结果
在缺乏非必需氨基酸补充的情况下，纤维肉瘤和大肠腺癌细胞的生存和增殖需要ATF4表达
为了研究ATF4在肿瘤细胞增殖和生存中的作用，将表达ATF4特异性shRNA（pSM2-shATF4）或非靶向shRNA（p LKO-shNT）的质粒转染到HT1080（人类纤维肉瘤）或DLD1（人类大肠腺癌）细胞中。与相应的shNT克隆相比，两个已建立的HT1080 shATF4克隆（shATF4.cl3和shATF4.cl4）和一个DLD1 shATF4mRNA水平降低了60-70%(补充图S1A). 由于非应激细胞中的基础ATF4蛋白水平较低，我们用ER应激诱导剂thapsigargin处理细胞以上调ATF4。与mRNA水平一致，HT1080和DLD1 shATF4克隆在用thapsigargin治疗后均未表现出ATF4诱导().
敲除ATF4抑制肿瘤细胞存活和增殖。(A类)thapsigargin处理细胞（Tg，1μM，4 h）或DMSO处理细胞核部分的ATF4蛋白水平。Lamin A/C用作加载控制。(B类)电镀后48 h，通过MTT分析测定在NEAA（100μM）存在或不存在的情况下培养的HT1080和DLD1细胞的存活率（数据表示平均值±标准偏差。，n个=3,*P（P）<0.05). 细胞存活率归一化为对照组（shNT细胞无NEAA）。(C类)细胞增殖试验。HT1080细胞在含有/不含NEAA的DMEM中培养24小时（左面板）。细胞核（Hoechst，蓝色）和增殖细胞（EdU，红色）的荧光染色。（右面板）随机选择三张照片，并计算EdU阳性和总细胞核数。增殖指数百分比是通过增殖细胞核数除以细胞核总数来计算的。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05).
据早些时候报道，ATF4−/−MEF需要NEAA和抗氧化剂（如β-巯基乙醇（β-ME））的存在才能存活(Harding等人，2003年) (补充图S2). 类似于SV40-永生ATF4−/−MEFs，表达ATF4 shRNA的肿瘤细胞显示，在缺乏NEAA的情况下，生存率显著降低(). 长期生长试验表明shATF4克隆在细胞存活和增殖率方面存在缺陷(补充图S1B). 相反，在25μM至0.2 mM浓度下添加β-ME不会影响ATF4敲除细胞的细胞存活（数据未显示）。短暂击倒ATF4也会降低细胞存活率，这表明这种效应不是由于选择期间的克隆效应(补充图S1C).
细胞存活率降低可能是由于细胞增殖减少和/或细胞死亡增加所致。通过分析指数生长细胞中荧光EdU掺入的水平，我们发现HT1080.shATF4细胞与shNT细胞相比，细胞增殖减少了35%(). DLD1细胞也有类似的发现(补充图S3A). 向培养基中添加NEAA可使两种敲除细胞系的细胞增殖完全恢复(补充图S3A). 细胞周期分析也显示shATF4细胞的G1与shNT细胞相比的群体(补充图S3B)，表明ATF4击倒导致G1/肿瘤细胞中的S阻滞。添加NEAA部分逆转了G1逮捕。这些数据表明，ATF4缺乏会导致氨基酸饥饿，从而导致G1/S细胞周期阻滞和增殖减少。
敲除转化细胞中ATF4诱导细胞凋亡
当ATF4敲除细胞在不含NEAA的条件下培养时，观察到细胞凋亡的形态学特征，如膜泡和细胞收缩。NEAA的加入降低了这些凋亡表型(). shATF4细胞也有较高水平的分裂PARP，这是一种凋亡标记物，在NEAA存在时也同样减少(). 为了进一步分析未经NEAA培养的shATF4细胞的凋亡水平，我们测量了caspase3/7活性。与shNT细胞相比，shATF4细胞的基础caspase3/7活性增加了13倍以上；同样，补充NEAA显著降低caspase活性().
敲除ATF4可诱导肿瘤细胞凋亡。(A类)HT1080 shNT和shATF4细胞在含有或不含NEAA的DMEM中生长24小时的相控图像。所示图像在×400倍放大下拍摄。(B类)HT1080 shNT和shATF4细胞中PARP裂解的免疫印迹。β-肌动蛋白作为负荷对照。HT1080细胞在含有/不含NEAA的DMEM中培养24小时(C类)Caspase3/7活性归一化为细胞总数。HT1080细胞在含有/不含NEAA的DMEM中培养24小时(D类)感染对照组（Av-Cre）或表达腺病毒的小鼠ATF4（Av-mATF4）的HT1080 shNT和shATF4细胞的相控图像显示为放大×400倍。感染后，细胞在不含NEAA的DMEM中培养。感染后24小时拍摄图像。(E类)使用MTT分析在感染细胞中的相对细胞存活率。在感染后24小时，将相同数量的细胞接种在不含NEAA的DMEM中。48小时后进行MTT分析。感染后24小时收集相同条件下感染的细胞进行ATF4免疫印迹（底部）。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05).
