癌症研究。作者手稿；PMC 2011年8月1日发布。
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c-Src和雄激素受体协同作用驱动的侵袭性前列腺癌
，2 ，1,2 ，1 ，三和1,2,4
蔡厚健
2加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院微生物学、免疫学和分子遗传学系，加利福尼亚州90095
伊万·巴比奇
1加利福尼亚大学洛杉矶分校霍华德·休斯医学研究所，加利福尼亚州洛杉矶90095
2加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院微生物学、免疫学和分子遗传学系，加利福尼亚州90095
肖伟
1加利福尼亚大学洛杉矶分校霍华德·休斯医学院，加利福尼亚州洛杉矶90095
黄娇缇
三加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院病理学和实验医学系，加利福尼亚州90095
欧文·威特
1加利福尼亚大学洛杉矶分校霍华德·休斯医学院，加利福尼亚州洛杉矶90095
2加利福尼亚大学洛杉矶分校David Geffen医学院微生物、免疫学和分子遗传学系，邮编90095
4Eli&Edythe再生医学和干细胞研究博德中心
1加利福尼亚大学洛杉矶分校霍华德·休斯医学院，加利福尼亚州洛杉矶90095
2加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院微生物学、免疫学和分子遗传学系，加利福尼亚州90095
三加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院病理学和实验医学系，加利福尼亚州90095
4Eli&Edythe再生医学和干细胞研究博德中心
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摘要
Cellular Src（c-Src）整合了大量调节细胞分裂、迁移和细胞生理其他方面的信号转导途径。尚未描述人类前列腺癌中Src激酶的突变，但有证据表明，随着癌症进展，其表达水平增加。我们分析了c-Src在幼年小鼠前列腺上皮中的过度表达，并观察到小管形成频率或组织结构没有变化。然而，当c-Src表达增强与雄激素受体（AR）表达增强相结合时，会导致Src激酶活性的强烈激活，伴随着MAPK通路的激活，AR活性增强。与组成活性c-Src（Y529F）诱导的病理学相似，肾小管进展为侵袭性弗兰克癌，并显示上皮细胞向间质细胞转化的标记物。这些综合结果表明，非突变的Src激酶在前列腺癌的发生和发展中可能比以前认识到的更为重要，增强AR水平的表观遗传改变可能选择c-Src表达增强，伴随活化和恶性进展的强大驱动力。
关键词：Src激酶，雄激素受体，侵袭性前列腺癌，前列腺癌
介绍
前列腺癌是美国男性癌症相关死亡的第二大原因。前列腺癌的病理阶段始于异常上皮增生和前列腺上皮内瘤变（PIN），然后发展为浸润性癌，最终发展为转移性疾病(1). 虽然早期局限性疾病通常是可以治愈的，但随着侵袭性和转移性疾病的进展，生存率下降到只有34%。在晚期患者中，经常会出现治疗上难以治愈的去势抵抗型前列腺癌（CRPC）(2).
前列腺癌的发生与PTEN缺失或突变导致AKT信号的激活以及染色体易位后红细胞转化特异性（ETS）家族转录因子的异常表达有关(三——5). 此外，雄激素受体（AR）、c-MYC、多梳组蛋白EZH2和抗凋亡蛋白Bcl-2的过度表达似乎对这一过程也很重要(6，7). 相反，导致侵袭性和转移性疾病进展的遗传和表观遗传改变却鲜为人知。在CRPC中已经发现AR的表达和激活状态的改变。超过80%的CRPC病例表现为AR高表达。这被认为增加了去势后AR对低水平雄激素或其他内源性类固醇的敏感性(8).
各种实验和人类癌症表明，Src可以通过突变或DNA扩增机制激活(9，10). Src激酶在多种人类癌症中过度表达和激活，包括转移性或激素难治性前列腺癌(10，11). 然而，由于Src激酶的激活突变在人类癌症中很少见(12，13)Src激酶的激活如何促进前列腺癌侵袭性癌的发生尚不清楚。
Src激酶调节几个上游分子信号成分，包括许多G蛋白偶联受体、整合素和受体酪氨酸激酶。Src激酶的激活通过激活下游信号通路（包括PI3K-Akt、RAS、整合素-FAK、MAPK和STAT3信号通路）促进前列腺肿瘤的发生(14，15). 因此，作为一种多效性激活剂，Src激酶调节许多对癌细胞生存、增殖、侵袭、迁移和血管生成至关重要的细胞信号通路(15，16).
