胰腺β细胞需要NeuroD来实现和维持功能成熟

胰岛形态和β细胞表型神经Dβ-CKO胰腺

因为神经D-空白小鼠不能形成成熟的胰岛(Naya等人，1997年)，我们调查了神经性Dβ-CKO小鼠由于胰岛形成和/或维持缺陷而出现葡萄糖不耐受。用胰高血糖素、胰岛素、生长抑素和胰多肽抗体分别对围生期和7周龄小鼠的胰腺进行染色，作为α、β、δ和PP细胞的标记物。尽管神经Dβ-CKO小鼠形成与对照小鼠大小相似的胰岛，其α、δ和PP细胞混合在β细胞核心而不是位于外围(图2A-B、E-F;图S3A–B;图S5A-B; 数据未显示）。有趣的是神经性DPE-CKO小鼠没有出现胰岛结构紊乱，这表明该表型与发育缺陷有关(图2C-D;图S5C–D). 胰岛素和生长抑素共同染色的细胞数量在两组中均增加神经Dβ-CKO和神经性DPE-CKO小鼠。同时表达胰岛素和生长抑素的细胞在神经Dβ-CKO小鼠：0.77%的胰岛素阳性细胞共同表达生长抑素，而对照组为0.013%(图2E-H). 然而，所涉及的细胞总数很少，因此可能对神经Dβ-在神经Dβ-CKO和对照小鼠，表明突变β细胞中的其他β细胞特征完整(图S3C–D). 为了确定葡萄糖缺乏反应是否发生在葡萄糖跨膜转运水平，我们检测了细胞内谷氨酸-2的水平神经Dβ-CKO小鼠，通过免疫染色定量测定，发现突变β细胞的谷氨酸-2蛋白仅为对照细胞的一半(图2I–J). 然而，神经DPE-CKO小鼠也是葡萄糖不耐症小鼠，在开始三苯氧胺治疗后的3周和2个月，其胰岛中的谷氨酸2含量正常(图2K–L;图S5E–F)表明谷氨酸-2的减少与两种菌株中观察到的葡萄糖不耐受无关。重要的是，Pdx-1、Nkx6.1和MafA都是β细胞转录因子，参与胰岛素转录的激活和胰岛素分泌的调节(Ohlsson等人，1993年;Schisler等人，2005年;Wang等人，2007年)，不受神经D缺失的影响(图S3E–J，L). 这些结果表明，在神经Dβ-CKO小鼠不是这些转录因子调节改变的次要结果。

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图2

β细胞特异性消融对神经性D论胰岛特性

（A–D）对照组胰腺切片，神经Dβ-CKO和神经D对PE-CKO小鼠进行胰岛素（绿色）和胰高血糖素（红色，A-D）或生长抑素（红色的，E-H）免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（F）和（H）中的白色箭头表示胰岛素和生长抑素共染细胞。原始放大倍数为200倍。（I–L）对照组中谷氨酸-2（红色）的表达，神经Dβ-CKO和神经DPE-CKO胰腺。原始放大倍数为200倍。

因为凋亡增加了10倍神经D-无鼠标(Naya等人，1997年)，我们研究了细胞凋亡是否也增加神经Dβ-CKO小鼠。我们通过活化caspase 3的免疫染色检测细胞凋亡；并通过PCNA和Ki67免疫染色检测代偿性β细胞增殖。总的来说，只有一小部分β细胞参与增殖（≤2%）或凋亡（≤2%神经Dβ-CKO和对照胰岛，表明分化β细胞中NeuroD的缺失不会导致细胞凋亡或增殖增加，这与在这些小鼠中观察到的正常胰岛面积一致。

的表达式胰岛素2，但不是胰岛素1，英寸神经性Dβ-CKO小鼠

β细胞中大量胰岛素染色的检测神经Dβ-CKO胰岛令人惊讶，因为先前的研究表明，神经D是胰岛素基因转录的关键因子(Naya等人，1995年;邱等，2002). 大于500个胰岛的形态定量显示，平均而言神经性Dβ-CKO胰岛是对照胰岛的一半。此外，尽管我们观察到对照组和对照组之间的胰岛大小或数量没有显著差异神经Dβ-CKO小鼠，神经Dβ-CKO胰腺中胰岛素含量为对照胰腺的53%（15.3±4.2 ug/mg vs.29.0±7.8 ug/mg蛋白质，n=7-13，p<0.001）。综合来看，这些数据表明神经Dβ-CKO胰岛含有正常量的一半胰岛素，这是因为每个细胞的胰岛素含量相应减少，而不是细胞数量减少。

