数据共同证明了自噬在缓解细胞应激中的关键作用，并且表达致癌激酶BCR-Abl的细胞似乎特别依赖于自噬来维持细胞生存和白血病发生。

关键词：自噬、BCR-Abl、Puma、凋亡、代谢、p53

简介

正常后生动物细胞需要生长因子来维持新陈代谢、维持细胞内环境稳定和防止细胞死亡(拉夫1992,Rathmell等人2000). 相反，癌细胞可以表达致癌激酶来模拟生长因子并使细胞独立于外部信号(DeBerardinis等人2008,Hanahan和Weinberg 2000). 对这些信号的获取或抑制不足会导致细胞萎缩，导致营养吸收减少，并激活自噬的自我暗示过程(奥特曼和拉特梅尔2009,Lum等人2005a,Plas等人2001,Rathmell等人2000,Wieman等人，2007年). 自噬可能在这种应激反应中起关键作用(Altman等人2009,Colell等人2007年)然而，自噬在缺乏生长信号的细胞中的急性作用，以及抑制自噬如何影响靶向癌症治疗，在很大程度上仍不确定。

自噬可能通过几个途径影响失去生长信号的细胞。自噬体可能专门针对受损的线粒体(Colell等人2007年,Kim等人2007)，过氧化物酶体(Iwata等人，2006年)，或蛋白质聚集体(Pankiv等人2007年)维持细胞器和蛋白质的细胞内稳态。事实上，蛋白质聚集体可以导致DNA损伤和基因组不稳定(Mathew等人，2007年,Mathew等人，2009年)损伤线粒体的积累可以促进细胞凋亡(Mathew等人，2009年). 自噬也可以通过细胞内成分的溶酶体降解为线粒体氧化提供营养(Altman等人2009,Lum等人2005b,Mathew等人，2007年,Singh等人2009年). 在细胞凋亡受到抑制的情况下，生长因子长期缺乏，这种代谢作用对维持细胞活力至关重要(Lum等人2005a).

鉴于自噬在新陈代谢和细胞生存中的潜在功能，操纵自噬可能是消除癌细胞的关键手段。自噬本质基因的杂合性贝克林-1导致肿瘤发生率大大提高(Liang等人1999年,Yue等人2003)可能是由于自噬减少时基因组不稳定(Mathew等人，2007年). 相反，自噬也被证明能促进癌细胞在应激或营养缺乏后的存活(Degenhardt等人2006,Jin等人2007,Karantza-Wadsworth等人，2007年,Lum等人2005a). 抑制自噬的一个有希望的方案可能是治疗由模拟生长信号的致癌激酶驱动的癌症，如BCR-Abl，其中抑制自噬者可能会增强激酶抑制剂诱导的凋亡(Bellodi等人2009年,Carew等人2007年,Kamitsuji等人，2008年). 然而，自噬的确切作用以及抑制这一过程如何影响BCR-Abl+白血病尚不确定。

为了直接说明自噬在控制细胞代谢和生存能力中的作用，我们利用自噬关键基因Atg3的条件缺失，建立了一个自噬途径的急性遗传抑制模型。在有无生长因子的情况下，Cre介导的Atg3切除导致自噬中断、细胞周期阻滞和最终凋亡细胞死亡。我们观察到自噬对特定代谢的贡献，但这些营养物质似乎对细胞存活并不重要。相反，自噬的破坏导致p53通路激活，细胞周期停滞，彪马诱导和细胞凋亡。有趣的是，表达致癌BCR-Abl的细胞基础自噬水平较低，但对自噬破坏高度敏感，并且在Atg3缺失时未能产生白血病体内总之，这些数据直接证明了抑制自噬可以增强细胞应激，促进细胞死亡并防止BCR-Abl驱动的白血病发生。

结果

条件Atg3缺失造血细胞模型的建立

我们建立了一个条件缺失自噬基因Atg3的模型来检测自噬的作用。Atg3的造血前体细胞前/后分离Cre-ER（A3C）小鼠并感染表达Hox11的病毒以抑制细胞分化(图1A) (Zinkel等人2005). 这种造血祖细胞的混合群体可以在IL3中扩增，并且当用4-羟基他莫昔芬（4OHT）处理以激活Cre重组酶时，Atg3很容易切除(图1B). 4OHT未导致Atg3损失(补充图S1A)或缺乏Cre-ER细胞的细胞毒性(补充图S1B)在野生型Atg3的细胞中，4OHT激活Cre不会导致活性或生长丧失(补充图S1C-D). 为了确保Cre介导的DNA切除不会引起DNA损伤反应，对照组的骨髓和IL7R前/后Cre-ER小鼠(Jacobs等人，2010年)收获并用4OHT处理以删除IL7R（造血前体细胞中不表达的基因），或用足叶乙甙直接造成DNA损伤。γH2A。十、 DNA双链断裂的标记(Kurz和Lees-Miller 2004年)在足叶乙甙治疗后观察到，但在4OHT治疗后未观察到(补充图S1E).

