结果
缺陷PC12/h淋巴细胞杂种中神经分泌标记物的恢复
我们的第一个任务是通过融合有缺陷的PC12细胞，产生表现出神经分泌恢复的杂交克隆(Borgonovo等人，1998年;Malosio等人，1999年)，用于相关基因的细胞遗传学搜索。为此，我们使用了实验室中可用的两个有缺陷的PC12克隆，PC12-Trk(Leoni等人，1999年)和PC12–27(Borgonovo等人，1998年)与h淋巴细胞融合。根据两种DCV标记的表达或缺失，将分离的杂交克隆分为阳性克隆或阴性克隆：分泌蛋白ChgB（由我们的鼠特异性单克隆抗体识别）和膜蛋白Syt1。
A–F通过免疫荧光法比较两个标记ChgB和Syt1在DAPI染色的PC12、wt、缺陷PC12-Trk和阳性PC12-Trk/h-淋巴细胞杂种克隆中的表达。这两个标记在所有wt PC12细胞中均显著(A类,D类)并且在缺陷克隆中完全缺失(B类,电子) (Malosio等人，1999年;Leoni等人，1999年;Grundschober等人，2002年). 在杂交克隆中，结果是中间的，即对于大鼠ChgB和Syt1，尽管比wt细胞弱，但只有一部分细胞明显呈阳性，而一些细胞仅呈弱阳性，许多细胞呈完全阴性（参见C类,F类PC12-Trk/h-淋巴细胞F5c克隆）。结果类似于,C类和F类，与其他25个阳性杂交克隆一起获得，包括与其他缺陷克隆PC12–27一起产生的一些克隆。相比之下，另外52个杂交克隆完全阴性（数据未显示）。在培养的几天内，阳性杂交克隆的细胞显示出标记逐渐减少。这种不稳定性需要频繁的重新定位和特征化，这解释了当通过Western blotting分析（数据未显示）时，在杂交亚克隆群体中观察到的与wt PC12相关的两个标记水平低得多的原因。
神经分泌标记物和DCV样细胞器在缺陷PC12/h淋巴细胞杂种中的表达。A–F共聚焦免疫荧光显示DAPI染色的wt PC12中两个神经分泌标记ChgB和Syt1的表达(A类,D类)，有缺陷的PC12 Trk(B类,电子)和神经分泌标记阳性的PC12-Trk/h-淋巴细胞杂交克隆F5c(C类,F类).G公司，两个相邻的wt PC12细胞的超微结构显示大量DCV（箭头）优先沿着质膜轮廓排列（箭头）；H（H）F5c克隆杂种细胞的高尔基体区（GC），相邻细胞质中聚集着几个密度不同的DCV样细胞器（箭头）。我,J型、F5c杂交克隆细胞中不同密度的离散DCV样囊泡（箭头）的抗鼠ChgB和抗Syt1免疫金标记。注意，分泌蛋白ChgB的金颗粒集中在高尔基体区两个小泡的核心，而膜蛋白Syt1的金颗粒则主要排列在内质网（ER）池包围的小泡周围。比例尺：（英寸B类)A–F，10微米；（英寸H（H）)H（H）,G公司0.30微米；（英寸J型)J型,我0.15微米。
在超微结构水平上，wt细胞表现出众所周知的PC12表型，有许多DCV（平均直径～105 nm）(Watanabe等人，1984年)优先集中在质膜附近(G公司). 相比之下，从标记阳性杂交克隆的细胞获得的部分切片显示，只有一个或几个形状和密度可变的离散细胞器，优先集中在高尔基复合体附近(H（H）). 由于它们的大小（在随机选择的30个DCV中测量的平均直径为90±12 nm）和密度，这些细胞器可能是神经分泌小泡。为了确认其性质，还通过免疫金标记对其进行了研究。我显示了一个细胞，其中两个细胞器，一个类似于DCV，另一个包含在TGN池的扩张中，显示出由抗鼠ChgB单克隆抗体标记的核心强免疫金标记。J型图中显示了另一个杂交细胞，其外围有两个更清晰的细胞器免疫金标记，由抗Syt1单克隆抗体标记。我们得出结论，在阳性克隆中，一部分细胞表达DCV样细胞器。此外，由于这些细胞器的ChgB被鼠特异性单克隆抗体标记，因此它只能由PC12编码，而不能由h淋巴细胞基因编码。
所有标记阳性的杂交克隆都保留了人类11号染色体（11p11-12）的一个片段
神经分泌标记阳性的杂交克隆的研究是在细胞遗传学水平上进行的，目的是描述其人类染色体（h染色体）的特征。显示荧光就地典型大鼠杂交（FISH）结果(A类)和人类(B类)中期平板，以杂交F5c克隆DNA中的Alu-PCR产物为探针，作为模板(Antonacci等人，1995年).C类显示了各种神经分泌阳性和阴性杂交克隆的结果摘要。阳性克隆显示出不同的人类染色体片段模式，包括在所有情况下，11号染色体（11p11-12，箭头B类). 相反，这个片段在阴性克隆中总是缺失的(C类).
