美国生理学杂志心脏循环生理学。2010年5月；298（5）：H1357–H1364。
Ac-SDKP抑制转化生长因子-β1诱导的人心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化
,1 ,1 ,2和
1 爱德华·彼得森
2密歇根州底特律亨利福特医院生物统计和研究流行病学
高血压和血管研究部1内科和
2密歇根州底特律亨利福特医院生物统计和研究流行病学
通讯作者。 重印请求和其他通信地址：N.-E.Rhaleb，高血压和血管研究部，E&R Bldg.7085，Henry Ford Hospital，2799 West Grand Blvd.，Detroit，MI 48202（电子邮件：1belahrn处的gro.shfh). 2009年5月20日收到；2010年2月3日接受。
摘要
N个-乙酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP）抑制培养的大鼠心脏成纤维细胞的胶原生成和细胞增殖，但其对成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响尚不清楚。纤维化心脏组织中发现大量转化生长因子-β1（TGF-β1）。TGF-β1将成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，肌成纤维纤维细胞比成纤维细胞产生更多的细胞外基质蛋白。我们假设1)Ac-SDKP抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞；和2)这种作用在一定程度上是通过阻断小分子-他汀类药物对去甲停搏液（Smad）2和细胞外信号调节激酶（ERK）1/2的磷酸化来介导的。在本研究中，我们使用了人胎儿心脏成纤维细胞（HCFs），当低代培养时，HCFs不会自发成为肌成纤维细胞。我们研究了Ac-SDKP对TGF-β1诱导HCF转化为肌成纤维细胞、Smad2和ERK1/2磷酸化、Smad7表达、细胞增殖和胶原生成的影响。我们还研究了内皮素-1（ET-1）刺激的HCF产生TGF-β1的情况。正如预期的那样，与未经处理的细胞相比，经TGF-β1处理的HCF转化为肌成纤维细胞，表现为α-平滑肌肌动蛋白的表达增加，平滑肌肌球蛋白胚胎亚型的比例更高。TGF-β1也增加Smad2和ERK1/2磷酸化，但不影响Smad7的表达。此外，TGF-β1刺激HCF增殖，如线粒体脱氢酶活性和胶原蛋白生成增加所示（羟脯氨酸测定）。Ac-SDKP显著抑制TGF-β1的所有作用。它还抑制ET-1刺激的TGF-β1的产生。我们得出结论，Ac-SDKP可能通过抑制TGF-β/Smad/ERK1/2信号通路，从而介导其抗纤维化作用，从而显著抑制人心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。
关键词：转化生长因子-β1，人心肌成纤维细胞，N个-乙酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸、胶原蛋白、信号转导、成纤维细胞分化
纤维化导致高血压、心肌梗死和其他心血管疾病引起的心脏重塑。活化的肌成纤维细胞被认为是细胞外基质成分的主要来源，如I型和III型胶原(44). 心脏成纤维细胞在转化生长因子-β1（TGF-β1）等成纤维细胞因子的作用下转化为肌成纤维细胞。心肌成纤维细胞的特征是收缩蛋白平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）的表达(11). 我们和其他人发现，培养中的大鼠心脏成纤维细胞在很早的传代中自发成为肌成纤维细胞(41)从而限制了它们在研究转化过程中的使用。另一方面，当人胎儿心脏成纤维细胞（HCFs）在低代培养（最多6代）时，表型保持稳定，只有10-20%的细胞转化为肌成纤维细胞；因此，它们为研究成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化提供了一个独特的模型(9).