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造血A3C细胞群中Atg3的诱导性切除可严重破坏自噬

A类.永生化的产生和模型、培养条件和从Atg3中切除Atg3前/后A3C细胞的Rosa26-Cre-ER小鼠。B。用乙醇或0.5μM 4-羟基他莫昔芬（4OHT）培养A3C细胞指定的时间，并通过免疫印迹观察Atg3的损失。非特异性带用<表示。C类.，D。表达Bcl-2的A3C细胞用乙醇或4OHT培养4天，然后在无乙醇的情况下培养(C类)或存在(D类)使用40μM氯喹（CQ）10小时，并通过免疫印迹法评估LC3-II、GABARAP、Gate-16和p62蛋白的积累。使用LC3抗体优先识别LC3-II。E。表达A3C GFP-LC3的细胞与乙醇或4OHT培养两天，并在Amnis ImagestreamX多光谱成像流式细胞仪上进行LC3-functa分析。左侧面板显示单个细胞中LC3-bunta数量的直方图，右侧面板显示多点模式与少点模式的示例。所示数据代表三个或更多实验。

为了检测自噬在细胞代谢和凋亡中的作用，将A3C细胞转导到稳定过度表达葡萄糖转运蛋白Glut1、抗凋亡蛋白Bcl-2或截短的非功能性人类神经生长因子受体（NGF）标记物作为对照(补充图S2A). 流式细胞仪染色观察细胞表面Glut1(补充图S2B) (Wieman等人，2007年). 在每个细胞群中，4OHT处理导致Atg3表达降低(补充图S2C). 在功能上，Atg3缺失破坏了自噬，因为4OHT治疗会损害自噬标记物的积累，而Atg3靶向LC3-II、GABARAP和Gate-16，并增加p62的积累，p62是一种通常通过自噬降解的蛋白质(Bjorkoy等人2005) (图1C). 由于自噬导致自噬体的溶酶体降解，LC3-II、GABARAP、Gate-16和p62的总水平反映了处理和降解，因此用氯喹处理细胞以阻止溶酶体蛋白水解(图1D). 在每一种情况下，Atg3切除都阻止了蛋白质加工。在有无4OHT的情况下，通过高通量图像分析对A3C细胞进行分析，以定量GFP-LC3点状细胞(图1E). 4OHT处理的细胞具有较少的GFP-LC3点，表明Atg3缺失破坏了自噬的基础水平。总的来说，这些数据表明4OHT和Cre重组并不是本质上的细胞毒性，Atg3可以在A3C细胞群中有效切除，从而导致自噬的急性遗传阻断。

Atg3缺失导致细胞周期停滞和死亡加剧

A3C细胞的建立允许直接检查自噬对细胞生长和存活的作用。Atg3对IL3培养中细胞随时间的积累至关重要(图2A). 这在一定程度上是由于细胞周期阻滞，因为Bcl-2抑制凋亡的表达并不能阻止细胞周期阻滞并且Bcl-2表达的A3C细胞不能有效地结合BrdU(图2B)并在细胞周期的G1或G2期被捕(图2C)Atg3删除后。生长因子缺乏通过增加蛋白水解和减少营养摄入导致萎缩和细胞代谢降低(爱丁格尔和汤普森2002,Rathmell等人2000,Wieman等人，2007年)和Atg3缺失部分维持了表达凋亡抵抗Bcl-2的A3C细胞的细胞大小，而IL3缺失(图3A). 重要的是，在IL3存在和不存在的情况下，Atg3的缺失导致细胞死亡增加，但Bcl-2的表达部分抑制了这种死亡，这使得在没有Atg3和IL3的情况下延长生存期(图3B). 这些数据表明凋亡和Bcl-2家族蛋白在IL3缺乏的Atg3缺乏细胞死亡中起作用。事实上，IL3的退出导致了Mcl-1的丢失和促凋亡蛋白Puma和Bim的诱导，这在Atg3缺乏细胞中得到了增强(图3C). 进一步支持凋亡是细胞死亡的机制，Atg3的缺失也导致具有活化Bax和亚二倍体DNA含量的细胞的积聚(补充图S3A-B).