因为啮齿动物表达两种密切相关的胰岛素基因，插入1和ins2（英寸2）(Davies等人，1994年)，我们测量了每个胰岛素基因的表达水平，以确定剩余胰岛素的来源神经Dβ-CKO小鼠。在胰岛素和C肽1共表达的胰腺切片中，>90%的β细胞神经Dβ-CKO胰腺缺乏C肽1染色，表明它们不能表达插入1与之形成鲜明对比的是，所有突变的β细胞中都存在C肽2，这意味着ins2（英寸2）表达相对不受影响(图3A-D). 一贯地，插入1转录本也减少了95%神经Dβ-CKO胰岛，而ins2（英寸2）转录物的存在水平与对照组相当(图3I). 这些数据表明神经D不需要ins2（英寸2）表达体内，但对于插入1表达式。删除神经D在成人β细胞中使用神经DPE-CKO小鼠还导致插入1，但不是ins2、，表达式(图3E–H，I). 差动调节插入1和ins2（英寸2）似乎不是与神经D条件等位基因，因为我们还检测到e18.5中剩下的少数β细胞中C肽1的免疫染色显著减少，而C肽2的免疫染色却没有显著减少神经D-无胰脏(图S4A–D). 此外，在神经D-空胚率逐渐下降ins1/ins2mRNA在e14.5和P0之间(图S4E). 在出生后可以观察到类似的现象神经Dβ-CKO小鼠，其中ins1/ins2mRNA在e18.5时从对照组的80%下降到2个月时<对照组的10%(图S4F).

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图3

删除神经D导致胰岛素1丢失

（A–D）对照组胰腺切片，神经Dβ-CKO和神经DPE-CKO小鼠用胰岛素抗体（绿色）和C肽1抗体（红色）（A-B，E-F）或C肽2抗体（C-D，G-H）共同染色。（K） 定量RT-PCR插入1和ins2（英寸2）对照组的mRNA水平，神经Dβ-CKO和神经DPE-CKO小岛。数值标准化为β-肌动蛋白mRNA和表达与相应对照组相关（每个基因型n=4-6）。***P≤0.001。

以前的研究表明，小鼠可以缺少胰岛素基因和保持葡萄糖耐量(Leroux等人，2001年). 我们在年独立确认了这一结果插入1-空鼠标（未显示数据）。此外，对胰脏切除动物的研究表明，正常量的一半胰岛素足以维持葡萄糖的稳态(Bonner-Weir等人，1983年). 因此，胰岛素1的丢失就其本身而言也不能解释胰岛素分泌缺陷和葡萄糖不耐受神经Dβ-CKO小鼠。

致密核心颗粒的形成神经Dβ-CKO老鼠

在一些糖尿病小鼠模型中，由于β细胞中缺乏胰岛素致密核颗粒（DCG），胰岛素分泌不足(Bruin等人，2008年;Like and Rossini，1976年;Pechhold等人，2009年;Piaggi等人，2007年). 此外，在发育不全的β细胞中存在较少的DCG神经D-空鼠标（未显示数据）。我们分析了神经Dβ-CKO小鼠使用电子显微镜确定其是否具有正常DCG。突变的β细胞含有大量DCG，与对照小鼠相似，这意味着DCG的形成缺陷或耗竭都不是胰岛素分泌缺陷的原因神经性Dβ-CKO小鼠(图S4H–I).

离体胰岛刺激-分泌耦合缺陷神经Dβ-CKO小鼠

为了了解在神经D突变小鼠中观察到的缺陷GSIS的生理基础，我们刺激了从对照组和神经性D具有多种胰岛素分泌促进剂的β-CKO小鼠(图4A). 分泌胰岛素的量被归一化为总胰岛素含量，以考虑到神经Dβ-CKO胰岛。我们发现，在基础条件下（2.8 mM葡萄糖），突变胰岛分泌的胰岛素比例更大（0.13±0.01%，对照组为0.05±0.01%）。然而，在16.7mM葡萄糖中静态孵育1小时期间，对照胰岛分泌1.0%的胰岛素，而神经Dβ-CKO胰岛只分泌0.26%的胰岛素(图4A). 突变胰岛对亮氨酸的反应也很差(图4A). 这些分泌缺陷似乎与缺乏易释放的胰岛素颗粒无关，因为暴露于神经Dβ-CKO胰岛对30mM KCl诱导的强劲胰岛素分泌与对照胰岛无显著差异(图4A).