除临床观察外，在CRPC中AR和Src的表达经常升高(10)一些研究进一步证明了Src激酶可以与AR信号通路相互作用。Guo等人（2006年）报告了酪氨酸磷酸化和通过Src激酶激活AR。使用LNCaP细胞系的细胞培养研究表明，Src激酶和AR之间的联系是通过活化的C激酶1（RACK1）支架蛋白受体介导的(17). 这种Src激酶-AR相互作用由AR拮抗剂DOC-2/DAB2蛋白调节(18).
我们之前已经建立了前列腺再生系统，在该系统中可以再生前列腺组织体内通过将分离的出生后前列腺上皮细胞与分离的胚胎泌尿生殖窦间质结合，并将这些细胞植入免疫缺陷小鼠的肾包膜下(19). 在这个系统中可以控制特定癌基因的表达，以监测细胞自主信号和外源信号对前列腺癌发生和发展的影响(19，20). 该系统允许对前列腺癌的发展进行时间顺序研究，其中前列腺组织可以根据定义的表面标记物的表达从定义的细胞群中再生(4，21).
我们发现，野生型Src激酶的过度表达并不会改变前列腺小管结构，而c-Src和AR的共同表达增强会导致浸润性前列腺癌伴上皮-间质转化（EMT）。这种结合导致Src酪氨酸激酶活性的强烈激活，伴随着MAPK通路的激活，并增强AR活性。这个体内组成性活性Src（Y529F）激酶向未分化腺癌和EMT的进展与野生型Src激酶和AR的共表达观察到的表型非常相似。为了评估浸润性癌的动态过程，我们使用四环素诱导系统与前列腺再生系统相协调，发现浸润性癌的发生与前列腺小管结构的动态变化有关，并与上皮和EMT标记物的变化有关。
材料和方法
质粒
将小鼠Src激酶的开放阅读框、其组成活性突变体Src（Y529F）和激酶死亡突变体Src（Y529 F/K298M）克隆到慢载体FUCRW中(22)RFP的表达具有组成活性，并由CMV启动子调控。Src（Y529F）也克隆到pTK380中(23)慢载体，命名为TRE-Src（Y529F），通过添加Dox调节Src的表达。
前列腺再生与前列腺上皮病毒感染
根据加利福尼亚大学洛杉矶分校慢病毒使用安全规定，对分离的前列腺细胞进行再生过程、慢病毒制备、滴度测定和感染(19). 住房、维护以及所有手术和实验程序均按照洛杉矶加利福尼亚大学实验动物医学部的规定进行。Dox诱导系统中的前列腺再生改编自以前的报告(19). 从6-10周龄R26-M2rtTA小鼠制备分离前列腺细胞悬浮液，该悬浮液表达一种优化形式的逆转录四环素控制反式激活因子（rtTA-M2）蛋白(24). 分离的细胞感染慢病毒TRE-Src（Y529F）。感染细胞（1–2×105)与泌尿生殖窦间充质细胞混合（1–2×105). 将移植物植入SCID小鼠的肾包膜下，使其再生4周。饮用水中含有0.2%的Dox和1%的蔗糖，每周更换一次，直到实验结束。
Src（WT）和AR共同表达的细胞分析
表征组成型活性Src和Src（WT）+AR表达后FAK/ERK途径的激活在体外293T细胞（购自ATCC）感染过表达AR、Src（WT）、Src（Y529F）的慢病毒，或同时感染过表达ER和Src的慢病毒。感染后两天，收集293T细胞，并使用添加了磷酸酶抑制剂鸡尾酒1和2（P5726和P2850，SIGMA）的RIPA缓冲液制备蛋白裂解物。通过Western blot分析AR、Src、pSrc，pFAK、pERK和ERK的表达（抗体列于补充表1).
免疫组织化学
用解剖显微镜拍摄透照或荧光图像。免疫组织化学（IHC）如前所述(19，21). 初级抗体和稀释度列于补充表1.
