增殖性巨噬细胞与高级别激素受体阴性乳腺癌和不良临床结局相关

摘要

介绍

巨噬细胞来源于骨髓中的造血祖细胞，这些祖细胞进入血液循环并成为血液单核细胞。单核细胞迁移到组织中进行最终分化，伴随着增殖能力的丧失，进入常驻巨噬细胞。巨噬细胞具有组织重塑、炎症和免疫所必需的多种功能，包括吞噬作用、细胞毒性和大量细胞因子、生长因子、溶菌酶、蛋白酶、互补成分、凝血因子和前列腺素的分泌[1]。

慢性炎症与各种癌症的发生和发展有关[2]. 白细胞聚集到慢性炎症部位会引起微环境的变化，包括产生活性氧和氮物种，以及细胞因子和生长因子的富集，这些可能会促进癌前细胞和恶性细胞的增殖[三]. 在大多数恶性肿瘤中，巨噬细胞是宿主白细胞浸润的主要成分。这些肿瘤相关巨噬细胞（TAM）已被证明与包括乳腺癌在内的多种癌症的不良预后相关[4–11]。

虽然TAM主要来源于肿瘤块中招募的外周血单核细胞，但也有证据表明TAM存在局部增殖。增殖的巨噬细胞，称为promacs公司从多种小鼠肿瘤中分离出[12–14]. 在人类淋巴瘤中，宣传片通过增殖细胞核抗原（PCNA）的表达来定义[15]. PCNA也在与肾小球肾炎相关的巨噬细胞中表达[16]、动脉粥样硬化[17]和艾滋病相关痴呆[18]。

在本研究中，我们调查了宣传片在人类乳腺癌中。我们在加州大学旧金山分校（UCSF）进行了初步研究，并使用完全独立的患者组和芝加哥大学（U of C）的独立实验室进行了验证研究。我们试图关联浸润的存在宣传片具有肿瘤大小、分级、激素状态、淋巴结转移和亚型等临床病理特征。我们还想确定宣传片与早期复发和生存相关。

材料和方法

免疫组织化学

加州大学旧金山分校

使用标准链霉亲和素-生物素过氧化物酶法（详见补充表1). 将5μm切片在二甲苯中脱蜡，并使用分级乙醇进行再水化。使用微波加热的10 mM柠檬酸缓冲液进行抗原提取10 min。使用双内源性酶块（Dako#3006）进行CD68/PCNA双重染色10 min，并与抗CD68小鼠单克隆抗体（Dako#M0876，1:50稀释）孵育30 min，然后用抗PCNA小鼠单克隆抗体（Dako#M0879，1:500稀释）第二次孵育过夜。对于抗CD68，使用DAB plus（Dako#K1395）作为基底，对于抗PCNA，使用BCIP/NPT基底（Dako#K0598）。在室温下，用周期性酸性希夫试剂（美国Master Tech Scientific#KTPAS）对载玻片进行10分钟的复染。两位病理学家在不了解临床结果或以往免疫染色结果的情况下独立评估了免疫染色。以低倍（20倍）扫描载玻片，以确定阳性染色的三个“热点”。然后在三个高功率场（HPF）（100×）中计数阳性染色细胞（棕色CD8+细胞，蓝色细胞核PCNA染色），并计算平均数。代表性路段染色宣传片1级、2级和3级肿瘤如图所示图1.

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图1

免疫组织化学染色promacs公司在乳腺癌组织中。切片用抗CD68（巨噬细胞标记物；DAB）和抗PCNA（增殖标记物；BCIP/NPT）双重染色(一，b条、和c（c）)或费朗吉蓝(d日)). 增殖巨噬细胞(宣传片)显示棕色的细胞质和蓝色核染色（参见箭头在面板中一，b条、和c（c）). 增殖巨噬细胞的定量如文中所述。一UCSF案例，1级；b条UCSF案例，2级；c（c）UCSF案例，3级；d日U of C案例