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图4

胰岛素分泌曲线神经Dβ-CKO胰岛

（A） 从对照组和神经D用不同的胰岛素促分泌剂（2.8mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖、20mM亮氨酸、30mM KCl、50uM格列吡嗪和10mM丙酮酸甲酯）治疗的β-CKO小鼠。分泌的胰岛素归一化为胰岛中的总胰岛素（每个基因型6–10个）。（B） 定量RT-PCR基尔6.2,第1学期,短笛和编号2对照组和神经性Dβ-CKO胰岛。数据标准化为β-肌动蛋白mRNA（每个基因型3–8个）。（C） 控制呼吸率和神经Dβ-CKO小鼠胰岛与葡萄糖和寡霉素（OM）一起孵育（每个基因型n=6-17）。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。

广泛在体外和体内对与MODY相关的基因产物的研究表明，它们在葡萄糖敏感性-胰岛素分泌偶联中起主导作用(Giuffrida和Reis，2005年;Mitchell和Frayling，2002年). 因为Sur1是胰腺K的调节亚单位_{列车自动防护系统}通道已被证明是NeuroD的转录靶点在体外(Keller等人，2007年;Kim等人，2002年)，我们评估了神经Dβ-CKO小鼠表现出缺陷K_{列车自动防护系统}通道功能。与K中的缺陷一致_{列车自动防护系统}通道功能，神经Dβ-CKO胰岛对磺酰脲类药物格列吡嗪的反应较差，仅分泌0.22%的胰岛素含量，而对照胰岛分泌0.79%(图4A). 有趣的是，K的mRNA表达没有差异_{列车自动防护系统}通道基因（Kir6.2，kcnj11号机组)或其调节亚单位（Sur1，abcc8型)突变胰岛和对照胰岛之间(图4B)表明NeuroD在转录水平上不调节这些基因体内.

NeuroD仍有可能影响钾的其他方面_{列车自动防护系统}渠道活动。这个神经Dβ-CKO胰岛对丙酮酸甲酯反应不良(Dufer等人，2002年)(图4A)并且缺乏连接K活性的分子_{列车自动防护系统}调节胰岛素分泌所必需的其他机械部件的通道。短笛的表达(pclo（印刷电路板）)和Noc2(电话3)β-CKO胰岛中两者均减少(图4B).Pclo公司编码连接K的胰岛素分泌复合物组装所必需的支架蛋白_{列车自动防护系统}通道、L型钙通道和胰岛素颗粒进入功能单位(Shibaski等人，2004年)，Noc2是GSIS所需的Rab效应器，通过与小的单体GTPase的相互作用(Cheviet等人，2004年).

我们还调查了在关闭K之前的步骤中是否存在缺陷_{列车自动防护系统}通道输入神经Dβ-CKO胰岛。我们测量了O₂消耗在低血糖和高糖培养的胰岛中，以测量导致ATP生成的氧化代谢程度。与对照组相比，突变胰岛的O₂基本条件下的消耗(图4C). 当受到高糖刺激时，O₂与对照胰岛相比，突变胰岛的消耗量增加幅度较小，但总体上达到了相似的速度。几乎所有O₂用ATP合酶抑制剂寡霉素A抑制突变和对照胰岛的消耗，这意味着它与ATP的生成有关(图4C). 有趣的是神经Dβ-CKO胰岛类似于GSIS缺乏的新生儿胰岛(Boschero等人，1990年).