TGF-β1是体内外关键的成纤维细胞因子(2,4,5,37). 在心脏纤维化部位观察到TGF-β1浓度增加(17,18,39,40). 研究表明TGF-β缺乏小鼠的纤维化减弱(三)和用抗TGF-β1抗体治疗的大鼠(42). TGF-β1将心脏成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，肌成纤维纤维细胞表达α-SMA并比成纤维细胞产生更多的胶原(37). 因此，TGF-β1在生理和病理生理条件下的心脏重塑中起着重要作用。高血压或心肌梗死导致心肌纤维化的大鼠心肌成纤维细胞增加(6,38). 因此，TGF-β1将成纤维细胞转化为肌成纤维细胞是心脏纤维化产生的重要机制。
主要的TGF-β信号转导途径是高度保守的小分子对抗癫痫麻痹（Smad）途径(35). Smad分为以下三大类：1)受体调节的Smads（R-Smads:Smad2和Smad3），2)共同调解人Smad（co-Smad:Smad4），以及三)抑制性Smads（I-Smads:Smad6和Smad7）(24). 通过磷酸化激活TGF-β受体和R-Smad蛋白导致R-Smad-co-Smad复合物转位到细胞核，与其他转录因子相互作用，并调节靶基因表达(36). Smad7的过度表达被证明可以抑制TGF-β诱导的信号转导(12,25). 此外，最近的一项研究表明，药物抑制细胞外信号调节激酶（ERKs）完全阻断了心脏成纤维细胞中TGF-β刺激的胶原基因表达(22). 此外，ERK丝裂原活化蛋白激酶途径似乎增强了TGF-β1刺激的人系膜细胞中Smad介导的胶原基因表达(14). 更重要的是，Smad2/3的激活已被证明是TGF-β1诱导人心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的关键介质(9).
N个-乙酰-SDKP是骨髓细胞分泌的内源性四肽(23)广泛存在于各种组织中(30)包括血浆和循环单核细胞(31). 它是多能干细胞增殖的天然抑制剂和血管紧张素转换酶抑制剂（ACEi）的天然底物(1,20). 我们之前发现Ac-SDKP抑制内皮素-1（ET-1）诱导的胶原生成和血清诱导的培养大鼠心脏成纤维细胞增殖(33). 在体内研究中，Ac-SDKP可减轻2K-1C、ALDO-盐或ANG II诱导的高血压或心肌梗死大鼠的心脏纤维化，并降低ANG II诱发的高血压大鼠心脏TGF-β的表达(27,32,34,45). 然而，尚不清楚Ac-SDKP的抗纤维化作用是否部分是阻止成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的结果。因此，在本研究中，我们检验了以下假设：1)在TGF-β1刺激的HCF中，Ac-SDKP抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，从而减少胶原蛋白的生成；2)Ac-SDKP通过拮抗Smad/ERK1/2信号通路阻断TGF-β1介导的分化；和三)Ac-SDKP阻断成纤维细胞增殖和TGF-β1分泌。
方法
细胞培养
从Cell Applications（加利福尼亚州圣地亚哥）购买第1代正常人胎儿心脏的成纤维细胞，并在含有10%成纤维细胞生长补充剂的低糖成纤维细胞基础培养基（FBM）中生长。在每次处理前，将第3代至第5代的细胞在无FGS的FBM中培养24小时，使其静止。在所有方案中，向所有组（包括对照组）的培养基中添加ACEi，卡托普利（1μM；西格玛，密苏里州圣路易斯），以防止Ac-SDKP降解。
协议
方案1：Ac-SDKP对TGF-β1诱导HCF向肌成纤维细胞转化的影响。
成纤维细胞向肌成纤维细胞发生表型改变，导致收缩蛋白α-SMA的表达，以及平滑肌肌球蛋白（SMemb）胚胎亚型与非肌肌球蛋白重链B的比例增加(10). 我们用免疫细胞化学染色检测了α-SMA和SMemb，它们都是肌成纤维细胞转化的标志物。在我们的初步实验中，我们发现5和10 ng/ml的TGF-β1可引起成纤维细胞表型的显著变化，而不会导致细胞死亡。因此，本研究根据已发表的研究选择了5 ng/ml的剂量(15). 首先将生长在四孔载玻片（纽约州罗切斯特的赛默飞世尔科学公司）上的静态细胞保持未经处理或用Ac-SDKP（0.1–10 nM；加利福尼亚州托伦斯的Bachem）处理30分钟，然后将其暴露在TGF-β1（研发系统）中24小时，将生长在FBM中的细胞作为对照。