C的U

TMA石蜡标本被切割成4μm的切片，并安装在带正电荷的载玻片上。将载玻片脱蜡并在二甲苯中再水化，然后使用分级醇，然后在Tris缓冲盐水中清洗。使用DAKO免疫染色剂进行免疫组织化学分析，抗体和抗原揭开，详见补充表1将载玻片在0.03%过氧化氢中培养5分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，然后在蛋白封闭溶液（蛋白封闭无血清溶液，DAKO公司）中培养20分钟，以减少非特异性背景。采用Envision+试剂（DAKO）作为检测系统。然后用3–3′-二氨基联苯胺显色剂处理载玻片5分钟，用苏木精复染，并盖玻片。省略一级抗体步骤，制备适当的免疫染色阴性对照。免疫染色结果由两名观察者根据IHC反应的强度和百分比，使用Reiner的四分量表进行半定量评分[20]. 根据制造商说明（DAKO）评估EGFR和HER2染色。对于promacs公司用抗CD68抗体（DAKO，M0814）和抗PCNA抗体（DAKO，M00879）进行双重染色。使用Ferangi Blue Chromogen Kit（Biocare Medical，FB812S）检测抗-PCNA，未进行反染色(图1).

与以前的出版物一致[21]乳腺癌亚型定义为管腔A（ER+和/或PR+，HER2−）、管腔B（ER+或PR+、HER2+）、基底样（ER−、PR−、HER2−、CK5/6+，和/或EGFR+）、HER2+/ER−（HER2+，ER−，PR）和未分类（所有五个标记物均为阴性）。

统计分析

最初，两位病理学家独立统计了宣传片在每个肿瘤样本中。对独立计数进行平均并用于进一步分析。R程序最大stat用于为宣传片作为复发的预测因素。我们发现，在加州大学旧金山分校的队列中宣传片每HPF是最佳切入点，可很好地分离时间-重现曲线(图2). 然后，我们检查了宣传片使用t检验或Wilcoxon秩和检验对连续或序数变量（如年龄、肿瘤大小、分级、分期等）和Fisher精确检验对分类变量（如ER）进行临床病理变量检验。

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图2

重复发生时间依据promac公司人类乳腺癌中的水平。发现队列中≥5名患者宣传片/与<5岁的患者相比，HPF复发较早宣传片/高性能过滤器(第页=0.0199，对数秩检验）

使用Kaplan–Meier方法评估复发时间、总生存率和无复发生存率，并比较高复发率和高复发率之间的差异宣传片和低宣传片采用广义Wilcoxon检验进行生存功能相等性检验。Wilcoxon检验对早期事件（死亡或复发）的权重大于晚期事件，因此对早期差异很敏感。Cox比例风险模型用于估计风险比和95%置信区间（CI）。检查是否宣传片是一个独立的预后因素，我们在多变量Cox模型中调整了诊断时的年龄、ER状态、组织学分级和肿瘤分期。对每个研究队列进行单独分析，然后进行汇总分析，其中对研究指标变量进行了调整。

结果

促性腺激素与临床特征

在我们对发现队列的初步分析中，我们使用复发时间作为终点来评估promac公司这些数字与早期复发有关。病例被分为高或低宣传片在不同的切点（数量宣传片每HPF）以找到最佳值。如所示图2，将病例分为<5和≥5宣传片每HPF产生了一个最优且显著的(P（P）=0.0199）基于复发时间的病例分离。高血糖患者promac公司计数较低者复发较早。Promac公司计数被分为低（<5宣传片每个HPF）或高（≥5宣传片根据HPF），以便更好地进行临床解释。

如所示表1，高水平宣传片在这两个队列中，与大约提前6年发病的乳腺癌相关（汇总分析：P（P）=0.003）。高宣传片在两组中，与组织学分级也呈正相关(图3a)以及在集合队列中（集合分析：P（P）< 0.0001). 此外，在这两个队列中，激素受体阴性肿瘤与高promac公司计数(图3b和c). 激素受体状态与宣传片在合并队列中也很重要(P（P）雌激素受体<0.0001；P（P）孕酮受体=0.002）。淋巴结受累、肿瘤大小、AJCC分期和HER2状态与宣传片在任何一个队列中。在验证队列中，我们还评估了与增殖巨噬细胞相关的乳腺癌亚型（由IHC确定），发现宣传片在基底样和HER2+/ER−肿瘤中过度表达。