GSIS扩增缺陷神经Dβ-CKO胰岛

尽管KCl的整体膜去极化释放了正常量的胰岛素神经Dβ-CKO胰岛、它们对葡萄糖的反应而减少的胰岛素分泌、其他燃料促分泌剂和格列吡嗪表明它们在钙上游GSIS的初始阶段有缺陷²⁺大量涌入。因此，为了确定突变胰岛是否能够在Ca²⁺我们用BayK8644（一种专门开放L型电压敏感性钙通道（VDCCs）的药物）和16.7mM葡萄糖对其进行治疗。突变胰岛分泌的胰岛素占其总胰岛素的2.6%，是其对高糖单独反应的10倍，但仍低于对照胰岛分泌胰岛素的4.7%(图5A). 使用20 mM L-精氨酸增强突变和对照胰岛的质膜去极化也获得了类似的结果。此外，一种增强GSIS扩增相的试剂（cAMP）(Doyle和Egan，2003年)也部分挽救了突变胰岛中的胰岛素分泌(图5A). 因此，这两种治疗方法都不能完全挽救糖尿病患者的胰岛素分泌神经Dβ-CKO胰岛，表明突变胰岛在GSIS的初始和扩增期都有缺陷。

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图5

删除神经D导致NPY表达增加

（A） 从对照组和神经D在16.7mM葡萄糖存在下，用不同的胰岛素促分泌剂（2uM BayK8644、20mM L-精氨酸和1mM二丁酰cAMP）处理β-CKO小鼠。分泌的胰岛素归一化为胰岛中的总胰岛素（每个基因型6–9个）。（B） 对照组NPY mRNA的定量RT-PCR，神经Dβ-CKO和神经DPE-CKO岛。数据标准化为β-肌动蛋白mRNA（每个基因型4–8个），并与相应的对照组相比较。（C–J）对照组胰腺切片中神经肽Y（红色）和胰岛素（绿色）的联合免疫染色神经性Dβ-CKO（C–D），神经Dβ-CKO（E–F），对照神经DPE-CKO（G-H）和神经DPE-CKO（I–J）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数为200倍。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。

腺苷酸环化酶活性是ATP转化为cAMP所必需的，它被神经肽Y（NPY）抑制，神经肽Y是一种出生后胰岛中正常表达降低的激素(图S6A–J; (莫托尔斯基和米歇尔，1988年)). 我们发现NPY mRNA在神经性Dβ-CKO和神经DPE-CKO胰岛，并且在每个菌株的突变β细胞中，NPY的免疫染色明显增加了40%以上(图5B–J). β细胞中NPY的上调神经Dβ-CKO和神经DPE-CKO小鼠可能通过降低cAMP水平而导致其所观察到的GSIS缺陷。

神经D与胰岛素转录激活

神经元Dβ-CKO小鼠保留了正常量的一半胰岛素，因为ins2（英寸2）基因不受影响体内在发育期间和成年小鼠中。尽管插入1和ins2（英寸2）在某些生理条件下被检测到(Deltour等人，1993年;Giddings等人，1991年;Ling等人，1998年)，这是第一次将转录因子与它们的差异调节联系起来体内。这个结果令人惊讶，因为之前有几个在体外研究表明，NeuroD能够激活两者插入1和ins2（英寸2）通过保守的E-box元件(克拉克和多尔蒂，1993年;German等人，1991年;Naya等人，1995年). 因此，预计这两个基因的表达都会在没有NeuroD的情况下受到影响。另一方面，大鼠和人胰岛素基因中的每个E-box元件都被证明对英寸表达式(Crowe and Tsai，1989年;Karlsson等人，1987年). 我们的结果表明，两种啮齿动物的这种差异调节英寸基因是通过NeuroD介导的，而对于ins2（英寸2）天然基因表达体内环境。为了解决胰岛素基因调控的不同机制，有必要进行互补在体外和体内研究以充分了解插入1和ins2（英寸2）通过NeuroD和可能的其他电子盒结合因子。

轻度高血糖和严重葡萄糖不耐受

因为神经Dβ-CKO小鼠表现出严重的葡萄糖不耐受，似乎自相矛盾的是，它们在喂食时只是轻度高血糖随意。诱导的肝葡萄糖输出量变化不太可能解释这种表型，因为神经D禁食5小时或16小时的β-CKO小鼠的血浆胰高血糖素含量与对照小鼠相似。也有可能在随意由于不依赖于GSIS的机制导致的喂食条件。Sur1基因敲除小鼠在喂食时也存在葡萄糖不耐症，但血糖正常随意(Seghers等人，2000年)据信，由于胆碱能刺激胰岛素分泌，它们在进食时会分泌几乎正常量的胰岛素(Shiota等人，2002年). 类似的代偿机制可能调节神经D喂食β-CKO小鼠随意.