为了排除shATF4细胞缺陷是由于shRNA的非靶向效应或选择诱导突变所致的可能性，我们使用腺病毒载体过度表达了shRNA未靶向人类ATF4的全长小鼠ATF4。mATF4的过度表达显著提高了shATF4细胞的存活率并阻断了其凋亡表型(). 这些发现进一步支持ATF4在这些肿瘤细胞中的促生存功能。
敲除ATF4诱导促生存自噬反应
自噬是一种溶酶体依赖的细胞内降解过程，由某些应激激活，主要是营养饥饿。由于shATF4细胞依赖NEAA生存，我们假设在没有NEAA的情况下，自噬可能会在HT1080.shATF5细胞中诱导，作为最初的促生存反应。这一假设得到了以下事实的支持：在缺乏NEAA的情况下，shATF4细胞与shNT细胞相比具有更小的大小，并且观察到细胞质液泡（自噬体形成的迹象）（数据未显示）。与shNT细胞相比，shATF4细胞自噬标记物微管相关蛋白轻链（LC）3-II水平升高()，通过添加NEAA降低到基础水平，表明由于NEAA缺乏，shATF4细胞中诱导了自噬。
敲除ATF4可诱导肿瘤细胞的保护性自噬。(A类)自噬标记物的免疫印迹从HT1080 shNT和shATF4细胞的全细胞裂解液中切割LC3，在DMEM中与NEAA孵育24小时。β-肌动蛋白用作负荷对照。(B类)电子显微镜成像。箭头指向含有双层膜的自噬体。将HT1080细胞在含有/不含有NEAA的DMEM中孵育24小时(C类)顶部：用pCMV-GFP-LC3转染HT1080 shNT和shATF4细胞，并在DMEM中培养。48小时后，细胞在成像前用Hoechst染色。底部：细胞自噬（点状）形态定量。将自噬细胞百分数归一化为GFP信号细胞总数后计算。数据表示平均值（±s.e.m。，n个=3). (D类)用100 nM的非靶向siRNA（siNT）或靶向Atg7（siAtg7）的siRNA转染HT1080细胞。转染24小时后通过免疫印迹法分析Atg7、LC3和切割的PARP水平。α-管蛋白被用作负荷控制。(E类)用100 nM非靶向siRNA（siNT）或靶向ATG7（siATG7）的siRNA转染HT1080细胞。72 h后，用MTT法检测HT1080和DLD1细胞的存活率。实验一式三份。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05).
在电子显微镜下，HT1080.shNT细胞表现出典型的成纤维细胞形态，内质网和线粒体完整，而shATF4细胞较小，呈圆形，含有双膜自噬体，进一步证实了shATF5细胞中广泛的自噬诱导(，箭头指向自噬体）。与LC3处理类似，添加NEAA可逆转自噬表型。在HT1080细胞中表达GFP-LC3也证实了自噬的诱导作用。在shNT细胞中，GFP信号均匀分布在细胞质中。然而，在shATF4细胞中，信号集中在绿点或环形结构中，表明自噬体的形成(). 为了测试shATF4细胞中诱导的自噬是否是细胞保护性应激反应，使用靶向Atg7（自噬体成熟所需的E1样泛素结合酶）的siRNA来抑制自噬。当Atg7水平降低并阻断自噬时，与shNT细胞相比，shATF4细胞的凋亡增加(). 这些结果表明，HT1080细胞中ATF4缺失诱导的自噬促进了生存。ATF4的丢失和自噬的抑制共同导致细胞死亡的协同增强。
在ASNS的转染或表达中添加Asn，挽救shATF4细胞的存活
上述实验中使用的NEAA混合物由七种氨基酸组成：Ala、Asp、Asn、Glu、Gly、Pro和Ser。将每个氨基酸添加到DMEM中的最终浓度为100μM。常规DMEM含有400μM Gly和Ser，但不含其他五种氨基酸(补充表S1). 为了确定哪些氨基酸负责调节NEAA的促生存作用，将单个氨基酸以100μM的最终浓度添加到培养的shATF4细胞的DMEM中。结果表明，Asn，而不是任何其他单独的氨基酸，可以拯救shATF4细胞的存活(). 在一项长期致克隆生存试验中观察到Asn更显著的促生存作用().
补充Asn或ASNS过度表达可挽救shATF4细胞的存活。(A类)在DMEM中生长的HT1080（左）或DLD1（右）细胞存活48小时，补充100μM浓度的指定氨基酸(B类)HT1080 shNT/shATF4细胞的克隆存活率。左图：代表性实验图片。右：HT1080 shNT/shATF4细胞的克隆存活率。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=4,*P（P）<0.05.) (C类)使用实时RT-PCR测量HT1080 shNT/shATF4细胞中ASNS mRNA水平。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05.) (D类)转染HT1080细胞中ASNS的表达和细胞存活。（左面板）顶部带代表HA-标记的ASNS，下部带代表内源性ASNS。（右面板）HT1080 shNT和shATF4细胞在指定治疗后的存活率。24小时后，收集转染细胞进行免疫印迹或进行MTT试验（48小时）。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05).
据报道，ASNS基因通过与启动子结合直接受ATF4调控(Siu等人，2002年;Gjymishka等人，2009年). 事实上，我们还发现，与shNT细胞相比，shATF4细胞中ASNS的表达减少了70%以上(). 此外，在HT1080.shATF4细胞中添加Asn可以挽救NEAA缺失诱导的G1逮捕(补充图S3B)，这一发现与ASNS缺乏可诱导G1逮捕(Greco等人，1987年;Gong和Basilico，1990年). 此外，ASNS在shATF4细胞中的过度表达部分挽救了细胞存活()添加Asn抑制shATF4细胞的凋亡和自噬（图6A）。这一结果表明，ASNS是维持细胞内天冬酰胺水平的重要酶，天冬酰胺对肿瘤细胞存活和细胞周期进展至关重要。
氨基酸谷氨酰胺（Gln）不仅是核苷酸和蛋白质合成的底物，是合成Asn的前体，也是肿瘤细胞的重要能量来源(Reitzer等人，1979年;DeBerardinis等人，2007年). 为了生产Asn，ASNS将氨基从Gln转移到Asp(). 由于ASNS需要Gln来合成Asn，我们想测试shATF4细胞是否比shNT细胞对Gln剥夺更敏感。为了验证这一点，shNT和shATF4细胞在含有/不含4mM谷氨酰胺的DMEM中培养。MTT分析显示，shATF4细胞在缺乏Gln的情况下存活率下降约50%，而shNT细胞在48小时培养后仅下降25%(). 有趣的是，在Gln缺乏的细胞中加入Asn（100μM终浓度）可以部分挽救细胞存活()这表明产生Asn也可能是Gln的一个重要功能，至少在这个肿瘤细胞系中是如此。总之，ATF4缺乏严重抑制肿瘤细胞存活在体外这主要是由于缺乏Asn。
敲除ATF4增加了对谷氨酰胺缺乏的敏感性。(A类)ASNS催化的生物合成反应。(B类)在DMEM中生长的HT1080（左面板）或DLD1（右面板）细胞存活率（有/无4mM）L（左）-谷氨酰胺48小时(C类)HT1080细胞在含有/不含Gln或Asn的DMEM中存活48小时。Gln:4 mM，Asn:100μM。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05).