细胞首先用2%多聚甲醛/PBS固定15分钟，然后用1%Triton X-100/PBS渗透30分钟。α-用亲和素生物素化酶检测SMA和SMemb。用3%H淬火内源过氧化物2O（运行）2，细胞首先在2%BSA/PBS中被阻断，然后与抗α-SMA（Sigma）或鼠抗SMemb单克隆[3H2]抗体（马萨诸塞州剑桥Abcam）60分钟，然后用生物素化二级抗体（山羊抗鼠IgG；Sigma。抗体孵育后，在PBS中冲洗细胞三次，每次5分钟。使用底物3-氨基-9-乙基咔唑进行染色（佐米德实验室，加利福尼亚州南旧金山）。用苏木精对细胞进行复染，使细胞核可视化并计数（>500个细胞/片）。α-细胞质中含有玫瑰红到棕红色丝状物的SMA和SMemb阳性细胞表示为占总细胞数的百分比。
为了证实免疫细胞化学数据，仅α-由于Abcam不建议在Western blot中使用针对SMemb的小鼠单克隆[3H2]抗体，因此通过Western blot测定SMA表达。在向培养基中添加TGF-β1之前，用载体或Ac-SDKP（0.1–10 nM）预处理6孔板上的静态细胞30 min，然后培养24 h。对照细胞在FBM中培养。在细胞裂解缓冲液（20 mM Tris·HCl，pH 7.5；150 mM NaCl；1 mM EDTA；1 mM-EGTA；1%Triton X-100；2.5 mM焦磷酸钠；1 mMβ-磷酸甘油；1 mM钠三VO（旁白）4; 蛋白酶抑制剂混合物）并在冰上超声处理。用考马斯试剂（Thermo Scientific）测定蛋白质。在还原条件下对等量的蛋白质进行10%的SDS-PAGE，并将其电转移到硝化纤维素膜上。用封闭缓冲液（TBS/0.1%吐温20，含5%脱脂奶粉）处理膜，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。结合结合辣根过氧化物酶的二级抗体（马萨诸塞州丹佛市细胞信号技术）和ECL试剂（新泽西州皮斯卡塔韦市Amersham Biosciences）观察结合抗体。定位α-SMA后，用剥离缓冲液（Pierce，Rockford，IL）处理印迹，并用兔抗肌动蛋白多克隆抗体（1:2000；细胞信号技术）重新绘制印迹。用密度测定法定量条带的强度。α-SMA归一化为肌动蛋白，结果表示为与对照组相比的增加程度。
方案2：Ac-SDKP对TGF-β1诱导的Smad2、ERK1/2和Smad7表达磷酸化的影响。
用载体或Ac-SDKP（0.1–10 nM）预处理六孔板上的静止细胞30分钟。将TGF-β1加入培养基中，培养细胞30分钟以检测磷酸化Smad（pSmad）2和Smad7，培养细胞15分钟以检测磷酸化ERK1/2（pERK1/2）。未经处理的细胞作为对照。在细胞裂解缓冲液中制备全细胞裂解物，并如上所述在SDS-PAGE上分析蛋白质以用于α-SMA表达。作为主要抗体，我们使用了针对pSmad2、pERK1/2（1:1000；细胞信号技术）或Smad7（1:500；加州圣克鲁斯圣克鲁斯科技）的兔多克隆抗体。检测到pSmad2或pERK1/2后，用剥离缓冲液（Pierce）处理印迹，并用鼠抗总Smad2单克隆抗体（tSmad2）（tERK1/2的兔多克隆抗体）（1:1000；细胞信号技术）重新绘制印迹，或抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶的兔单克隆抗体（GAPDH，1:5000；细胞信号技术）。用密度测定法定量条带的强度。pSmad2和pERK1/2分别归一化为tSmad2和tERK1/2；Smad7被归一化为GAPDH。结果表示为与对照组相比的倍数增加。
方案3：Ac-SDKP对TGF-β1诱导的胶原蛋白生成的影响。
如前所述，通过羟脯氨酸分析测定成纤维细胞培养物中的胶原蛋白含量(8,27). 简单地说，用载体或Ac-SDKP（0.1–10 nM）预处理六孔板上的静止细胞30分钟，然后将其暴露于TGF-β1（5 ng/ml）中48小时，以FBM中生长的细胞作为对照。使用考马斯试剂（Thermo Scientific）测量细胞裂解物的蛋白质含量。假设胶原蛋白平均含有13.5%的羟脯氨酸，数据以微克/毫克蛋白质表示(7).