NeuroD调节β细胞成熟

孤立的胰岛神经Dβ-CKO小鼠的代谢特征类似于未成熟胰岛β细胞，后者存在于晚期胎儿或新生儿胰岛中。突变的β细胞和未成熟的β细胞都有胰岛素分泌颗粒，但缺乏GSIS。与成熟β细胞相比，未成熟β细胞的O₂在基础条件下摄入、产生更多乳酸和分泌更多胰岛素(Boschero等人，1990年;Rozzo等人，2009年)，这些特性也表征了神经Dβ-CKO胰岛。当受到高糖的挑战时，未成熟的β细胞不能像成熟的β电池那样显著增加其氧化代谢，因此不能分泌同样多的胰岛素(休斯，1994年;Rozzo等人，2009年;Tu和Tuch，1996年). 胎儿和新生儿胰岛中的糖酵解主要导致GSIS受损，GSIS依赖葡萄糖的氧化代谢。同样，我们发现一些糖酵解基因的表达，包括乳酸脱氢酶a（LDHA），在神经性Dβ-CKO和神经DPE-CKO岛。LDHA特别重要，因为它在胞浆中将丙酮酸转化为乳酸，从而阻止其在线粒体中的氧化代谢。LDHA在胚胎和新生儿胰腺中高水平表达，但在成人胰岛中下调(图S6L). 因此，成熟β细胞中LDHA的降低被认为对其将葡萄糖代谢与胰岛素分泌耦合的能力至关重要(Schuit等人，1997年;Sekine等人，1994年;Zehetner等人，2008年;Zhao和Rutter，1998年). 因此，NeuroD可能通过下调LDHA和其他糖酵解基因在β细胞成熟中发挥主要作用，因为这些变化对于成熟β细胞中葡萄糖和GSIS的有效氧化代谢是必要的。有趣的是，von Hippel-Lindau基因β细胞特异性敲除小鼠(超高速)还显示，由于LDHA和其他糖酵解基因的过度表达，低血糖时胰岛素分泌增加，GSIS降低(Zehetner等人，2008年). The phenotype of the超高速-Hif1α激活导致胰岛缺陷(Zehetner等人，2008年); 然而，这种途径不太可能在神经Dβ-CKO胰岛，因为Hif1α强烈上调的其他基因，包括蔬菜和pdk1型在中不受影响神经Dβ-CKO胰岛（数据未显示）。目前，我们没有证据表明LDHA或我们检测的糖酵解基因是NeuroD的直接靶点(Keller等人，2007年). 在小鼠和大鼠的LDHA启动子的-430位有一个典型的神经D E盒（CATCTG），但该位点在人类基因中并不保守。

神经元Dβ-CKO小鼠在GSIS机制方面存在缺陷，除了其不成熟的葡萄糖氧化代谢。特别地，神经Dβ-CKO胰岛对格列吡嗪介导的K关闭反应不佳_{列车自动防护系统}频道。K封闭对胰岛素分泌的生理诱导_{列车自动防护系统}通道涉及细胞溶质[Ca的升高²⁺]在停靠和启动胰岛素颗粒周围的微环境中(Bokvist等人，1995年). 胰岛素分泌复合物的形成促进了这一过程，该复合物将ATP传感器（Kir6.1和Sur1）、cAMP传感器（cAMPGEFII）、VDCC和胰岛素颗粒连接成一个功能单元(Shibaski等人，2004年). 因为神经D缺陷β细胞具有GSIS第一阶段所需的基本成分，即K_{列车自动防护系统}通道、VDCC、易释放胰岛素颗粒和ATP-偶联O₂消费，我们假设它们缺乏GSIS，因为它们缺乏这些成分共同发挥作用所必需的结构。为了支持这一假设，我们发现神经Dβ-CKO胰岛中短笛的表达减少，短笛是一种大的支架蛋白，可能是Ca²⁺有助于形成这种复合物的传感器，以及Noc2，一种与胰岛素分泌颗粒相关的Rab效应器，是高效GSIS所必需的(Cheviet等人，2004年). NeuroD对关键的细胞外蛋白如SNAP25和syntaxin1A的表达也很重要(石冢等人，2007年). 鉴于缺乏神经D的β细胞明显不成熟，我们的假设进一步表明胰岛素分泌复合物的形成可能是β细胞成熟的关键步骤。