GCN2-eIF2的激活α氨基酸剥夺途径促进细胞存活、上调p21（cip1/waf1）并激活自噬
我们假设，如果shATF4细胞缺乏NEAA的生物合成，这将导致上游激酶GCN2的激活，从而完成自我调节反馈回路。事实上，我们发现GCN2在HT1080.shATF4细胞中被磷酸化，并且添加Asn或NEAA抑制了这种磷酸化()这表明敲除ATF4会减少ASNS的表达，导致Asn缺乏，从而激活GCN2。eIF2α是GCN2的底物，在shATF4细胞中也被磷酸化以响应NEAA，与GCN2类似，其磷酸化被反式添加Asn或NEAA抑制。CDK抑制剂p21和p27在G1/应激引起的S细胞周期阻滞，据报道，氨基酸剥夺可以诱导S细胞周期的阻滞(Leung-Pineda等人，2004年). shATF4细胞组成性表达高水平的p21，通过添加NEAA或Asn可显著降低p21水平；然而，p27水平未受影响(). 这与早期的报告一致，即ATF4-null原代小鼠骨髓基质细胞增加了p21的表达，但没有增加p27的表达(Zhang等人，2008年). p21的诱导可能是G1/shATF4细胞中的S细胞周期阻滞。
氨基酸剥夺下GCN2-eIF2α通路的激活促进细胞存活，上调ATF4和p21，并激活自噬。(A类)将HT1080 shNT和shATF4细胞在所指示的培养基中孵育24小时。收获全细胞裂解物，用所指示的抗体进行免疫印迹（IB）或免疫沉淀（IP）。(B类)通用条款2+/+和GCN2−/−MEF与/不与4mM Gln孵育24 h，并进行免疫印迹。(C类)eIF2αwt或eIF2 a S51A突变MEF与/不与4 mM Gln孵育24 h，并用指示的抗体进行免疫印迹。p-eIF2a和ASNS印迹下方的数字表明，标准化为α-微管蛋白水平的折叠变化。使用NIH Image共享软件图像分析程序的Scion Image版本进行分析。(D类)通用条款2+/+和GCN2−/−MEF与Met或Gln孵育48小时。使用MTT分析细胞存活率。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05.) (E类)野生型，GCN2−/−和eIF2αS51A突变MEF在不含4 mM Gln的情况下培养1 h或3 h，细胞裂解物进行免疫印迹。(F类)稳定转染shNT或shGCN2质粒的HT1080细胞在不含Gln的情况下培养1或3 h，细胞裂解物用指示的抗体进行免疫印迹。
由于GCN2是诱导ATF4翻译上调的氨基酸剥夺的分子传感器，我们测试了当从培养基中去除单个氨基酸时，GCN2激活是否促进肿瘤细胞存活。SV40不朽，Ras-transformed GCN2+/+和GCN2−/−在含有或不含有Gln的DMEM中培养MEFs。Gln剥夺下，GCN2+/+细胞显示eIF2α磷酸化增强，ATF4、ASNS和p21上调，而GCN2−/−细胞未能激活这一途径，并增加了裂解caspase3的水平(). 这些结果表明，氨基酸饥饿下p21的诱导依赖于GCN2的激活。
由于eIF2α是目前已知的GCN2的唯一底物，我们想进一步研究ATF4和p21的诱导是否依赖于eIF2 a磷酸化。为了测试这一点，在含有或不含Gln的DMEM中培养eIF2α野生型或eIF2 aS51A突变MEF（Ser-Ala突变阻断eIF2 a磷酸化）。与GCN2类似−/−在缺乏Gln的情况下，eIF2αS51A突变细胞不能诱导ATF4、ASNS或p21，但凋亡水平增加().