达沙替尼抑制活性Src激酶诱导的浸润性癌和EMT
将感染载体控制或活性Src（Y529F）慢病毒的前列腺细胞与UGSM混合并植入CB.17的肾包膜下SCID/SCID小鼠前列腺再生。植入后三天，SCID小鼠被随机分配接受达沙替尼或对照载体。对于p.o.给药，达沙替尼溶于含有5%二甲基亚砜的80mmol/L柠檬酸缓冲液（pH3.0）中。每隔24小时用20号规的灌胃针给药一次15mg/kg体重/天的浓度。对照组小鼠灌胃给予等量稀释液缓冲液。给小鼠治疗4周。
结果
野生型Src激酶过度表达与AR在前列腺肿瘤发生中的协同作用
Src激酶和AR是转移性或去势抵抗前列腺癌中两个常见的上调基因(8，10，11). 我们询问在原始前列腺上皮细胞中强制表达野生型Src激酶和AR是否可以促进侵袭性前列腺肿瘤的发生体内AR的细胞自主过度表达导致组织学上正常前列腺小管的形成()然而，如前所述，再生组织中的小管少于载体对照组（数据未显示）。来自Src（WT）过度表达的再生组织导致形成正常或轻度增生的小管(). 相反，感染Src（WT）+AR的再生组织显示出未分化的细胞片，无腺体结构。与未感染Src（WT）+AR基因的相邻分化良好的小管相比，这些结果清楚地表明，Src(). 肿瘤细胞呈深染细胞核、高核质比，生长为固体片状、索状、小巢状和单细胞，是低分化或未分化的高级别癌的特征(). Src（WT）+AR的表达与转化区域的组织分化状态相关。Src（WT）+AR的异位低表达对应于分化程度更高的病变，而Src的高水平+AR与分化程度低的病变相关，这些病变表现出较高的pSrcY416和pAR水平（Ser210/213）(图S1). 此外，致瘤细胞表达高水平的Src（WT）+AR，显示其广泛浸润邻近基质().
野生型Src激酶过度表达与AR在前列腺癌中的协同作用将分离的C57BL/6小鼠前列腺细胞感染带有Src激酶或AR表达的慢病毒或单独或联合感染。
A）再生前列腺组织的H&E染色（顶部面板，白色方框表示下部面板中的缩放区域）以及来自感染慢病毒的原代前列腺细胞的转化细胞的细胞和核结构（底部面板），以过度表达野生型Src激酶、AR或Src（WT）和AR。比例尺，100μm。
B–C）再生前列腺组织中AR、Src激酶、磷酸化Src（Y416）、磷酸化AR（Ser213/210）、细胞周期蛋白D1、磷酸酪氨酸（4G10）、上皮/间叶标记物E-cadherin（红色）/波形蛋白（绿色）和基底/管腔细胞标记物CK5（红色）/CK8（绿色）的IHC染色。插入物显示转化细胞中E-cadherin和vimentin的表达。一组细胞同时表达E-cadherin和vimentin。比例尺，100μm。
野生型Src激酶和AR的增强表达提高AR和Src酶的活性
观察到的Src（WT）和AR协同作用的一个可能机制可能是通过Src激酶和AR的交叉激活(17). 免疫组织化学证实Src（WT）+AR再生组织的致瘤区域表达升高的Src激酶和AR(;图S2). 而Src激酶在Src（WT）+AR肿瘤中的表达水平与Src（WT）组相似(;图S2)，过表达Src（WT）+AR的肿瘤细胞表现出活性Src激酶[通过与pSrc反应的抗体检测（Y416）]、活性AR[通过与p AR反应的抗体（Ser213/210）检测]、细胞周期蛋白D1和磷酸酪氨酸（通过4G10检测）水平升高(;图S2)表明野生型Src激酶与AR相互激活。
野生型Src激酶与AR的协同作用显示管腔样肿瘤细胞与相关EMT的扩张
为了确定肿瘤病变中存在的上皮亚群，对组织进行上皮标记物细胞角蛋白CK5和CK8染色。来自Src（WT）或AR组的再生小管呈现正常的CK8+管腔细胞和CK5+基底细胞双层，而来自Src+AR移植物的致瘤细胞仅显示CK8+细胞(). 我们进一步对E-钙粘蛋白和波形蛋白进行染色，观察到一些CK8+肿瘤细胞也同时表达E-钙黏蛋白和波状蛋白。相反，E-cadherin，1C）。总的来说，这些数据表明野生型Src激酶的过度表达与AR协同作用，导致Src蛋白激酶活化，导致浸润性前列腺癌和可能的EMT。
Src（Y529F/K298M）和AR的共表达可以促进转化