方案4：Ac-SDKP对TGF-β1诱导的细胞增殖的影响。
成纤维细胞以5×10的密度接种在96个板上三细胞/孔，生长到50-60%的汇合处。在Ac-SDKP（0.1–10 nM）存在或不存在的情况下，用5%FGS或TGF-β1处理静止细胞48 h；对照细胞在FBM中生长。使用BioVision（加州山景城）基于细胞线粒体脱氢酶将四唑盐WST-1裂解为甲赞的分析来量化细胞增殖。通过在450 nm处测量染料溶液的吸光度，用多孔分光光度法（微量滴定板阅读器）定量活细胞产生的甲赞染料。
方案5：ET-1诱导TGF-β1分泌。
用定量夹心酶免疫法检测培养液中的总TGF-β1。在补充有载体（对照）或ET-1（10−7M；Bachem），在有或无Ac-SDKP（0.1–100 nM）的情况下持续36-48小时。等分样品在−72°C下保存，直至检测。使用Quantikine免疫分析试剂盒（R&D Systems）检测培养基中TGF-β1的浓度。在细胞裂解缓冲液中制备全细胞裂解产物，并在冰上超声处理。使用考马斯试剂（Thermo Scientific，Rockford，IL）测量细胞裂解物中的蛋白质。TGF-β1以微克蛋白质的微克数表示。
统计分析
所有变量均通过一组配对分析吨-测试。将TGF-β1与Ac-SDKP各剂量的比较视为一组实验，并使用Hochberg的方法确定显著性。对照组与TGF-β1被视为一项单独的比较，其显著性定义为P（P）<0.05. 数值表示为平均值±SE。
结果
方案1：Ac-SDKP对TGF-β1诱导HCF向肌成纤维细胞转化的影响
对照HCF的免疫化学染色显示α-SMA阳性细胞相对较少（16±1%），其特征是细胞内α-SMA紊乱。相反，>80%的TGF-β1处理的HCFs呈α-SMA阳性，并含有组织良好的α-SMA丝()表明成纤维细胞几乎完全分化为肌成纤维细胞。在TGF-β1处理的HCF中，Ac-SDKP以剂量依赖性的方式减少了α-SMA阳性细胞的数量，但没有使细胞数量正常化(). SMemb染色的细胞显示出与α-SMA相似的模式(). 同样，对照培养物仅含有少量SMemb阳性细胞（14±1%）；1 nM和10 nM的Ac-SDKP显著降低TGF-β1处理的SMemb阳性细胞，从81±4%降至60±4%(P（P）=0.053）和42±1%(P（P）=0.0013）。Western blot显示，与对照组相比，TGF-β1处理的细胞中α-SMA表达增加了四倍，而Ac-SDKP显著降低了α-SMA的表达().