完整的DMEM（即+Gln，+Met），GCN2−/−培养48小时后，与野生型细胞相比，细胞存活率降低了25%，而Met或Gln剥夺进一步降低了GCN2的细胞存活率−/−细胞分别约为50%或4%(). 总之，GCN2-eIF2α-ATF4通路的激活对于肿瘤细胞在氨基酸饥饿条件下的生存是必要的。
早先有报道称GCN2激活和eIF2α磷酸化诱导酵母自噬(Talloczy等人，2002年). 我们还观察到HT1080.shATF4细胞中GCN2活化与LC3裂解之间的相关性()这表明GCN2可能是感知氨基酸短缺并诱导哺乳动物细胞自噬的分子开关。为了测试这一点，野生型GCN2−/−和eIF2αS51A突变MEF在无Gln培养基中培养。通用条款2−/−与野生型细胞相比，细胞对Gln饥饿的反应具有显著更低的LC3处理。eIF2αS51A突变细胞根本不能诱导LC3处理(). 为了证实GCN2在人类肿瘤细胞自噬诱导中的作用，将稳定转染shNT或shGCN2质粒的HT1080细胞在无Gln培养基中培养。通过印迹法分析自噬标记p62/SQSTM1，这是一种在自噬过程中迅速降解的长寿命蛋白质(Klonsky等人，2008年). p62在缺乏Gln的shNT细胞中降解，但在shGCN2细胞中稳定(). 总之，在转化细胞中，氨基酸饥饿激活的自噬需要功能性GCN2-eIF2α途径。
磷酸化eIF2的活化α-葡萄糖剥夺下ATF4通路依赖GCN2
在肿瘤细胞系中观察到葡萄糖剥夺诱导ATF4-ASNS通路(Siu等人，2002年;Cui等人，2007年). ATF4翻译上调的上游事件eIF2α磷酸化也可由葡萄糖饥饿诱导(Gomez等人，2004年)，有人认为这可能与PERK有关(Gomez等人，2008年). 在没有PERK的酵母中，eIF2α磷酸化依赖于葡萄糖饥饿下的GCN2(Yang等人，2000年). 考虑到氨基酸的碳骨架可以进入糖酵解或柠檬酸循环产生ATP，并且GCN2被不带电的tRNA激活，我们假设肿瘤细胞在葡萄糖缺乏的情况下可能使用氨基酸作为替代能源。氨基酸库的减少应导致GCN2活化、eIF2α磷酸化和ATF4诱导，以增加氨基酸合成/摄取。
为了验证这一点，HT1080细胞在含有或不含25 mM葡萄糖的DMEM中培养16小时。葡萄糖剥夺后检测到GCN2磷酸化，并与eIF2α磷酸化相关(). 此外，向培养基中添加过量的谷氨酰胺可以有效抑制葡萄糖剥夺下eIF2α的磷酸化()，强烈表明葡萄糖剥夺诱导的eIF2α磷酸化是由于一种或多种氨基酸浓度降低所致。为了更直接地测试这一点，我们使用液相色谱-耦合质谱（LC-MS）测量了细胞内氨基酸水平。对总蛋白归一化后五种氨基酸（Asn、Ser、Gln、Leu和Ala）水平的分析表明，葡萄糖剥夺后2 h，Ser和Ala水平分别显著降低37和50%(). 此时，其他氨基酸的水平没有受到显著影响。在葡萄糖剥夺4h后（当eIF2α磷酸化增加时），Ser和Ala的水平恢复到接近对照水平，而Asn和Gln的水平与充满葡萄糖的DMEM中的对照细胞相比增加，反映恢复途径的激活（例如诱导自噬，增加从介质中摄取氨基酸或两者兼而有之）。该发现进一步支持了这一观点，即在葡萄糖缺乏的情况下，HT1080细胞消耗Gln的速度比在充满葡萄糖的培养基下快得多(补充图S4E).
葡萄糖剥夺激活GCN2-eIF2α-ATF4通路。(A类)将HT1080细胞与25 mM葡萄糖孵育16 h。收集全细胞裂解物（WL）进行免疫印迹（IB）或免疫沉淀（IP）。(B类)将HT1080细胞在无葡萄糖的DMEM中培养16小时，添加指示浓度的谷氨酰胺，并对裂解产物进行免疫印迹。(C类)细胞被剥夺葡萄糖2和4小时，并通过LC-MS分析单个氨基酸的水平(D类)野生型，GCN2−/−和PERK−/−MEF在无葡萄糖DMEM中孵育8小时，收集细胞进行免疫印迹。谷氨酰胺剥夺治疗持续4小时(E类)将HT1080细胞与25 mM葡萄糖孵育8 h，提取总RNA用于ATF4靶点ASNS（左）或SLC1A4（右）的实时PCR。(F类)HT1080细胞在有/无25 mM葡萄糖的情况下培养，2×104细胞/孔。shATF4细胞补充1×NEAA。24小时后，用MTT法测定细胞存活率，并将存活率归一化为高糖组的存活率。
为了测试eIF2α磷酸化对葡萄糖剥夺的反应是否依赖于GCN2或PERK、野生型GCN2−/−和PERK−/−MEF缺乏葡萄糖。与野生型细胞不同，GCN2−/−和PERK−/−MEFs显著降低了葡萄糖剥夺时eIF2α磷酸化和ATF4诱导()表明GCN2和PERK都有助于eIF2α磷酸化和ATF4对葡萄糖剥夺的上调。这两种激酶可能在葡萄糖饥饿时被不同的应激信号激活。据报道，PERK和GCN2都有助于内质网应激诱导的细胞周期阻滞，这表明两种激酶之间可能存在串扰(Hamanaka等人，2005年).