在前列腺再生试验中，创建了一个Src激酶死亡突变体[Src（Y529F/K298M）]的开放构象，并与AR共同感染。Src（Y529F/K298M）过度表达导致再生组织形成正常的小管。相反，来自Src（Y529F/K298M）+AR组的再生组织显示出分化良好的癌，显示CK5/CK8和E-cadherin的表达(). 免疫组织化学证实，总Src激酶在Src（Y529F/K298M）感染的肾小管和Src的致瘤区域（Y529 F/K288M）+AR移植物中的表达增加(). 与Src（WT）+AR相比，Src移植（Y529F/K298M）+AR的致瘤区域中未检测到磷酸化Src激酶和磷酸酪氨酸的表达(). 然而，磷酸化AR和AR下游靶基因cyclin D1在Src（Y529F/K298M）+AR组中增加()与Src激酶死亡突变体或单独表达AR相比，表明当两者共同过度表达时，Src蛋白激酶支架活性仍能促进AR活性和恶性进展，但程度低于野生型Src加AR。对单独表达或与AR协同表达的Src（K298M）进行了类似实验。在将正常上皮转化为PIN和高分化癌时，可以看到适度的协同作用，但比Src（Y529F/K298M）加AR组合的协同作用要小（数据未显示）。这些综合结果表明，一些生物活性来源于Src的支架功能，而更有效的作用需要活性激酶。
Src（Y529F/K298M）和AR的过度表达可促进AR活性A）再生前列腺组织的H&E染色（顶面，白色方块表示缩放区域），其细胞和核结构（底面）是由感染慢病毒的原代前列腺细胞转化而来的细胞，以过度表达Src激酶死亡突变体Src（Y529F/K298M）、AR或Src两者（Y529 F/K288M）和AR。比例尺，100μm。
B–C）再生前列腺组织中CK5（红色）/CK8（绿色）、E-cadherin（红色）/vimentin（绿色）AR、Src激酶、磷酸-AR（Ser213/210）、磷酸-Src（Y416）、cyclin-D1和磷酸酪氨酸的IHC染色。比例尺，100μm。
前列腺上皮细胞中组成性活性Src激酶的表达与野生型Src和AR的共表达表型相似
由于AR和c-Src之间的相互作用可能导致Src激酶信号的激活，我们询问组成性活性Src（Y529F）单独的现象是否复制了Src和AR在侵袭性腺癌和EMT发病中的协同作用。已知活性Src（Y529F）激酶的过度表达可诱导成纤维细胞的肉瘤转化(9). 因此，我们根据抗原谱Lin-CD49f+Sca-1+分离前列腺基底上皮细胞(图S3)之前有报道称其可以富集前列腺基底干细胞(21). mAKT感染的前列腺上皮细胞再生组织显示PIN病变，管腔细胞表达CK8，基底细胞表达CK5，这些上皮细胞也表达E-cadherin，但不表达波形蛋白(). 相比之下，与来源于Src（WT）+AR的肿瘤相似，来源于Srch（Y529F）感染上皮细胞的再生组织缺乏腺体结构，由具有局灶性肉瘤样区域的低分化癌细胞组成(). Src（Y529F）诱导的肿瘤的主要类型包括具有丰富嗜酸性细胞质的大肿瘤细胞和高度多形性的泡状核(). 来源于Src（Y529F）肿瘤的细胞显示CK8和波形蛋白，但不显示CK5和E-钙粘蛋白()，或CK18，但不是CK14（数据未显示）。为了检测Src（Y529F）诱导的肿瘤的侵袭性，我们进一步分析了移植物与宿主肾组织之间的连接。表达波形蛋白的CK8/CK18+肿瘤细胞存在于侵袭前沿的肾脏腺组织中，通过E-cadherin的高表达确定(). 这表明转化细胞表现出具有间充质分化的管腔上皮特征。总的来说，这些数据表明，与Src（WT）+AR类似，Srch（Y529F）能够从幼稚的小鼠前列腺上皮细胞诱导侵袭性肿瘤。
前列腺上皮细胞中活性Src（Y529F）的异位表达诱导EMT和侵袭性腺癌A）再生前列腺移植物来源于5×104感染mAKT（GFP标记）或Src（Y529F）（RFP标记）的基底上皮细胞（左侧面板，比例尺：2mm）。再生组织的H&E染色（中间面板，比例尺：100μm）以及来自感染mAKT和活性Src激酶的前列腺上皮细胞的转化细胞的细胞和核结构（右侧面板，比目尺：15μm）。
B）感染mAKT和活性Src激酶的前列腺上皮细胞再生组织中AKT或Src、CK5/CK8和E-cadherin/vimentin的IHC染色。虚线表示肾组织和再生组织之间的连接处。白色箭头标识侵入肾脏的侵袭前沿表达波形蛋白的Src（Y529F）转化细胞。红色箭头确定了由Src（Y529F）诱导的致瘤细胞包围的表达E-cadherin的肾细胞。比例尺：100μm
Src（WT）+AR或组成活性Src激酶的协同作用改变了特征明确的EMT标记的表达并增加了MMP9的表达