中期FISH和BAC分析。A类,B类分别用阳性杂交F5c克隆DNA中的Alu-PCR产物作为探针，对一只大鼠和一只人类中期进行杂交。箭头在A类表示杂交克隆中存在的h染色体片段B类指向人类中期的11号染色体。C类总结了10个克隆的FISH结果，6个神经分泌标记阳性，4个阴性。请注意，所有阳性克隆都显示了h染色体11短臂的着丝粒周围片段（如箭头所示B类; 以粗体显示C类)缺少所有阴性克隆。D类,电子，利用11号染色体着丝粒周围片段中的两个BAC定位，两个中期杂交（箭头；插图中放大）。F类列出了最相关的阳性（粗体和下划线）和阴性BAC，用于界定标记阳性杂种中保留的染色体11p片段（用红色标记）。
各种BAC被用作FISH探针，以更好地表征11p11-12区域的延伸。D–F型总结了两个标记阳性克隆的结果。已知最着丝粒和端粒阳性BAC之间的区域（～9 Mb，跨越区域chr11:40987373–50404139；UCSC基因组浏览器，2006年3月发布）包括13897个EST和122个基因。其中BHC80型该基因定位于chr11:45910693–46099305，编码BHC的一个蛋白成员，BHC是已知介导REST转录抑制的复合物之一。因此BHC80型选择与标记阳性杂交克隆的神经分泌恢复相关的候选基因。
BHC80的表达和分布
的表达式休息和BHC80型这些基因首先在PC12、wt和缺陷基因以及杂交克隆中进行了表征。A类表明，类似于休息PC12-27缺陷克隆中报告的mRNA(D'Alessandro等人，2008年)PC12-Trk和阳性杂交克隆F5c中观察到的水平(A类)在所有其他检测出的阳性PC12-Trk/h-淋巴细胞克隆（数据未显示）中，其比wt PC12高约80倍。这一结果排除了与h淋巴细胞融合以减少休息杂交细胞中的基因表达。
BHC80基因的表达和蛋白质在wt和缺陷PC12、PC12-Trk/h-淋巴细胞杂种和其他细胞类型中的分布。A类显示了两个缺陷PC12克隆（PC12-27和PC12-TrkA）中REST mRNA相对于wt PC12的更高水平，以及阳性杂交克隆PC12-Trk/h-淋巴细胞F5c中REST高水平的持续存在；B类BHC80 mRNA水平，wt PC12高于缺陷PC12-Trk和阴性杂交克隆G4c，阳性克隆F5c高于缺陷克隆40%；C类PCR扩增h-BHC80 cDNA片段，证明h-BHC80mRNA在阳性杂交克隆F5c中表达，而在wt PC12、缺陷PC12-Trk和阴性克隆G4c中不表达。D类,电子显示BHC80蛋白在各种细胞类型中的表达，在wt PC12和另一种神经分泌细胞系胰岛素释放INS-1E系中以较小的剪接形式BHC80–4为主(D类)；在两个缺陷PC12-27和PC12-Trk中，较大形式BHC80-6的优势(D类). 在两个阳性杂交克隆F5c和F4a中(电子)，主要形式也是BHC80-6，其水平明显高于来源细胞、PC12-Trk和人类淋巴细胞（淋巴）（分别为4-5倍和10倍以上）。另一种非神经分泌细胞系，肌肉L6(D类)，也显示出BHC80–6，但其水平远低于PC12克隆的水平。BHC80总水平的相对定量，显示在D类,电子，是至少三个实验的平均值。F类显示亚细胞分馏结果，证明在wt和缺陷PC12中，BHC80与组蛋白H2B一起定位在细胞核中，而不是与β-微管蛋白（β-tub）一起定位在细胞质中。DAPI标记的BHC80–6在PC12–27细胞核中的定位也通过免疫荧光得到证实(G公司). 比例尺，（inG公司)3微米。
的mRNABHC80型重量PC12约为缺陷PC12-Trk的三倍(B类)以及PC12–27（数据未显示）。标记阳性的PC12-Trk/h-淋巴细胞杂交克隆F5c比两个缺陷PC12-Trk和PC12-27显著增加（0.40倍），而阴性杂交克隆G4c没有变化(B类). 阳性杂交克隆中BHC80 mRNA的增加至少部分归因于人类mRNA的表达，而阴性克隆中缺乏人类mRNA(，比较克隆F5c和G4c）。