为了研究GCN2在营养剥夺条件下对肿瘤细胞的作用，我们制备了GCN2敲除细胞（HT1080.shGCN2）。实时PCR和免疫印迹均证实GCN2表达降低(补充图S4A和B). 与shNT细胞不同，Gln剥夺不能在shGCN2细胞中诱导ASNS表达(补充图S4C). 在shNT细胞中，ATF4、ASNS、SLC1A4和SLC7A5（两种氨基酸转运蛋白）的三个下游靶基因的mRNA水平因葡萄糖剥夺而显著增加，但在shGCN2或shATF4细胞中没有显著增加(;补充图S4D). 由于多个ATF4靶基因参与氨基酸运输和合成，GCN2可能感测到葡萄糖剥夺下氨基酸水平的降低，并磷酸化eIF2α以减少整体翻译，但同时上调ATF4以提供氨基酸。我们假设，如果这是真的，那么GCN2-ATF4通路的激活应该可以保护葡萄糖缺乏的细胞。事实上，敲低GCN2或ATF4会使肿瘤细胞对低血糖敏感()表明GCN2-ATF4通路的完整性是葡萄糖剥夺条件下细胞生存所必需的。
GCN2-ATF4通路参与体内肿瘤生长
ATF4缺乏导致细胞存活率显著降低在体外提示ATF4可能在肿瘤生长中起作用。为了验证这一点，在裸鼠两侧注射等量的HT1080 shNT或shATF4细胞，并在3-4周内监测肿瘤生长。shNT细胞生长迅速，形成大肿瘤。然而，与shNT细胞相比，shATF4细胞形成的肿瘤更少，明显更小(). 细胞增殖的免疫荧光分析体内使用Ki67抗原作为标记，表明与在体外数据显示，shATF4肿瘤中的细胞增殖率显著降低(). 也符合在体外数据显示，在shATF4细胞中ASNS的过度表达导致了肿瘤生长的部分但显著的挽救(). 同样，Ras-transformed MEF中GCN2的缺失或HT1080细胞中的GCN2被击倒，阻碍了肿瘤生长(). 这些发现表明，异种移植瘤生长需要一个功能正常的GCN2-ATF4通路。
抑制GCN2-ATF4通路阻止肿瘤生长体内. (A类)左侧面板：裸鼠HT1080 shNT/shATF4细胞移植瘤，每侧注射2×106细胞。肿瘤生长了3周。右侧面板：实验结束时的平均肿瘤重量(N个=10,*P（P）<0.05，单尾学生t吨-测试）。(B类)左图：肿瘤切片中Ki67（红色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）复染。肿瘤以200倍放大率拍摄。右侧面板：Ki67信号的量化。(C类)HT1080 shNT、shATF4和shATF4+ASNS肿瘤异种移植物的生长。Nu/Nu小鼠每侧注射2×106HT1080电池(N个=8). 注射后4天，每隔2–3天测量肿瘤体积。误差条表示s.e.值。*P（P）<0.05，学生的双尾t吨-测试。(D类)K-RasV12-转化GCN2的生长+/+和GCN2−/−MEF公司体内Nu/Nu小鼠每侧注射2.5×106MEF公司。肿瘤生长了9天。实验结束时，切除肿瘤，拍照（左）并称重（右）。(N个=4,*P（P）<0.05，单尾学生t吨-测试）。(E类)HT1080 shNT和shGCN2肿瘤异种移植物的生长。Nu/Nu小鼠每侧注射2×106shNT公司(N个=7）或shGCN2电池(N个=10). 注射6天后，每隔2-3天测量肿瘤体积。
为了研究GCN2-eIF2α途径在原发性肿瘤中是否被激活，将具有相应正常组织对照的人类肝、乳腺和肺肿瘤的临床样本均质化，并对裂解物进行免疫印迹。与正常组织相比，四分之三的肝肿瘤以及乳腺癌和肺肿瘤样本表现出GCN2过度表达和磷酸化eIF2α水平升高(). 在自发性小鼠肿瘤中也得到了类似的结果。对肿瘤和乳腺癌基因MMTV-Neu小鼠相应正常乳腺组织中该途径的成分进行了分析。与正常组织相比，所有小鼠乳腺肿瘤均表现出显著的GCN2过度表达，eIF2α磷酸化水平增加，ATF4上调().
GCN2/p-eIF2α途径在人类和小鼠自发肿瘤中被激活。(A类)人类肿瘤组织（T）和相应正常组织（N）样本中GCN2和p-eIF2α的免疫印迹。Ku80被用作装载控制。(B类)乳腺癌病毒MMTV-Neu小鼠株正常（N）和肿瘤（T）样本中GCN2、p-eIF2α和ATF4的免疫印迹。β-肌动蛋白免疫印迹用作负荷对照。(C类)NIH TARP联合体中人类正常组织和肿瘤组织中p-GCN2和总GCN2的表达。仅使用二级抗体染色作为阴性对照。图像在40倍放大下拍摄。(D类)人结直肠癌肝转移连续切片中P-GCN2、P-eIF2α、总GCN2和总eIF2β的表达。p-eIF2α染色的特异性通过抗体孵育前用λ磷酸酶（λ-PPase）处理的样品中的信号降低来证明。
尽管我们做了大量的努力，但即使在GCN2免疫沉淀后，我们也无法通过免疫印迹法检测组织匀浆中的磷酸化GCN2，这可能是因为在组织匀浆或免疫沉淀过程中磷酸化组的丢失。因此，我们使用石蜡包埋的人类肿瘤组织阵列对总的和磷酸化的GCN2水平进行免疫组织化学染色。结肠癌和乳腺癌组织显示出强烈的总GCN2和磷酸化GCN2染色。肺癌组织中总的和磷酸化的GCN2染色较少但实质性；相反，正常组织很少或没有显示总或磷酸化的GCN2染色(). 有趣的是，肿瘤切片中的磷酸化-GCN2染色不均匀，表明局部微环境因素可能影响其磷酸化。进一步分析结直肠癌肝转移患者连续切片中磷酸化-GCN2、磷酸化-eIF2α和相应总蛋白，发现GCN2和eIF2α磷酸化信号存在大量重叠(;补充图S6). 有趣的是，我们还发现，与正常周围基质相比，肿瘤细胞中的总eIF2α水平明显更高。磷酸化eIF2α的信号较弱，存在于总eIF2β信号较强的细胞亚群中。总之，与正常组织相比，肿瘤中GCN2-eIF2α-ATF4信号模块的上调意味着肿瘤中必须存在GCN2激活的肿瘤特异性需求，以适应缺乏营养的微环境。