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自噬的破坏导致培养中的细胞周期阻滞

答：。表达NGF的A3C对照细胞在4OHT存在或不存在的情况下培养，每天使用Coulter Z2粒子计数器评估细胞数量。B、 C、。表达Bcl-2的A3C细胞用乙醇或4OHT培养三天，第二天更换培养基并添加新药，然后用溴代脱氧尿苷（BrdU）培养，并用流式细胞仪检测BrdU掺入和PI染色（以显示DNA含量）(B类)BrdU公司和(C类)PI细胞周期分析。显示了三份样品的平均值和标准偏差。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。

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在生长因子存在和不存在的情况下，自噬破坏延迟萎缩并增强细胞死亡

答：。表达Bcl-2的细胞在存在或不存在4OHT的情况下培养四天以删除Atg3，然后在存在或没有4OHT和IL3的情况下进行培养。通过流式细胞仪前向扫描评估Bcl-2表达细胞的细胞大小。B。用乙醇或4OHT培养对照NGF或Bcl-2表达的A3C细胞两天，然后在4OHT和IL3存在或不存在的情况下培养，并用碘化丙锭排斥流式细胞术评估对照NGF和Bcl-2表示的细胞的存活率。注意不同的时间尺度.C类表达Bcl-2的A3C细胞用乙醇或4OHT培养两天以防止自噬，并从IL3中取出指定时间。通过免疫印迹分析Mcl-1、Puma、Bim和Bax。显示了三份样品的平均值和标准偏差。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。

自噬支持急性生长因子缺乏细胞的代谢，但似乎不是必需的

药理学抑制或慢性基因缺失实验表明，营养素的脂质氧化是通过细胞内成分的自噬降解而实现的(奥特曼和拉特梅尔2009,Singh等人2009年)可以支持代谢应激细胞的存活(Altman等人2009,Degenhardt等人2006). 事实上，经糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2DG）治疗后，Atg3缺陷细胞比自噬活性细胞对细胞死亡更敏感(补充图S4).

自噬也可能支持生长因子缺乏后营养吸收减少的细胞代谢(Lum等人2005a). IL3缺乏降低糖酵解通量(图4A)，证明生长因子介导A3C细胞糖酵解代谢的控制。为了在这个等基因系统中直接确定自噬对细胞代谢的贡献，我们对用4OHT处理或未处理的A3C细胞进行了基于质谱的代谢组学分析，以删除Atg3，并在有或无IL3的情况下培养。与生长因子对糖酵解速率的调节一致，IL3剥夺降低了细胞内乳酸和来自葡萄糖代谢和三羧酸（TCA）循环的有机酸水平，无论Atg3状态如何(图4B和补充图S5A). 酰基鸟氨酸是线粒体氧化可用的燃料，来源于膜破裂产生的脂肪酸，在IL3缺乏后以Atg3依赖的方式增加(Altman等人2009,An等人2004) (图4C). 在表达Atg3的缺乏IL3的细胞中，一些氨基酸的细胞内水平也增加，但在缺乏Atg3的细胞中没有增加(补充图S5B-D).

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Atg3缺失影响细胞代谢，但这些变化似乎对生长因子戒断早期的存活并不重要

A至C。表达Bcl-2的A3C细胞与IL3培养24小时或从IL3中提取(A类)糖酵解(B类)细胞内乳酸，以及(C类)测定了短链C2（乙酰基）和长链酰基肉碱C16（棕榈酸）、C18:1（油酸）和C18（硬脂酸）。D-F公司.控制NGF(D类)，表达Bcl-2(E类)，或表达Glut1(F类)用乙醇或4OHT培养两天以抑制自噬，然后在有或无IL3的情况下，与5 mM油酸和棕榈酸（OP）、10 mM甲基丙酮酸（MeP）、OP+MeP或BSA的1:1混合物一起培养，作为对照，并评估细胞活力。注意不同的时间尺度.显示了三份样品的平均值和标准偏差，即质谱实验的标准误差。所示数据代表三个或更多实验。星号表示IL3提取样品与对照样品的Student t检验结果p<0.05B、 C类，4OHT处理的样品与对照处理的样品相比F类.