代表性显微照片(一个)和定量数据(B类)代表平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）染色培养的成纤维细胞，用转化生长因子-β1（TGF-β1，5 ng/ml，24 h）处理，有无N个-乙酰-SDKP（Ac-SDKP）。用苏木精对细胞进行复染，以显示细胞核。P（P）=0.001，对照组与TGF-β1（*）和Ac-SDKP+TGF-(n个=5个实验/组）。
显示Ac-SDKP对TGF-β1处理24小时的人胎儿心脏成纤维细胞中胚胎平滑肌肌球蛋白表达亚型的影响的典型显微照片。条件与.
代表性Western印迹(一个)和定量数据(B类)代表α-在存在或不存在Ac-SDKP的情况下，用TGF-β1（5ng/ml）处理24小时的成纤维细胞中SMA的表达。α-SMA标准化为肌动蛋白*P（P）=0.004，对照组vs.TGF-β1；†P（P）<0.007，Ac-SDKP+TGF-β1 vs.单独使用TGF-(n个=5/组）。
方案2：Ac-SDKP对TGF-β1诱导Smad2和ERK1/2磷酸化及Smad7表达的影响
蛋白质印迹显示，在30分钟时，TGF-β1诱导的Smad2磷酸化（pSmad2）显著增加，但对照细胞和TGF-β1处理的细胞之间的Smad7表达没有差异(和). Ac-SDKP显著阻断TGF-β1诱导的pSmad2，但对Smad7表达无影响(和).
代表性Western印迹(一个)和定量数据(B类)代表在存在或不存在Ac-SDKP的情况下，用TGF-β1处理30分钟的成纤维细胞中磷酸化（p）的小母亲对抗脑卒中（Smad）2水平。pSmad2归一化为总（t）Smad2*P（P）=0.005，对照组vs.TGF-β1；†P（P）<0.05，Ac-SDKP+TGF-β1 vs.单独使用TGF-(n个=4/组）。
代表性Western印迹(一个)和定量数据(B类)在有或无Ac-SDKP的情况下，TGF-β1处理30分钟的成纤维细胞中Smad7水平。Smad7被归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）(n个=4/组）。
为了测试成纤维细胞中的ERK1/2激活是否受到TGF-β1刺激，以及Ac-SDKP是否对这一过程有任何影响，用Ac-SDKP预孵育细胞30分钟，然后用TGF-？孵育15分钟。用Western blot检测pERK1/2和tERK1/2。我们发现在TGF-β1刺激的成纤维细胞中ERK1/2的磷酸化增加(P（P）=0.001），但经Ac-SDKP预处理后明显变钝().
代表性Western印迹(一个)和定量数据(B类)在存在或不存在Ac-SDKP的情况下，用TGF-β1处理15分钟的成纤维细胞中磷酸化细胞外信号调节激酶（ERK）1/2的水平。pERK1/2归一化为tERK1/2*P（P）=0.001，对照组vs.TGF-β1；†P（P）<0.02，Ac-SDKP+TGF-β1 vs.单独使用TGF-(n个=6/组）。
方案3：Ac-SDKP对TGF-β1诱导的胶原生成的影响
TGF-β1治疗48小时后，胶原生成量从12.1±0.8μg/mg蛋白质的对照水平增加到19.8±1.1(P（P）= 0.002). Ac-SDKP以剂量依赖性方式抑制TGF-β1刺激的胶原生成().
Ac-SDKP对TGF-β1刺激的培养成纤维细胞胶原生成的影响（5 ng/ml TGF-？48小时）*P（P）=0.002，对照组vs.转化生长因子-β1；†P（P）=0.001，Ac-SDKP+TGF-β1与单独TGF-(n个=6/组）。
方案4：Ac-SDKP对TGF-β1诱导的细胞增殖的影响
未经处理的成纤维细胞（对照组）的吸光度为0.21±0.02个任意单位。用5%FGS和0.53±0.03与TGF-β1孵育48小时后，其增加至1.13±0.04。Ac-SDKP抑制FGS和TGF-β1刺激的细胞增殖，对FGS的作用具有更显著的抑制作用().