在PC12细胞中，BHC80蛋白以两种形式表达，类似于之前在小鼠和人类细胞中描述的剪接形式(Hakimi等人，2002年;Iwase等人，2004年). 其中，较小的BHC80-4（明显的Mr～80 kDa）在wt PC12和另一神经分泌细胞INS-1E中占主导地位，而BHC80-6（明显的M～92 kDa(D类)和其他非神经分泌细胞（数据未显示）。同样，BHC80-6是由h淋巴细胞和所有杂交克隆表达的形式，无论是阴性（数据未显示）还是阳性神经分泌标记物（F5c和F4a）(电子). 定量地说，在阳性杂交克隆中，蛋白质水平显著高于缺陷PC12克隆中的蛋白质水平（4-5倍）(电子，比较F5c和F4a与PC12-Trk），很可能是因为它们同时表达人类和大鼠基因。相反，阴性克隆中的水平与缺陷PC12中的水平相同（数据未显示）。亚细胞组分的Western blotting显示，在细胞内，BHC80-4和BHC80-6都集中在细胞核中(F类)和免疫荧光(G公司).
BHC80 cDNA的转染
PC12-Trk/h-淋巴细胞杂交克隆的结果表明，神经分泌标记物的再现是由BHC80的增加所介导的。为了生成可直接研究此问题的工具，在PC12-27缺陷克隆中进行了人BHC80（h-BHC80）标记cDNA瞬时转染实验，其中cDNA转染更成功，在PC12–27/DBD中，稳定表达REST显性阴性结构的PC12–27克隆(Bruce等人，2006年;D'Alessandro等人，2008年). 在PC12–27/DBD细胞中，REST抑制减弱，神经分泌基因产物的恢复可变，缺陷PC12中的神经分泌基因产品被显著抑制（VAMP2，Stx1a）或甚至大幅度抑制（Syp1，Syt1，SNAP25）。相反，即使在PC12-27/DBD克隆中，对REST阻遏最敏感的ChgB基因的表达也不明显(D'Alessandro等人，2008年).
鉴于BHC80存在两种剪接形式，利用转染h-BHC80–6标记或h-BHC80-4标记cDNA的PC12–27细胞进行了一系列初步实验，以确定对神经分泌基因表达的可能差异影响。然而，没有观察到差异效应[比较补充图1的mRNA水平（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）A类,B类，关于分别转染h-BHC80-6-标记和h-BHC80-4-标记cDNA的PC12–27和PC12–27/DBD细胞]。因此，这里只报告了用一个cDNA获得的数据，即h-BHC80–4标记的数据。A类显示，当PC12–27/DBD细胞的制剂用不同量（0.07、0.4和4μg）的h-BHC80–4-flag cDNA转染时，PC12–27细胞及其DBD克隆中的REST蛋白水平相同，并且几乎保持不变。BHC80–4蛋白，PC12–27中几乎完全缺失(D类,F类,A类)和PC12–27/DBD(A类,B类)，在转染0.07μg h-BHC80–4-flag cDNA后没有显著增加(A类)然而，在转染0.4和4μg(A类). 由于转染细胞中出现毒性迹象，因此无法使用更多的cDNA（数据未显示）。因此，使用转染了4μg cDNA的细胞进行了许多后续实验。B类在PC12–27和PC12–27/DBD细胞中显示了转染的BHC80–4标记（由反标记抗体（左）显示）和相同的蛋白质以及内源性BHC80-6标记（由抗BHC-80抗体（右）显示）。注意，在这两种细胞类型中，转染蛋白和内源性蛋白达到的水平非常接近(B类). 亚细胞分馏和免疫荧光显示，转染蛋白（通过其标记识别）与内源性对应物具有相同的定位，即几乎完全分布于细胞核（参见PC12–27/DBD细胞的结果C类,D类).