营养素的提供可能会调节生长因子缺乏时自噬的生存益处，添加外源营养素可能会取代自噬，以支持生长因子生成细胞的生存能力。对照细胞和表达Bcl-2的细胞在4OHT存在或不存在的情况下培养，从IL3中提取，并提供甲基丙酮酸，一种终糖酵解产物丙酮酸的细胞渗透形式，长链脂肪酸油酸和棕榈酸（OP）的1:1混合物，或这些营养素的组合(图4D，E). 没有任何条件可以拯救缺乏Atg3的细胞，使其在停止生长因子后免于死亡。甲基丙酮酸和OP均未显著改变细胞ATP水平(补充图6A)这表明自噬缺陷细胞没有受到强烈的代谢应激，或者不能有效地吸收和利用这些营养物质。为了确保营养物质的获取，葡萄糖转运蛋白谷氨酸1被表达以增强和维持葡萄糖摄取，即使在去除IL3后(Zhao等人2007). 虽然谷氨酸1的表达本身并不影响Atg3缺失细胞的细胞死亡，但甲基丙酮酸和OP的提供适度增加了对照和4OHT处理的谷氨酸1表达细胞的存活率–IL3(图4F). 无法完全挽救生存表明缺乏代谢应激；同样，代谢应激蛋白磷酸-AMP激酶（AMPK）、其下游靶点磷酸乙酰辅酶A羧化酶（ACC）以及磷酸-S6在Atg3缺失后保持不变(补充图S6B、C). 总之，这些数据表明，自噬衍生的营养素在应对直接代谢应激时至关重要，但在生长信号缺失后的最初几天并非如此。

自噬的破坏导致促凋亡蛋白的诱导和p53的激活

除代谢外，自噬还参与许多途径和细胞器的体内平衡，包括线粒体和内质网(Bernales等人2006年,Hoyer-Hansen和Jaattela，2007年,Kim等人2007). 自噬的急性破坏导致内质网应激标记物Chop的诱导略有增加，尽管这与内质网诱导化合物Tunicamycin的治疗相比是适度的，并且Atg3缺失导致标记物BiP或Calnexin没有增加(图5A). 自噬破坏也可能导致线粒体功能障碍和活性氧应激(Mathew等人，2009年)激活p53通路(Karawajew等人2005,Liu等人2008,Niizuma等人2009年). 事实上，p53在丝氨酸18上被强烈磷酸化（相当于人类S15），并且在Atg3缺失后p53总蛋白积累(图5B). 除了诱导美洲狮(图3C)，在Atg3缺失后诱导p53靶基因p21。有趣的是，γH2A。十、 可能是p53激活上游的DNA双链断裂标记(Kurz和Lees-Miller 2004年)，也因自噬的破坏而增加，特别是在生长因子退出后。

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Atg3缺失导致细胞应激和p53激活

A、 B。表达Bcl-2的A3C细胞在4OHT存在或不存在的情况下培养两天，然后退出IL3指定时间。(A类)免疫印迹法分析内质网应激标记物Chop、BiP和Calnexin。一些细胞用2μg/mL衣霉素（Tun）处理12小时。(B类)磷酸-p53丝氨酸18、总p53、p21和DNA损伤反应蛋白γH2A。X（磷酸组蛋白H2A.X丝氨酸139）通过免疫印迹进行分析。C、。将FL5.12细胞从IL3中取出指定的时间和γH2A。免疫印迹分析X和p21。所示数据代表三个或更多实验。

而γH2A的出现。X提示DNA损伤，但不清楚为什么这是在p53磷酸化和细胞周期阻滞蛋白p21诱导后发生的(图5B). γH2A检测的时间差异。X和DNA损伤反应的标记可能解释了这种差异，但γH2A。X也可能独立于DNA损伤而被诱导。与后一种可能性一致，IL3依赖细胞系FL5.12细胞的IL3退出导致γH2A的积累。X而非p21(图5C)，表示γH2A。X可能是细胞应激或凋亡的一般标志。这些数据表明，A3C细胞自噬的破坏可能通过p53磷酸化、激活和诱导包括Puma在内的促凋亡靶基因导致生长停滞和最终死亡。

自噬对抑制p185 BCR-Abl转化的A3C细胞中的p53至关重要

BCR-Abl等癌基因激酶模拟生长因子信号，是癌症治疗中选择性激酶抑制剂的靶点(Bellodi等人2009年,Kamitsuji等人，2008年). 为了检测自噬在表达致癌激酶的细胞中的作用，p185 BCR-Abl在A3C细胞中单独或与谷氨酸1一起稳定表达(补充图S7A、B). 在表达BCR-Abl和BCR-Abl/Glut1的细胞中观察到有效的Atg3切除(补充图S7C)p62的积累表明自噬被抑制(补充图S7C)并降低LC3-II(补充图S7D). 有趣的是，BCR-Abl表达细胞的基础LC3-II少于对照细胞(补充图S7D)表明基础自噬水平较低。伊马替尼治疗阻断BCR-Abl激酶活性和信号转导，这与BCR-Abl-表达细胞自噬的存活作用一致(补充图S7E) (卡拉斯和弗鲁曼2005,Modi等人2007年)导致细胞死亡，并因Atg3缺失而加重(图6A).