讨论
GCN2-eIF2α-ATF4信号模块被描述为真核生物（从酵母到哺乳动物）中蛋白质合成和氨基酸代谢的重要调节器，以响应氨基酸缺失。然而，在生理和应激条件下，清除该途径的成分对转化细胞存活和增殖的影响在体外和体内尚未充分描述。已经证明，快速增殖的转化细胞能够增加其对超过生物能量需求的营养吸收，并将代谢程序转向支持大分子生物合成的途径，以支持其快速生长(DeBerardinis等人，2008年). 我们的研究支持一种模型，在该模型中，由于氨基酸/能量需求和生物合成途径功能之间的失衡，ATF4或GCN2的抑制导致肿瘤细胞和异种移植物的次优生长和存活，并确定Asn是该调控机制的关键组成部分。
ATF4在转化细胞适应营养应激中的作用
我们和其他人已经证明ATF4在一些人类肿瘤组织中过度表达，并且在缺氧/缺氧应激下上调(Ameri等人，2004年;Bi等人，2005年). 此外，ATF4表达的失调与放化疗耐药的诱导有关：ATF4 mRNA水平与肿瘤细胞对DNA相互作用药物（如顺铂）的耐药相关(Levenson等人，2000年)最近的研究表明，昼夜节律调节蛋白Clock与ATF4启动子中的E-box结合，转录上调ATF4以响应顺铂，顺铂诱导参与谷胱甘肽代谢的酶，并有助于抗药性(Igarashi等人，2007年). 总之，这些发现表明ATF4在细胞对化疗药物的耐药性和基因毒性应激中具有重要作用，可能是通过上调促进还原化合物生成的靶基因。
我们的研究表明，在没有任何应激的情况下抑制ATF4会使肿瘤细胞对NEAA剥夺敏感，这一结果与早期在MEF中进行的研究一致(Harding等人，2003年). 与ATF4形成对比−/−需要β-ME的MEF，表达ATF4 shRNA的肿瘤细胞不需要这种抗氧化剂生存。这种差异可能是由于至少两种可能的机制：（1）肿瘤细胞中残留的低水平ATF4仍然满足细胞对抗氧化活性的需求；（2） 肿瘤细胞要么过度表达抗氧化酶，要么对氧化应激更具耐受性。然而，在没有NEAA的情况下，ATF4敲除肿瘤细胞的存活率确实降低，这表明这些细胞无法合成某些对生存和增殖至关重要的氨基酸，从而导致细胞周期阻滞、凋亡和自噬。
ATF4缺失与自噬诱导
自噬是一种细胞消化自身蛋白质和细胞器的机制，被认为能够使癌细胞在营养缺乏的情况下存活，并在肿瘤进展中具有多种功能。在这项研究中，我们发现有证据表明ATF4的丢失导致较低的凋亡阈值；然而，自相矛盾的是，似乎也会刺激自噬。然而，这一结果可以从能量平衡机制的角度进行解释：最初，ATF4（以及氨基酸生物合成和转运能力的很大一部分）的丧失导致营养剥夺和自噬反应的启动。这一观点得到了形态学和分子证据的支持，这些证据表明，在缺乏NEAA的情况下，HT1080.shATF4细胞中形成了双膜吞噬的细胞质液泡，自噬标记物切割的LC3水平升高。当敲除细胞补充NEAA时，这些效应很容易逆转，这表明氨基酸缺失是自噬的关键激活剂。然而，尽管激活了这种促生存机制，HT1080.shATF4细胞无法合成氨基酸（更具体地说是Asn），最终导致凋亡途径的激活，导致细胞死亡和克隆存活的丧失。
抑制Atg7（一种负责过氧化物酶体和液泡膜融合的酶）可阻止自噬的诱导并导致shATF4细胞凋亡增加，这进一步支持了初始自噬反应的促生存功能。据报道，在硼替佐米治疗后，ATF4通过上调LC3B水平促进自噬，从而对硼替佐米布诱导的细胞凋亡提供保护(Milani等人，2009年). 在这项工作中，我们已经表明ATF4缺陷导致LC3处理水平更高。因此，虽然由于蛋白酶体抑制导致ATF4上调可以积极影响自噬，但缺乏ATF4也可以通过涉及Asn耗竭和GCN2激活的独特机制间接促进自噬。
天冬氨酸是ATF4依赖性氨基酸稳态的关键效应物
对单个氨基酸对shATF4肿瘤细胞的影响的分析表明，补充Asn而不补充其他单个氨基酸足以挽救细胞存活，这一发现后来被我们对ASNS的研究所证实。ATF4的已知下游靶点包括参与氨基酸运输和代谢的蛋白质，包括ASNS。ASNS催化L（左）-天冬氨酸L（左）-天冬酰胺，一种NEAA，对蛋白质合成和细胞生长是必需的(理查兹和舒斯特，1998年). HT1080细胞和其他几种人类肿瘤细胞系一样，生长在富含Gln（4mM）的DMEM中。谷氨酰胺缺乏会显著降低HT1080和DLD1 shATF4细胞的存活率，如果添加Asn，可以部分挽救这些细胞，这表明肿瘤细胞对谷氨酰胺（一种重要的能量和氮源）的高需求(Sauer等人，1982年;DeBerardinis等人，2007年)，可能（至少部分）由于Asn的生物合成。根据我们未发表的微阵列数据，ATF4上调了谷氨酰胺酶（一种催化谷氨酰胺脱酰胺（谷氨酰胺分解代谢中的第一个反应）的表达，表明ATF4也可能促进肿瘤细胞利用谷氨酰胺。
有趣的是，L（左）-天冬酰胺酶是一种催化Asn生物降解的酶，是治疗儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）和各种类型急性髓细胞白血病的常用化疗药物(Cooney and Handschumacher，1970年;Ertel等人，1979年;Richards和Kilberg，2006年). 为了弥补外源性Asn的缺乏L（左）-天冬酰胺酶处理的细胞、白血病细胞和基质细胞上调ASNS的合成和活性，这可能有助于L（左）-肿瘤细胞对天冬酰胺酶的耐药性(Hutson等人，1997年;Aslanian等人，2001年). 此外L（左）-在卵巢癌细胞株中观察到天冬酰胺酶活性和ASNS表达(Lorenzi等人，2008年).