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图3

Promac公司人类乳腺癌分级和激素受体状态的相关性。一 促销品与年级呈正相关；b条增加宣传片ER阴性肿瘤；c（c）增加promacs公司PR阴性肿瘤

促销活动和临床结果

在两个队列中平均随访约9年后，发现队列中的28名乳腺癌患者和验证队列中的52名患者死亡。有19名幸存者患有复发性疾病。如所示图4，高复发率患者的无复发生存率较低宣传片在两个队列中。未经调整的危险比高与低宣传片在两个队列中非常相似，尽管两者都不显著(表2). 无复发生存率和宣传片具有统计学意义(P（P）= 0.034). 调整年龄、雌激素受体状态、等级、阶段和研究队列后promac公司该水平与45%的复发/死亡风险增加相关，尽管该相关性在统计学上不显著。同样，高宣传片与两组患者的总体生存率较差相关(图4c、d). 在单变量分析中，两个队列之间的关联强度相似，尽管只是略微显著，并且在合并样本中达到了统计显著水平(P（P）= 0.015). 调整年龄、雌激素受体状态、等级、阶段和研究队列后宣传片与死亡风险增加75%有关(P（P）= 0.048).

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图4

Promac公司人类乳腺癌中的水平与早期复发和死亡有关。患者被分为两组：肿瘤含量<5宣传片/HPF和肿瘤≥5宣传片/高性能过滤器。一和b条Kaplan–Meier分析分别显示发现队列和验证队列的无复发生存率。c（c）和d日Kaplan–Meier分析分别显示了发现队列和验证队列的总体生存率

表2

UCSF和U of C队列的临床结果和增殖巨噬细胞

终点	UCSF队列			加州大学队列			合并的队列一
	Promacs低（<5）	Promacs高（≥5）	P（P）价值	Promacs低（<5）	Promacs高（≥5）	P（P）价值	Promacs低（<5）	Promacs高（≥5）	P（P）价值
无复发生存率
事件/患者	22/61	第20页，共48页		19/41	38/62		41/102	58/110
5年概率	73%	51%	0.091	59%	43%	0.054	68%	46%	0.004
未调整人力资源（95%CI）	1.0（参考）	1.56 (0.85–2.88)	0.15	1.0（参考）	1.59 (0.91–2.76)	0.10	1.0（参考）	1.56 (1.03–2.34)	0.034
调整后人力资源（95%CI）b条	1.0（参考）	1.60 (0.76–3.34)	0.21	1.0（参考）	1.31 (0.68–2.54)	0.42	1.0（参考）	1.45 (0.89–2.34)	0.14
总体生存率
死亡/患者	13/61	15/48		17/41	第35页，共62页		41/101	58/110
5年概率	84%	73%	0.18	72%	46%	0.021	79%	57%	0.002
未调整人力资源（95%CI）	1.0（参考）	1.87 (0.88–3.95)	0.10	1.0（参考）	1.71 (0.96–3.06)	0.07	1.0（参考）	1.77 (1.12–2.57)	0.015
调整后的人力资源（95%置信区间）b条	1.0（参考）	2.84 (0.99–8.13)	0.052	1.0（参考）	1.48 (0.73–2.97)	0.28	1.0（参考）	1.75 (1.00–3.04)	0.048

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^一多变量Cox模型中队列指标变量的额外调整

^b条在多变量Cox模型中调整年龄、雌激素受体状态、组织学分级和肿瘤分期

加州大学旧金山分校加州大学旧金山分校（发现队列），C的U芝加哥大学（验证队列），宣传片增殖的巨噬细胞以每个高倍视野的数量计算，小时危险比，CI公司置信区间

讨论

在本研究中，我们检测了CD68+/PCNA+增殖巨噬细胞的作用(宣传片)在乳腺癌中。这些实验是在两个独立的机构和实验室（加州大学旧金山分校和加州大学）使用两组独立的乳腺癌患者进行的。我们发现渗入的数量增加宣传片在这两个队列中与高级别激素受体阴性肿瘤显著相关。两者之间没有相关性promacs公司肿瘤大小、分期或受累淋巴结的数量。从C大学的研究来看，组织核心具有非常高的宣传片在基础亚型和HER2+/ER−亚型中有不成比例的表达。