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BCR-Abl-transformed A3C细胞对自噬丧失敏感

答：。BCR-Abl表达的A3C细胞在4OHT和0.1μM伊马替尼存在或不存在的情况下培养两天，并评估存活率。B、 C类对照组NGF和BCR-Abl表达细胞在IL3和4OHT存在或不存在的情况下培养10天，第二天更换培养基并添加新的4OHT，生长细胞每两天分裂一次。(B类)通过库尔特Z2粒子计数器上的定量来测量细胞随时间的积累，并且(C类)采用流式细胞术检测死亡。D。对照组NGF和BCR-Abl表达细胞用4OHT处理指定时间，并用磷酸化p53丝氨酸18、总p53、p21、Puma和γH2A处理。免疫印迹分析X。显示了三份样品的平均值和标准偏差。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。

考虑到随着自噬和BCR-Abl抑制的同时破坏死亡的增加，我们接下来试图确定基础自噬如何影响BCR-Abl-表达细胞的生长和存活。BCR-Abl表达细胞能够独立于IL3生长(图6B、C)但在IL3存在或不存在的情况下，Atg3切除导致细胞周期停滞和细胞快速死亡，与对照细胞相似(图6B、C). 值得注意的是，谷氨酸1的表达并不能保护人免受这种死亡(补充图S8A、B)下游AMPK靶点磷酸化-ACC没有激活(补充图6C)这表明细胞死亡不太可能是由代谢应激引起的。相反，Atg3缺失导致p53磷酸化和积累增加，以及p21、Puma和γH2A的诱导增加。X（X）(图6D). 一些细胞持续存在，但这可能是由于Atg3缺失效率低下和自噬活性的Atg3表达细胞的生长，因为在以后的时间点，在存活细胞中很容易检测到Atg3和处理的LC3-II(补充图S9).

Atg3缺失导致细胞增殖和生存能力的丧失可能是由于自噬的普遍抑制或潜在的Atg3特异性效应。因此，我们通过在任一氯喹中培养A3C对照和表达BCR-Abl的细胞来化学抑制自噬，氯喹可以抑制自噬消化的最后溶酶体降解步骤(所罗门和李2009)或3-甲基腺嘌呤（3MA），抑制自噬上游的PI3K(Seglen和Gordon 1982年). 氯喹对IL3中培养的对照A3C细胞的生长和存活影响较小，但强烈抑制BCR-Abl表达细胞的生长与存活(图7A、B). 同样，3MA处理抑制了对照细胞和BCR-Abl表达细胞的细胞聚集并导致死亡(图7C、D)尽管表达BCR-Abl的细胞对3MA的耐药性更强。总之，这些数据支持BCR-Abl表达的A3C细胞依赖自噬而非Atg3特异性功能的观点。

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药物抑制自噬促进BCR-Abl转化的A3C细胞死亡

A、 B。对照NGF和BCR-Abl表达细胞在IL3和10μM氯喹（CQ）存在或不存在的情况下培养，更换培养基，添加新的4OHT，并在第二天分裂生长细胞。(A类)通过库尔特Z2粒子计数器上的定量来测量细胞随时间的积累，并且(B类)采用流式细胞术检测死亡。C、 D。对照NGF和BCR-Abl表达细胞在有IL3或无IL3的情况下培养，用于BCR-Abl-表达细胞，并用0、5或10 mM 3-甲基腺嘌呤（3MA）培养。(A类)通过库尔特Z2粒子计数器上的定量来测量细胞随时间的积累，并且(B类)通过流式细胞术测量死亡。显示了三份样品的平均值和标准偏差。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。

Atg3缺失后的细胞周期阻滞和凋亡可能是由于p53激活所致。为了研究p53通路在Atg3缺乏的Bcr-Abl表达细胞死亡中的重要性，将细胞转导以稳定表达p53 shRNAi(Mason等人，2010年). 这种部分p53敲除降低了4OHT处理细胞中p21和Puma的诱导(图8Ap21、Puma和γH2A的定量。X提供），并允许持续细胞积累(图8B)死亡人数略有减少(图8C)即使在删除Atg3之后。因此，肿瘤抑制因子p53对细胞周期阻滞至关重要，可能有助于Atg3缺失后BCR-Abl表达细胞的凋亡。

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靶向p53的shRNAi减轻Atg3切除的一些影响

答：。用控制载体或p53 shRNAi稳定转导的BCR-Abl表达细胞用4OHT和磷酸化p53丝氨酸18、总p53、p21、Puma和γH2A处理指定时间。免疫印迹分析X。提供p21、Puma和γH2A的定量。十、 归一化为相对背景和肌动蛋白。B、 C、。对有或无p53 shRNAi的BCR-Abl表达细胞用4OHT处理指定时间，更换培养基，添加新的4OHT，并在第二天分裂生长细胞。(B类)通过库尔特Z2粒子计数器上的定量来测量细胞随时间的积累，并且(C类)采用流式细胞术检测死亡。所示数据代表三个或更多实验。星号表示4OHT处理样品与对照处理样品的Student t检验结果p<0.05。