Ac-SDKP对两种成纤维细胞生长补充剂刺激的成纤维细胞增殖的影响(一个)或转化生长因子-β1(B类). 通过测量线粒体脱氢酶活性来测量细胞增殖(一个:n个=28-29/组；B类:n个=12/组）。在450 nm处使用微量滴定板阅读器记录吸光度，并表示为任意单位（AU）。P（P）=0.001，对照组对TGF-β1（*），Ac-SDKP+TGF-α1对单独TGF-γ1（†）。
方案5：ET-1诱导的TGF-β1分泌
ET-1（10−7M） 培养成纤维细胞培养液中TGF-β1（活性和潜在形式）显著增加（从对照组的5.37±0.50 pg/μg增加到ET-1处理细胞的7.24±0.40；P（P）< 0.05). Ac-SDKP以剂量依赖性方式阻断ET-1刺激的TGF-β1释放().
Ac-SDKP对内皮素-1（ET-1）刺激的人心脏成纤维细胞分泌TGF-β1的影响。采用定量夹心酶免疫法测定TGF-β1*P（P）<0.05，对照组与ET-1；†P（P）<0.05，Ac-SDKP+ET-1 vs.ET-1单独使用#P（P）=0.0021，Ac-SDKP+ET-1 vs.仅ET-1(n个=4/组）。
讨论
我们发现，正如预期的那样，TGF-β1诱导HCF的强烈分化并增加胶原蛋白的生成。用Ac-SDKP处理成纤维细胞可抑制1)TGF-β1诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，2)TGF-β1诱导Smad2和ERK1/2磷酸化，三)胶原蛋白合成，4)成纤维细胞增殖，以及5)ET-1诱导TGF-β1的产生。Ac-SDKP的抗纤维化作用可能部分通过阻断成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化来介导。TGF-β1的生物学效应是通过II型和I型受体（TβRI）复合体介导的，其特征是丝氨酸-三氢嘌呤激酶，通过Smad和非Smad途径传递细胞内信号。活化受体复合物磷酸化R-Smad，如Smad2和Smad3，其与co-Smad（Smad4）形成同聚和异聚复合物。这些活性Smad复合物进入细胞核，在那里与靶基因结合并直接调节其转录(21,35,36). 因此，R-Smads磷酸化后转移到细胞核是TGF-β信号激活的关键步骤。不出所料，我们的结果显示，与对照组相比，TGF-β1处理的细胞中pSmad2显著增加。Ac-SDKP抑制HCF中Smad2的磷酸化，这将中断Smad2,3,4复合物的形成并阻止其进入细胞核。据报道，Ac-SDKP还阻断了大鼠心脏成纤维细胞中R-Smad的磷酸化(29)和TGF-β1处理的人系膜细胞(16). 事实上，用Smad2沉默RNA转染HCF几乎完全阻断了Smad2和tSmad2/3的磷酸化，也阻断了成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，以响应TGF-β1(9). 在这里，我们表明，在TGF-β1刺激的HCF中，Ac-SDKP阻断了R-Smad磷酸化，表明它通过抑制Smad磷酸化来部分抑制HCF向肌成纤维细胞的转化和胶原合成。
众所周知，Smad7通过与TβRI的竞争性相互作用中断TGF-β1信号传导，从而阻止TGF-(12). 因此，我们质疑Ac-SDKP是否通过作用于I-Smad Smad7来抑制TGF-β1刺激的HCF的Smad2磷酸化。我们发现，在TGF-β1暴露30分钟后，HCF的pSmad2增加，但Smad7水平与对照组相比保持不变，并且不受Ac-SDKP联合治疗的影响。因此，在TGF-β1暴露30分钟后，Ac-SDKP对Smad2激活的抑制作用不是由Smad7表达介导的。