然而，还需要进一步研究Asn在肿瘤细胞生存和肿瘤生长中的确切功能：尚不清楚Asn是否只是蛋白质合成的底物，或者它在肿瘤细胞代谢和增殖中是否具有其他尚未确定的功能。ASNS表达拯救（至少部分）ATF4水平降低的细胞存活和生长的能力，以及L（左）-天冬酰胺酶在ALL中的作用，强调了该途径在维持氨基酸稳态中的重要性。我们的研究也支持需要进一步筛选可能受L（左）-天冬酰胺酶治疗和平衡给药L（左）-天冬酰胺酶具有潜在的耐药性发展。
GCN2形成自动调节回路以补偿ATF4缺陷
GCN2是一种蛋白激酶，由氨基酸剥夺下发生的未带电tRNAs激活，通过增加ATF4 mRNA的翻译，触发蛋白质合成的抑制以及氨基酸生物合成/转运的上调。GCN2及其底物eIF2α在shATF4细胞中都显示出磷酸化增加，当细胞被Asn或NEAA处理时，其减少。谷氨酰胺缺乏时，GCN2+/+细胞表现出eIF2α磷酸化增加，ATF4、ASNS和p21诱导增加；相反，GCN2−/−细胞不能激活这一途径，并发生凋亡。此外，在氨基酸剥夺条件下ATF4和p21的诱导依赖于eIF2α的磷酸化，这表明p21可能是由磷酸化的eIF2α翻译诱导的。在基因毒性应激下，p21的诱导通过阻止细胞周期进展和为修复受损DNA提供足够的时间来帮助细胞存活(McDonald等人，1996年). 尽管尚待正式证明，在氨基酸饥饿下诱导p21也可能具有类似的细胞保护功能，通过抑制增殖，从而促进蛋白质合成所需能量的保存。
我们的发现是，低糖下eIF2α磷酸化和ATF4诱导是GCN2依赖性的，也表明GCN2是一个分子开关，它感知肿瘤微环境中的营养剥夺，从而下调蛋白质合成（eIF2β磷酸化），减缓细胞周期进展（p21诱导）增加氨基酸摄取（ATF4诱导）。这些反应可以帮助肿瘤细胞保存能量并维持氨基酸代谢的稳态。
氨基酸剥夺下GCN2-eIF2α途径的另一个促生存功能可能是诱导自噬。与早期在酵母中进行的研究一致(Talloczy等人，2002年)eIF2α的磷酸化是MEF中诱导自噬所必需的，尽管需要进一步的研究来确定其机制。GCN2中的LC3II水平−/−细胞比野生型细胞低，但比eIF2α突变细胞高。这可能是由于来自其他eIF2α激酶（PERK、PKR等）的串扰。
GCN2和ATF4在肿瘤进展中的作用
其中几个在体外总结了调查结果体内通过比较ATF4或GCN2敲除细胞与WT对应细胞中的肿瘤生长。shATF4细胞形成的肿瘤较少，与快速形成的大shNT肿瘤相比，肿瘤明显较小，生长较慢。根据Ki67染色分析，shATF4肿瘤的增殖率降低。同样，Ras转化的GCN2敲除MEFs不能形成大肿瘤体内我们早些时候表明，PERK或eIF2α磷酸化缺陷会导致对缺氧应激的抵抗力降低在体外和体内(Koumenis等人，2002年;Bi等人，2005年). 虽然GCN2也可能有助于耐缺氧体内，GCN2−/−MEF对缺氧的敏感性与WT-MEF相同在体外; 此外，GCN2−/−MEF仍然磷酸化eIF2α并在缺氧条件下诱导ATF4(补充图S5). 另一方面，PERK−/−在Gln剥夺下，MEFs仍然磷酸化eIF2α并诱导ATF4(). 因此，我们建议在肿瘤微环境中，GCN2和PERK协同提供对不同形式压力的抵抗力(). 我们的发现进一步表明，肿瘤中常见的另一种应激，即低血糖，需要PERK和GCN2激活eIF2α磷酸化；因此，缺氧、葡萄糖和氨基酸缺乏似乎都激活了这一途径，尽管这些途径是不同的，有时是重叠的(). 这条通路的每个组成部分对抵抗应激和肿瘤生长的精确功能和贡献需要用特定标记物进一步分析每条通路的激活情况以及与每条应激的相关性体内。作为进行此分析的第一步，我们已经证明肿瘤中ASNS的过度表达导致了肿瘤生长的部分挽救(). 这些结果表明，ASNS的表达至少部分负责ATF4敲除细胞的生长缺陷。
GCN2、ATF4、ASNS和Asn在保护肿瘤细胞免受微环境应激中的功能模型。蓝色箭头表示主要是对营养剥夺应激的反应信号，绿色箭头表示主要来自缺氧应激的信号。常见路径用黑色箭头表示。ATF4可能对缺氧具有此处未描述的其他功能。
缺乏对表型的完全修复可能是由于Gln的次优存在，Gln是Asn合成的前体和ASNS底物，贯穿肿瘤生长或ATF4对其他过程的贡献，如血管生成。事实上，血管生成缺陷也归因于PERK的次优生长−/−我们小组之前发现的肿瘤，以及最近另一项关于小鼠胰岛素瘤的研究提出的肿瘤(Gupta等人，2009年).