抑制自噬防止BCR-Abl的形成+白血病

BCR-Abl表达细胞对自噬破坏的敏感性表明，自噬可能在支持BCR-Ab1驱动的白血病中发挥重要作用体内为了直接检测自噬在白血病中的作用，将对照或BCR-Abl表达的A3C细胞静脉注射到免疫缺陷受体中。然后对小鼠进行对照治疗或三苯氧胺治疗三天，以激活Cre-ER并促进体内删除Atg3(图9A). 在任何时候，接受对照A3C细胞的动物都没有发病。相反，接受BCR-Abl表达的A3C细胞和对照治疗的小鼠均出现白血病(图9A)以脾肿大为特征(图9B)脾结构的破坏(图9C). 然而，在接受BCR-Abl细胞并用三苯氧胺治疗以删除Atg3的动物中，没有一只在此期间表现出白血病迹象或脾脏大小或结构的显著改变。在另一项实验中，与对照组小鼠相比，注射BCR-Abl表达细胞并在注射后立即或两周用三苯氧胺治疗的小鼠没有出现脾脏肿大(图9D)这表明，自噬的破坏可能会影响更为成熟的癌症的进程。因此，Atg3的急性缺失和自噬的破坏足以阻止BCR-Abl依赖性白血病的进展体内.

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自噬的丧失阻止BCR-Abl的形成+同种异体移植白血病模型中的癌症

答：。免疫低下小鼠注射对照或BCR-Abl表达的A3C细胞，小鼠接受腹腔注射载体或三苯氧胺三天，并测量无病生存时间。B-C.公司。每只动物的脾脏都被切除(B类)称重，具有代表性的脾脏显示在底部面板中(C类)用苏木精和伊红进行组织学检查。平均值和标准偏差分别来自6只注射BCR-Abl表达细胞的小鼠和4只注射NGF表达细胞的老鼠。星号表示学生t检验的p<0.05。D。免疫低下小鼠注射GRP+或BCR-Abl A3C细胞，小鼠在细胞注射后立即腹腔注射载体或三苯氧胺三天，或在细胞注射两周后连续三天，如图所示。细胞注射后50天处死小鼠，并称重单个脾脏。

讨论

自噬对促进生存起着关键作用，因此我们建立了一个生长因子依赖性细胞模型，在该模型中，自噬基因Atg3可以通过激活Cre-ER而被诱导切除。这种破坏自噬的急性遗传方法避免了药物或RNAi介导的自噬抑制的非特异性或部分效应(Altman等人2009)以及生殖系淘汰的发育补偿。缺乏Atg3的细胞经历了更快的细胞死亡，脂质代谢水平降低，表现出轻微的内质网应激和p53通路的强烈激活，这对有效的p21和Puma诱导以及细胞周期阻滞至关重要。重要的是，BCR-Abl表达细胞依赖于自噬，因为Atg3切除或药物抑制自噬会导致细胞死亡并预防BCR-Abl-依赖性白血病。自噬的急性遗传破坏证明了该途径在控制细胞应激和存活方面的关键重要性。

Atg3的缺失似乎强烈抑制了自噬。Atg3是一种高度保守的E2样酶，负责几个下游靶点的脂质氧化，这些靶点对自噬至关重要，包括LC3、GABARAP和Gate-16(Weidberg等人2010)在Atg3切除后，每一个都表现出加工减少。保护p62和减少Atg3缺陷细胞中GFP-LC3点状结构的形成进一步表明自噬破坏。虽然在考虑的时间点，在整个细胞群中没有观察到自噬的完全阻断，但这可能是由于基因切除后Atg3的不完全缺失或Atg3蛋白的降解所致。此外，虽然Atg3靶点在自噬中很重要，但GABARAP和Gate-16已被证明在与自噬无关的多种膜贩运事件中至关重要(Lainez等人2010,Lesses-Miller等人2000,Sagiv等人2000). 因此，改变这些蛋白质的脂质化也可能影响其他独立于自噬的细胞过程。然而，使用药物抑制剂3-MA和氯喹的类似发现表明，自噬本身对生长和生存至关重要。