EMT是启动侵袭性肿瘤发生的重要步骤。在EMT期间，致瘤细胞获得转录因子的表达，如Twist、Snail以及细胞表面蛋白N-cadherin(25). 因此，除了E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达改变外(和)，我们进一步检测了这些特征良好的EMT标记物在活性Src（Y529F）和Src[WT]+AR诱导的癌中的表达。与正常再生小管和mAKT转化的肿瘤相比，活性Src（Y529F）诱导的肿瘤细胞核中Twist表达水平增加(). 此外，mAKT和活性Src（Y529F）诱导的肿瘤表达的蜗牛和N-钙粘蛋白水平增加(). Src（WT）+AR诱导的肿瘤表达的N-钙粘蛋白、蜗牛和少量Twist水平增加(). 这些数据进一步证明了Src（WT）+AR或活性Src体内.
EMT标记物和MMP9在Src（WT）+AR或活性Src诱导的肿瘤中的表达A）用IHC染色法对来自控制载体mAKT、Src（Y529F）或Src[WT]+AR的再生组织中的N-cadherin、Twist和Snail进行染色。比例尺：50μm
B）正常再生小管、mAKT+AR、Src（Y529F）或Src的再生组织中MMP9的IHC染色。比例尺：20μm
侵袭性癌症的一个主要特征是分泌基质金属蛋白酶，它可以降解细胞外基质并允许癌细胞迁移。因此，我们进一步检测了基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达作为浸润性腺癌的指示。在我们之前的研究（对照）中，MMP9在mAKT+AR肿瘤细胞的细胞质中表达极化，可能定位于内质网和高尔基复合体(). 与正常再生小管中MMP9的表达相比，来源于Src（WT）+AR的致瘤细胞显示细胞内MMP9水平增加，而Src肿瘤（Y529F）显示细胞内和细胞间染色，表明其具有降解细胞外基质的能力(). 总之，这些数据表明，Src（WT）+AR或活性Src的表达导致表型相似的浸润性癌和相关的EMT特征。
Src（WT）+AR或组成活性Src的协同作用导致MAPK信号通路激活
Src/FAK信号通路已被证明调节EMT(26). 我们通过检测MAPK信号通路中蛋白质的表达和激活，进一步研究了MAPK信号通路在来源于Src（WT）+AR或活性Src（Y529F）的组织中是否被激活。与正常再生小管和mAKT转化的肿瘤相比，来自Src（WT）+AR和活性Src的肿瘤表达的磷酸-FAK水平增加(). 与再生正常前列腺小管相比，Src（WT）+AR、活性Src().
Src（WT）+AR或活性Src（Y529F）诱导的侵袭性腺癌激活Src/FAK/ERK途径A）IHC染色法检测正常小管再生组织和mAKT、Src（Y529F）和Src+AR肿瘤中的磷酸-FAK和磷酸-Erk。比例尺，200μm。
B）293T细胞被AR、Src（WT）、Src（Y529F）或Src[WT]+AR过表达。通过Western分析检测Src、AR、phospho-Src[Y416]、phosphal-FAK、phosphen-Erk和Erk2（负荷控制）的表达。
为了进一步表征Src激酶和AR信号通路之间的功能性相互作用，我们在293T细胞中共表达Src（WT）和AR，并检测Src蛋白激酶和MAPK通路的激活(). 与单独表达Src（WT）或AR的细胞相比，过度表达Src+AR的细胞表现出pSrc416、pFAK和pErk的表达增强。然而，在Src（WT）+AR的环境中，这些信号级联的激活低于组成活性突变体Src的激活（Y529F）。这表明，增强Src（WT）和AR的共同表达可以激活MAPK通路，尽管其激活程度低于组成活性突变体Src的激活程度（Y529F）。
活性Src激酶的诱导调节揭示了侵袭性前列腺癌与EMT的进展阶段
侵袭性癌的进展与EMT特征以及前列腺腺结构的改变有关(27，28). 研究浸润性癌的动态进展体内，我们在前列腺再生模型中使用多西环素（Dox）调节活性Src（Y529F）的表达(图S4A). Dox调节的磷酸化Src表达在细胞培养中得到证实(图S4B和C). 在诱导Src（Y529F）表达之前，我们让正常前列腺再生进行4周。随后，在Dox诱导后6、8或10周收获移植物，或在10周不收获Dox(). 正如预期的那样，转化细胞表达AR，并且在Dox诱导的移植物中Src或磷酸化Src激酶水平升高().