在人类系膜细胞中，TGF-β通过自身受体直接诱导R-Smad连接区丝氨酸磷酸化，随后ERK激活，导致I型胶原合成增加。这支持了先前ERK和Smad通路之间积极相互作用的证据(13). 此外，TGF-β1已被证明直接激活ERK有丝分裂原激活蛋白（MAP）激酶信号，介导TGF-(19). 在本研究中，Ac-SDKP抑制TGF-β1刺激的HCF中ERK1/2磷酸化，表明其抑制作用可能通过抑制ERK-MAP激酶途径和/或ERK-MAP-激酶/Smad信号传导部分介导。
TGF-β1对细胞增殖的影响与细胞类型有关。尽管据报道TGF-β1刺激小鼠和大鼠心脏成纤维细胞的增殖(21,29)，其对HCF增殖的影响尚不清楚。我们发现，TGF-β1刺激的成纤维细胞增殖增加了2.5倍，在培养基中含有5%FGS时，增殖增加了一倍至5倍。Ac-SDKP抑制这些增加，但当用TGF-β1而不是血清处理细胞时，其作用较小。在新生大鼠心脏成纤维细胞中也观察到这种现象(29)，但所涉及的机制尚不清楚。值得注意的是，当细胞受到TGF-β1刺激时，Ac-SDKP的抗增殖作用似乎不如其对人心脏成纤维细胞转化或胶原合成的作用明显，这表明抑制成纤维细胞增殖在Ac-SDKP抑制纤维化中可能不起非常重要的作用。
在生理和/或病理生理条件下，血管紧张素Ⅱ（ANG II）、内皮素-1（ET-1）和转化生长因子-β1（TGF-β1）等Profibrotic和前生长因子可能以自分泌或旁分泌的方式刺激胶原蛋白的生成并诱导心肌细胞肥大(43). 心肌细胞释放的ANG II和心脏成纤维细胞和内皮细胞释放的ET-1可能作为旁分泌激素，刺激心肌细胞TGF-β1的表达(43). 尚不清楚TGF-β1是否由ET-1刺激的人心脏成纤维细胞产生和释放。我们之前报道过Ac-SDKP降低ANGⅡ诱导的高血压或心力衰竭大鼠心脏TGF-β1的表达和纤维化(26,28,32,45)并抑制ET-1刺激的大鼠心脏成纤维细胞胶原生成(33). 因此，我们假设Ac-SDKP抑制ET-1刺激的TGF-β1的生成，导致成纤维细胞成为肌成纤维细胞（这是胶原蛋白的有效生成者）。我们的研究结果表明，静止的成纤维细胞释放出显著的总TGF-β1（包括活性和潜在形式），ET-1显著增加了总TGF--β1的生成，而与Ac-SDKP同时治疗后，总TGFβ1的产生降低到正常水平。Ac-SDKP的抗纤维化作用很可能部分归因于抑制TGF-β1的生成，从而减少TGF-α1诱导的成纤维细胞增殖和分化，从而减少胶原蛋白的生成。
总之，我们相信我们的研究首次表明，在培养的人心脏成纤维细胞中，Ac-SDKP抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化以及TGF-α1信号Smad/ERK1/2的激活。这样，Ac-SDKP可能会减少心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，从而减少净胶原的生成。
视角
这些发现提供了证据，证明Ac-SDKP是人类心脏成纤维细胞中肌成纤维细胞转化和胶原产生的有效抑制剂。当接受ACEi治疗的患者血浆和/或组织中Ac-SDKP水平升高时，它可能起到内源性抗纤维化激素的作用。更重要的是，设计和合成一种对ACE或内肽酶耐药的新型Ac-SDKP类似物，应能改进治疗或预防糖尿病、高血压和其他心血管疾病患者纤维化的方法。
赠款
这项研究得到了国家心脏、肺和血液研究所拨款的支持HL-071806-01型; （N.-E.Rhaleb）和HL-028982号（O.A.Carretero）。
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