目前尚不清楚为什么自噬是细胞存活所必需的。虽然生长因子对促进葡萄糖摄取和糖酵解至关重要，但在没有生长因子输入的情况下，自噬可以从细胞器和其他代谢物质的溶酶体消化中获得代谢前体(Altman等人2009,Lum等人2005a,Singh等人2009年). 在这里，我们表明自噬对于增加生长因子生成细胞中长链脂肪酸的线粒体氧化至关重要。当糖酵解被直接破坏时，这种自噬依赖性对细胞代谢的贡献是至关重要的，但在生长因子提取中似乎并不重要。这一发现与Lum等人的发现形成对比，Lum等人认为慢性生长因子剥夺的细胞缺乏凋亡依赖于自噬来支持基底细胞代谢(Lum等人2005a). 在凋亡活性细胞中，自噬很可能提供营养，但对缓解其他急性细胞应激至关重要。自噬也可以通过促进促凋亡蛋白Bim的诱导而促进细胞凋亡(Altman等人2009,Kiyono等人2009年). 在这些情况下，RNAi部分抑制了自噬，而不是Atg3缺失引起的更完全的阻断。自噬可能通过多种途径影响细胞应激和凋亡途径，因此，这部分取决于自噬流量的整体水平。

自噬可以降解受损的细胞器，如线粒体(Colell等人2007年)和内质网(Bernales等人2006年)缓解活性氧应激，降解蛋白质聚集体，防止DNA损伤(Mathew等人，2007年,Mathew等人，2009年,Pankiv等人2007年). 自噬破坏下游诱导了两条不同的应激途径，这可能有助于细胞自噬的需要。我们观察到明显的轻度内质网应激，其特征是适度诱导促凋亡转录因子Chop/GADD153。内质网可由自噬调节(Bernales等人2006年,Hoyer-Hansen和Jaattela，2007年)，并且Chop在促凋亡蛋白Bim和Puma的转录中是重要的(Altman等人2009,Ishihara等人2007,Puthalakath等人2007)也在自噬中断下游转录。之前我们已经使用RNAi证明，相对于自噬水平正常的细胞，部分抑制自噬会导致Chop诱导增加(Altman等人2009). 因此，自噬水平的部分变化可能对细胞结果产生不同的影响。另外，自噬缺陷的细胞类型特异性效应也可能对Chop产生不同的影响。

自噬丧失导致强大的应激反应，包括激活p53和积累双链DNA断裂标记γH2A。X（X）(Kurz和Lees-Miller 2004年). 自噬破坏后p53被强烈磷酸化并积累，我们观察到p53靶点的诱导，包括细胞周期抑制剂p21和促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma。而p53可以是自噬的上游(Crighton等人2006年,Feng等人2005,Wan等人2008)自噬破坏下游p53通路的诱导可能反映了自噬抑制细胞应激的新机制。事实上，p53在Atg3缺失后的细胞周期停滞和死亡中起关键作用。γH2A。X积累表明DNA受损，但在缺乏p21积累的情况下，生长因子退出时也会诱导该标记。因此，尚不清楚γH2A之间是否存在差异。X和磷酸化p53和p21的积累是由于低水平的DNA损伤或激活p53的替代细胞应激途径所致。在其他系统中，也有类似的细胞自噬抑制应激的研究结果，这可能是由于活性氧或蛋白质聚集体引起的(Mathew等人，2007年,Mathew等人，2009年). 虽然p53 RNAi对细胞周期和死亡的部分影响可能是由于残留的p53蛋白或通过替代途径造成的，但这些数据表明，当自噬被抑制时，p53对细胞命运有贡献。

人们对确定操纵自噬是否可以提供癌症治疗的替代方法产生了极大的兴趣。事实上，已经证明，抵抗凋亡的癌细胞需要自噬才能在营养压力下生存(Degenhardt等人2006,金与白2007,Karantza-Wadsworth等人，2007年)和透明蛋白聚集体(Mathew等人，2009年,Pankiv等人2007年). 重要的是，我们发现，虽然自噬可以作为营养物质的来源，但这似乎并不代表自噬在生长信号受到抑制的急性环境或BCR-Abl活性细胞中支持细胞存活的关键功能。相反，自噬的一个关键功能是减轻细胞应激和p53激活。自噬在p185 BCR-Abl表达细胞中以低水平组成性激活，在正常条件下和经激酶抑制剂伊马替尼治疗后都具有细胞保护作用。考虑到表达BCR-Abl的细胞对自噬的依赖，并且自噬可以被许多癌症治疗激活(Bellodi等人2009年,Carew等人2007年,Kamitsuji等人，2008年,Lomonaco等人2009年,Ren等人2010)，癌细胞可能对自噬有“非癌基因成瘾”，即使在营养充足的条件下也可能被利用(Luo等人2009). 与这一概念一致，自噬和溶酶体抑制剂氯喹在用其他化疗药物治疗后增强细胞死亡方面表现出了疗效(阿马拉瓦迪等人2007年,Kamitsuji等人，2008年,所罗门和李2009). 在未来的研究中，重要的是进一步研究和了解自噬如何影响表达致癌激酶的癌细胞中的细胞应激和p53通路，以便将自噬抑制与靶向治疗癌症有效结合。