内分泌胰腺中的早期前体细胞共同表达胰岛素和神经肽Y（NPY），但随着发育的进行，β细胞中的NPY减少(图S6A–J; (Teitelman等人，1993年)). NPY抑制腺苷酸环化酶和cAMP的生成(莫托尔斯基和米歇尔，1988年)，这是高效GSIS所必需的。NPY在GSIS中的抑制作用已在几种啮齿动物模型和孤立的胰岛中得到证实(Imai等人，2007年;Myrsen-Axcrona等人，1997年;Myrsen等人，1995年;Wang等人，1994年). 与缺乏NeuroD的β细胞的未成熟状态和受损GSIS相一致，NPY mRNA和蛋白质在两种细胞中都显著增加神经Dβ-CKO和神经DPE-CKO岛。因此，NeuroD似乎在激活β细胞成熟特异性基因和下调未成熟β细胞特异性基因方面发挥着全球作用。最近的一项研究表明，新生儿胰岛显示出不同于成人胰岛的分子特征，并确定了一些在围产期短暂表达的标记物（Aye等人）。为了支持我们的假设，编码新生儿β细胞标志物之一CK19的基因在神经Dβ-CKO胰岛(图S6M).神经元D在出生后的早期成熟期，mRNA水平也逐渐增加(图S6K); 然而，由于NeuroD的活性也取决于翻译后和翻译后的调节，我们需要进一步确定这些基因表达变化中的哪些是由NeuroD的直接或间接调节引起的。

乳酸脱氢酶活性和乳酸测定

使用LDH检测试剂盒（Cayman）测量LDH活性，使用乳酸检测试剂盒分析乳酸生成量（Biovision）。有关更多详细信息，请参阅补充数据.

O的测量₂消费

O（运行）₂使用96孔BD氧气生物传感器板（BD）测量消耗量。在约50个胰岛/孔的BD氧气生物传感器板上添加平衡胰岛₂在37°C的荧光板阅读器（Bio-Tek）中每隔1分钟测量一次消耗量。胰岛的DNA含量用皮戈格林染料（Invitrogen）测定。

胰岛素分泌测定

将平衡后的胰岛放置在24孔板孔中，每孔10–15个胰岛，400ul Kreb缓冲液含有2.8mM葡萄糖，培养1小时，收集上清液以测量基础胰岛素分泌。将胰岛转移到含有不同胰岛素促分泌剂的Kreb缓冲液中（见结果），并在收集上清液之前培养1小时。在500 ul裂解缓冲液（10 mM Tris pH7.5、200 mM NaCl和1mM EDTA）中对胰岛进行超声处理，并用酸性乙醇提取胰岛素。用大鼠胰岛素放射免疫试剂盒（Millipore）测量上清液和胰岛裂解物中的胰岛素。丙酮酸甲酯、二丁酰cAMP和Bay K8644购自Sigma。

微阵列

从成人胰岛提取总RNA，评估胰岛纯度，并匹配4对对照和突变RNA样本。使用Ovation扩增25 ng每个RNA样本^™RNA扩增系统V2（Nugen，Inc.）。小鼠PancChip 6.0用于微阵列分析(Kaestner等人，2003年). 显示倍数变化>1.5、FDR≤5%的基因如所示表S1和S2。完整数据集可在ArrayExpress上获得，实验登录号为E-MTAB-152。

我们感谢D.Melton博士为我们提供Pdx-1 ER^™Cre小鼠、J.Jami博士和A.Pugliese博士检查1^−/−小鼠，C.Wright博士研究Pdx-1抗体，β细胞生物学联合会研究许多其他抗体。我们特别感谢S.Bonner-Weir博士在发表之前分享数据，并对新生儿β细胞成熟过程提供关键见解。我们感谢朱莉·里奇海默、戴安娜·罗奈、弗吉尼亚·方特、米歇尔·多伊尔、迪娜·巴尔德斯、安吉拉·米尼克、莎拉·斯坦因、特蕾莎·马斯特拉奇、南高、汉斯·霍梅耶、克里斯蒂娜·安迪梅·翁齐吉和约翰·吴的组织和/或技术支持，感谢乔纳森·舒格协助存放微阵列数据，感谢罗伯特·波顿博士的有益讨论。NIH拨款#UO1 DK072504（LS和JL）支持该研究。