原代前列腺细胞中活性Src（Y529F）的诱导表达揭示了EMT的进行期A）前列腺再生和强力霉素（Dox）诱导的实验时间框架。用TRE-Src（Y529F）感染原代前列腺细胞，并在SCID小鼠肾包膜下孵育4周，然后用Dox（0.2%）诱导。在第6周、第8周或第10周，从接受或不接受Dox治疗的小鼠中获取再生移植物。MOI=10。
B）在第4周和第10周，对感染TRE-Src（Y529F）的原代前列腺细胞再生组织进行H&E染色，无需Dox治疗。在没有Dox诱导的情况下，TRE-Src（Y529F）感染组织含有正常的小管。比例尺，100μm。
C–D）Dox治疗后第6周、第8周和第10周，感染TRE-Src（Y529F）的初级前列腺细胞再生组织中Src激酶和pSrc蛋白（Y416）、CK5/CK8、E-钙粘蛋白/波形蛋白和AR的H&E和IHC染色。箭头表示在第6周接受Dox治疗的组中，再生组织中含有低分化肿瘤，具有局灶性腺体分化（管状结构）。C）和D）中的比例尺分别为100μm和50μm。插图显示E-cadherin在细胞质膜上的表达。比例尺：25μm。
对照组中，TRE-Src（Y529F）感染的小管（RFP+）组织学正常，小管结构扩张，由两层细胞组成(). 相反，具有Src时间诱导的再生组织从具有局灶性腺分化（管状形成）的低分化癌发展到没有明显的腺分化，以及具有梭形细胞形态的局灶性区域的肉瘤样转化(). 当Dox停药后活性Src（Y529F）的表达被阻断时，浸润性前列腺癌发生逆转(图S5).
有趣的是，+Dox治疗组再生组织的肿瘤细胞在分析的任何时间点都没有表达基础标记CK5(). 相反，管腔标记物CK8在6周组和8周组再生组织的肿瘤细胞中表达，而10周组没有表达(). 活性Src激酶的诱导表达触发了EMT的进展，如细胞膜上E-钙粘蛋白表达的丧失和细胞质中波形蛋白表达的增加所证明的(). 总的来说，这些数据表明，Src激酶的过度表达和激活会导致正常小管进展为前列腺上皮内瘤变，然后发展为带有上皮-间质转化标记物的侵袭性弗兰克癌体内.
达沙替尼抑制活性Src激酶诱导的浸润性癌和EMT
Dasatinib是一种靶向Src家族激酶和几种受体激酶的小分子酪氨酸激酶抑制剂，对去势抵抗晚期前列腺癌患者的骨转移具有良好的抑制作用(29，30). 我们研究了达沙替尼是否能够抑制由Src激酶激活引起的侵袭性癌和EMT。Src（Y529F）组移植物的模拟治疗[Src(). 我们的数据表明，达沙替尼有效抑制活性Src激酶诱导的浸润性癌和EMT体内(图S6和S7).
达沙替尼抑制活性Src激酶诱导的浸润性癌再生前列腺移植物（A）和组织的重量（B）来源于感染慢病毒携带控制载体或Src（Y529F）的原代前列腺细胞，经模拟或达沙替尼治疗。
讨论
推动侵袭性腺癌进展所需的基因改变序列和分子信号转导途径体内基本未知(1). 研究表明，从高级别PIN到局部浸润性腺癌的有效进展至少需要两个基因事件(31，32). 我们之前已经证明AR的过度表达与ERG（ETS家族转录因子）的高水平或mAKT的升高共同促进低分化腺癌的发展(4，22). 我们的研究表明，通过AR和Src激酶的共同表达增加激活Src蛋白激酶途径可以诱导未分化浸润性腺癌体内在没有激活突变的情况下。我们证明c-Src/AR的共同表达增强体内表型类似于组成活性Src（Y529F）激酶的过表达。我们的数据表明，AR表达增加和Src家族激酶激活的临床观察可能与前列腺浸润癌的进展有关(10，15，33).