方法和材料

A3C细胞的产生和培养

从Atg3中分离出小鼠造血祖细胞前/后Rosa26-Cre-ER或Ub-Cre-ER骨髓，带有祖细胞富集试剂盒（Stemcell Technologies，Vancouver，BC），并与产生Hox-11逆转录病毒的NIH-3T3细胞（由范德比尔特大学S.Zinkel慷慨提供）和细胞因子共同培养，如前所述(Zinkel等人2005). 回收非粘附细胞，并将其培养在Iscove's Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）中，其中含有10%FBS（Gemini Bioproducts，加利福尼亚州西萨克拉门托）、100 u/mL青霉素/链霉素（Invitrogen，芝加哥，IL）、2 mM L-谷氨酰胺（Invit罗gen）和0.5 ng/mL IL3（Ebioscience，加利福尼亚州圣地亚哥）。用4-羟基他莫昔芬（4OHT，0.5μM乙醇溶液；Sigma）处理得到的细胞群A3C细胞(Jacobs等人，2010年)删除Atg3。如前所述，培养来自Ub-Cre-ER小鼠的CrePos细胞(Zinkel等人2005). 如前所述培养FL5.12细胞(Altman等人2009).

Amnis多光谱成像流式细胞术

表达GFP-LC3的细胞用核染色DRAQ5（细胞信号）染色，固定在PBS中的2%PFA中，并在ImageStreamX上进行分析（Amnis Corporation，西雅图，华盛顿州）。按照制造商的指示，使用制造商的软件收集和分析GFP+、聚焦、单个非凋亡细胞的图像，并使用斑点计数功能（每个条件至少1300个细胞）。

细胞聚集和死亡分析

使用Coulter Z2粒子计数器（加利福尼亚州Brea的Beckman Coulter）评估细胞聚集。细胞死亡通过流式细胞术分析（FACScan，Becton Dickinson），使用碘化丙啶排除法（PI，1μg/ml，Invitrogen）和Flowjo软件（Treestar Inc.，Ashland，OR）进行分析。如前所述，对活性Bax和亚二倍体DNA进行分析(Altman等人2009).

BrdU与细胞周期分析

细胞在溴-2-脱氧尿苷（10μM BrdU，Sigma）中培养8小时，并用Alexa Fluor 488抗BrdU（Invitrogen）染色以纳入BrdU，用10μg/ml PI（Invit罗gen）进行流式细胞术细胞周期分析，如前所述(Darzynkiewicz和Juan 2001).

糖酵解和ATP测定

如前所述测量糖酵解速率(Vander Heiden等人2001). 使用ATP生物发光检测试剂盒CLS II（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）测量ATP。

质谱代谢分析

按照前面描述的方法制备样品，用于细胞内有机酸分析(Zhao等人2007)和酰基肉碱分析(Altman等人2009,An等人2004).

小鼠白血病检测

Fox Chase SCID米色小鼠（马萨诸塞州威尔明顿Charles River Laboratories）静脉注射106表达A3C NGF或BCR-Abl的细胞，并在细胞注射后腹膜内注射三苯氧胺或载体对照玉米油三天，或在细胞注射后两周连续注射三天。根据批准的方案，在明显中度疾病发作时处死小鼠。组织切片由杜克大学病理实验室制备和染色。

显微镜

组织学图像由蔡司Axio显微镜（卡尔蔡司）使用40倍蔡司平面Apochro物镜采集，并使用MetaMorph 7.5软件（Molecular Devices）进行分析。

补充材料

1

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2

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三

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致谢

这项工作得到了NIH R01 CA123350（J.C.R.）、白血病和淋巴瘤学会学者奖（J.C.R）、亚历克斯柠檬水站（J.C.R-）和加布里埃尔癌症研究天使基金会（J.C.R.）的支持。J.C.R.是美国哮喘基金会的伯纳德·奥舍研究员。E.F.M由美国国立卫生研究院F30 HL094044支持，R.D.M由癌症研究所欧文顿研究所博士后奖学金支持。

脚注

在线补充材料

在线补充材料包括补充图S1-S9、附图图例、关于A3C细胞转导和治疗、免疫印迹和小鼠研究的补充方法。

竞争性利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

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