使用UCSF队列作为发现集，我们发现在五个切点处宣传片根据HPF，高与低患者的进展时间存在显著差异promac公司渗透。使用这两个队列中的切入点，在较高数量的宣传片无复发生存率低。我们还观察到了宣传片两组患者的总体生存率均较低，即使在校正了年龄、雌激素受体状态、组织学分级和肿瘤分期后，这在合并队列分析中也非常显著。

实体肿瘤中浸润着白细胞（主要是淋巴细胞和巨噬细胞），这些细胞与癌细胞之间的相互作用可能对肿瘤的进展产生深远影响。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的存在是肿瘤相关炎症的标志之一。TAM产生多种细胞因子和趋化因子，以及上皮细胞和内皮细胞的生长因子，在肿瘤生长和转移中发挥重要作用[2，22]。

TAM已被确定为淋巴瘤和乳腺癌患者临床预后的主要阴性预后指标[5–7，10，11]. 此外，CD68+巨噬细胞已被证明与高级别导管原位癌（DCIS）乳腺癌和相关的粉刺坏死密切相关。特别是，DCIS病灶的大小和密度增加，MRI增强表现为团块状，与CD68+巨噬细胞数量增多相关[23]。

正常情况下，来自循环血单核细胞的组织巨噬细胞失去其增殖能力。然而，在一些癌症中观察到TAM的局部增殖。从小鼠乳腺肿瘤、黑色素瘤和肺癌中分离出增殖的TAM[13，14]以及甲基胆蒽诱导的C57BL/6 J小鼠肉瘤[12]. 人类淋巴瘤相关巨噬细胞表达增殖相关标记物PCNA[15]. PCNA也在与其他疾病相关的巨噬细胞中表达[16–18]。

早期复发是生存率低的预兆。三重阴性癌症和HER2+/激素受体阴性癌症的一个特征是复发风险在前5年（ASCO海报Esserman等人，2010年，提交的手稿）。促销品最常见于这些肿瘤类型；因此，巨噬细胞高度增殖的肿瘤早期复发的风险更高也就不足为奇了。

我们已经证明PCNA+巨噬细胞的存在(宣传片)并检测其与各种临床参数的相关性。这些发现在两个独立机构得到证实，表明宣传片可以作为不良结果的预后指标。也许更重要的是，这些细胞可能成为新型治疗干预的潜在细胞靶点。由于其在肿瘤进展中的多方面作用，巨噬细胞提供了多种治疗靶点，包括抑制其在肿瘤部位的募集、激活和/或存活，逆转其极化/免疫抑制活性，以及抑制其血管生成和基质重塑活性。

补充材料

致谢

脚注

参与者信息

迈克尔·J·坎贝尔，美国旧金山加利福尼亚大学外科。

Nathan Y.Tonlaar，美国芝加哥大学普里茨克医学院。

伊丽莎白·R·加伍德，美国旧金山加利福尼亚大学外科。

霍德政，美国芝加哥大学健康研究系。

丹·H·摩尔，美国旧金山加利福尼亚大学流行病学和生物统计系。

安德烈·赫拉姆佐夫（Andrey I.Khramtsov），美国芝加哥大学医学系。

Afred Au公司，美国旧金山加利福尼亚大学病理学系。

弗雷德里克·贝纳，美国旧金山加利福尼亚大学病理学系。

陈英华，美国芝加哥大学医学系。

David O.Malaka，美国芝加哥大学医学系。

艾米·林，美国旧金山加利福尼亚大学外科。

Oyinlolu O.Adeyanju，美国芝加哥大学医学系。

李世宏，美国芝加哥大学病理学系。

残功，美国芝加哥大学病理学系。

迈克尔·麦格拉思，美国加利福尼亚大学旧金山总医院检验医学系。

Olufunmilayo I.奥洛帕德，美国芝加哥芝加哥大学医学系。

劳拉·埃瑟曼，美国旧金山加利福尼亚大学外科。卡罗尔·F·巴克乳房护理中心，美国加利福尼亚州旧金山市迪维萨德罗街1600号，1710号信箱，邮编94115。

参考文献