AR反应通路的激活可能有助于观察到Src/AR联合表达的协同效应。我们的Src/AR共表达实验表明，AR上丝氨酸磷酸化水平升高，这与AR反应性转录的核移位和激活有关(34). 虽然在我们的模型中没有直接评估，但Guo等人（2006）报告称，Src激酶可以调节AR的酪氨酸磷酸化。这表明Src蛋白激酶可以通过酪氨酸磷酸化直接调节AR活性，也可以通过丝氨酸/苏氨酸激酶途径的激活间接调节AR活性(35). 此外，我们的结果表明，Src激酶可能通过其作为支架蛋白的功能部分促进AR活性输入。高水平的Src激酶死亡突变体可增强FAK催化活性(36)减少src−/−动物模型中的骨质疏松(37). 此外，AR含有富含脯氨酸的结构域，可能是Src激酶SH3结构域的潜在结合位点。
我们证明，组成活性Src（Y529F）和Src/AR的协同共表达均呈现EMT特征和MAPK通路的强烈激活。这些观察结果表明，EMT的进展与前列腺腺体结构的改变、侵袭性增加和癌症分级升高有关(27). MAPK信号通路的激活为Src活性驱动的EMT提供了潜在机制。Src/FAK/ERK通路的诱导促进E-钙粘蛋白的内吞作用，从而调节细胞粘附能力(38). 活化Ras/MAPK通路也被证明可以调节蜗牛和鼻涕虫转录因子的表达，而这些转录因子又反过来调节E-cadherin的转录(39).
由于对目前可用的治疗方法有强烈的抵抗力，CRPC的进展在很大程度上是致命的(2). CRPC亚群病例中激活的Src激酶水平增加(10)，结合我们支持功能相关性的证据，表明抑制Src激酶可以在CRPC治疗中提供有用的治疗方法。Dasatinib是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，最近被证明能有效靶向Src家族激酶和其他几种受体酪氨酸激酶(29，40). 在一项对晚期实体瘤患者的临床研究中，据报道，单用达沙替尼治疗是可以接受的，并且耐受性良好，有一些初步的疗效证据(41). 此外，对联合使用达沙替尼和多西紫杉醇治疗的CRPC患者进行的I期和II期研究表明，现有骨损伤的大小和/或数量减少(42，43). 我们的研究表明，达沙替尼抑制由组成活性Src激酶表达诱导的浸润性癌和EMT。然而，Src激酶死亡突变体和AR的共表达仍然可以促进AR激活并导致高分化癌。这些数据表明，AR活性的增加可能部分独立于Src激酶活性。
各小组正在研究AR拮抗剂作为靶向CRPC的一种手段。目前正在评估转移性CRPC患者中使用基因组表达分析筛查高AR活性的转录特征。这可用于确定使用非甾体抗雄激素药物尼鲁他胺进行AR靶向治疗的候选CRPC患者(44). 这个体内本研究中提出的c-Src和AR的协同作用以及不依赖Src激酶活性的AR激活，以及临床试验和常见实践中独立靶向Src蛋白激酶和AR通路的治疗价值，提示同时靶向这两条途径是前列腺癌潜在的有效治疗方法。
最后，Mendiratta等人（2009年）报告了局部前列腺癌和转移性CRPC样本中异质AR和Src活性。该研究确定了即使在局限性前列腺癌中也表现出高Src和AR活性的患者子集(45). 这些患者亚群的特征可以为选择前列腺癌早期患者进行治疗提供一种方法。
致谢
我们感谢李欣、德文·劳森、丹尼尔·史密斯、程东辉、杨宗、安德鲁·戈尔茨坦、贾斯汀·德雷克和丽塔·U·卢卡奇的技术帮助和科学讨论。这项工作得到了美国陆军医学研究与材料司令部（U.S.Army Medical Research and Material Command）向H.C.提供的W81XWH-08-1-0329拨款以及前列腺癌基金会挑战奖（O.N.W and J.H.）的支持。J.H还得到了美国癌症协会拨款RSG-07-092-01-TBE和国防部前列腺癌研究计划拨款PC061456的支持。O.N.W.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
工具书类
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