ATF4和GCN2缺乏细胞中肿瘤生长较慢，反映了肿瘤细胞在营养缺乏情况下对GCN2-eIF2α-ATF4通路完整性的依赖性；这种对肿瘤细胞生长的依赖性使得GCN2-eIF2α-ATF4途径成为有效癌症治疗的生物靶点。通用条款2−/−除非喂食缺乏某些必需氨基酸（如亮氨酸）的食物，否则小鼠不会出现明显的形态或功能异常(Anthony等人，2004年). 作为ATF4−/−小鼠表现出异常，如小细胞血症和贫血（主要归因于ATF4的抗氧化功能），GCN2可能比ATF4提供更好的治疗靶点。我们预计，与肿瘤组织相比，具有充足营养供应的正常组织不会受到特定GCN2抑制剂的影响，而肿瘤组织将处于营养剥夺状态（因为血液流量不足和代谢需求增加），因此更依赖功能性GCN2维持生存和增殖。
材料和方法
细胞培养和稳定细胞克隆的产生
HT1080和DLD1细胞在补充有青霉素、链霉素和10%胎牛血清的DMEM（4.5 g/l葡萄糖，4 mM Gln）中培养。为了建立稳定的ATF4敲除细胞系，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）用pLKO-shNT或pSM2-shATF4质粒（OpenBiosystems）转染HT1080和DLD1细胞，并用嘌呤霉素（2μg/ml，减少到0.5μg/ml用于维持）进行筛选。转染后，所有细胞均补充NEAA和55μMβ-ME。以同样的方式产生稳定的GCN2敲除细胞系。所有MEF均在与HT1080.shATF4细胞相同的条件下培养。将单个氨基酸（Sigma）溶解在水中，制成10 mM（100×）储备溶液。
实时PCR
按照TRI-试剂方案（Invitrogen）从细胞中分离RNA。使用AMV逆转录酶（Promega）进行逆转录。使用Power SYBR在Applied Biosystems 7300实时PCR系统上进行实时PCR®绿色PCR主混合物。
细胞存活、增殖和凋亡检测
使用细胞增殖试剂盒I（Roche Diagnostics）进行MTT分析。用Click-iT-EdU流式细胞仪试剂盒（Invitrogen）测定细胞增殖。使用Caspase-Glo 3/7试剂盒（Promega）测量Caspase3/7活性。对于克隆形成存活分析，细胞以每板500个细胞的密度进行培养，培养12天，用10%甲醇/10%乙酸固定，并用0.4%结晶紫染色。由于HT1080细胞没有形成明确的菌落，因此向每个培养皿中添加300μl 33%的乙酸以溶解染色，然后将染色转移到96 well板中，在540 nm处读取吸光度。报告了四个独立实验的平均归一化存活率和s.e。
质粒和病毒载体
pCMV-mATF4载体和腺病毒-mATF4病毒是匹兹堡大学医学系肖国志博士赠送的礼物。pCMV-HA-ASNS载体购自OriGene。ATF4和GCN2 shRNA载体来自Open Biosystems。
谷氨酰胺（Gln）测定
使用谷氨酰胺检测试剂盒（Sigma）测量培养基中的谷氨酰胺浓度。根据培养16小时前后谷氨酰胺浓度的差异计算谷氨酰胺消耗量。结果被归一化为存活细胞的数量。
细胞内氨基酸浓度
细胞缺乏葡萄糖（DMEM，无葡萄糖，10%FBS，L（左）-谷氨酰胺）作用2或4小时。对照细胞接受含有4.5 g/l葡萄糖的相同培养基。用冰镇PBS清洗细胞，向每个培养皿中添加4%的高氯酸（20μM内标），收集细胞并将其重新悬浮在高氯酸溶液中。将溶液在−80°C下冷冻5分钟，解冻，并在微型离心机中收集沉淀蛋白。将蛋白颗粒溶解在1 M NaOH中，并进行蛋白质分析（Lowry，Bio-Rad）。用KOH将上清液中和至pH 7–8。样品在冰上培养30分钟，沉淀高氯酸钾，并将所得上清液提交至费城儿童医院Mass Spec核心设施进行氨基酸分析，通过液相色谱分离邻苯二甲醛衍生物并进行荧光检测。浓度测定为μg/ml，并归一化为总蛋白。
动物
使用6-8周龄的缺氧NCR-Nu/Nu雄性小鼠（Frederick的NCI）。动物被安置在宾夕法尼亚大学Stemmler动物研究所。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院的指导方针进行，并获得宾夕法尼亚大学动物使用委员会（IACUC）的批准。Nu/Nu小鼠皮下注射HT1080细胞（2×106细胞/肿瘤）或MEF（2.5×106细胞/肿瘤）。当肿瘤变得笨重或坏死时（HT1080为～3周，MEFs为9天），小鼠被杀死；肿瘤被切除、拍照、称重、冷冻并包埋在OCT冷冻介质中。
肿瘤样本
从宾夕法尼亚大学医学院肿瘤组织和生物样本库设施中获取速冻人类肿瘤和正常组织（肝、乳腺和肺）。人体标本的采集和处理是按照艾布拉姆森癌症中心和病理学与实验医学部的规定进行的。免疫组化见补充数据.
细胞周期分析
将HT1080细胞培养在常规DMEM、含有100μM Asn的DMEM或含有100μM NEAA的DMAM中24小时。如前所述进行细胞周期分析(Javvadi等人，2008年).
统计
所有统计数据均使用未配对的双尾Student’st吨-除非另有规定，否则进行测试。A类P（P）-选择0.05作为统计显著性阈值。