转染后BHC80在缺陷PC12-27中的表达。A类，在转染的PC12–27/DBD细胞中，BHC80–4的增加水平因所用cDNA的量而异：在用0.07μg转染的细胞中不明显，用0.4μg转染的细胞几乎不明显，用4μg转染的细胞清晰可见。在所有转染细胞中，REST水平保持不变。B类PC12–27和PC12–27/DBD细胞中转染的h-BHC80–4标记物的水平，由抗标记抗体单独显示（左），以及由抗BHC80抗体显示的内源性BHC80-6水平（右）。注意，在后者中，内源性和转染BHC80的水平大致相同。C类,D类，转染的BHC80–4标记定位于细胞核（连同内源性BHC80-6，F类,G公司)亚细胞分馏结果表明C类通过免疫荧光D类（DAPI标记的细胞核）显示同一单层的两个PC12–27/DBD细胞，只有一个（左下）转染，另一个（右上）BHC80–4标记为阴性。结果，如C类,D类也通过转染PC12-27获得（数据未显示）。所示的定量结果是至少三个实验的平均值±标准偏差。比例尺，（inC类)3微米。
与h-BHC80-4-flag和GFP的cDNA共转染的PC12-27和PC12-27/DBD细胞中神经分泌标记物的恢复。A类,B类、与h-BHC80-4-flag和GFP cDNA（各4μg）共转染并经FACS富集的PC12-27和PC12-27/DBD细胞制备过程中神经分泌基因mRNA的增加。在PC12–27中(A类)转染的效果在基因之间是可变的。面板中显示的显著增加的mRNA是由对REST不太敏感的基因编码的。其他mRNA的轻微增加未显示。在PC12–27/DBD细胞中(B类)，通过转染BHC80–4-flag/GFP，所研究的神经分泌mRNA均显著增加（从0.5倍增加到10倍）。仅GFP无效（数据未显示）。C类,D类，显著增加（如C类并通过以下定量数据进行总结D类)PC12–27/DBD细胞的BHC80转染也在蛋白水平上诱导。注意，即使是在未转染的细胞中不被抑制的ChgB，也达到了很小但很容易检测到的水平(C类,D类)，足以通过免疫荧光显示为离散的细胞质斑点，在未转染的中不明显(Ea公司)在BHC80–4鞭毛阳性细胞中非常明显，细胞核被DAPI标记(欧洲银行).F类，用BHC80 cDNA转染PC12–27/DBD细胞后，两种神经分泌标志物SNAP25和ChgB表达的差异依赖性。SNAP25，在未转染的PC12–27/DBD细胞中已经明显存在（另见C类,D类)在转染0.4μg cDNA的细胞中已加倍，在4μg时进一步增加；ChgB仅在转染4μg cDNA的细胞中明显可见。所示的定量结果是至少三个实验±SD的平均值A类,B类,D类是由于结果的高度一致性造成的。比例尺：（inEa公司)Ea公司,欧洲银行，3微米。
BHC80调节神经分泌基因的表达
PC12–27和PC12–27/DBD细胞群体，用4μg h-BHC80–4-flag和GFP cDNA瞬时共转染，然后通过FACS分选富集，用于研究神经分泌基因的表达。如图所示A类各种此类基因的mRNA，ICA512公司,VAMP2型,Stx1a标准,拉布3a在缺陷PC12–27中已显著表达，在BHC80–4标记转染后显著增加，甚至达到wt PC12水平。PC12-27中完全或在很大程度上缺乏mRNA(更改B,系统1,国民账户体系25,Scg2号机组)转染后也发生了变化，但变化幅度很小（数据未显示）。
当BHC80–4标记转染PC12–27/DBD细胞，然后用上述FACS进行富集时，神经分泌mRNA的水平增加甚至超过PC12–27细胞，达到远高于或接近wt PC12的水平(B类，右侧）。在同一细胞中，PC12-27中BHC80–4标记转染未影响的mRNA也显著增加：国民账户体系25超过五倍；的系统1，～3倍；的Scg2号机组0.5倍。甚至mRNA更改B，在PC12–27/DBD细胞中几乎不明显(D'Alessandro等人，2008年)，转染BHC80–4标记后变得明显(B类，左）。
h-BHC80–4-flag cDNA的转染也诱导了神经分泌蛋白的明显增加，这在通过FACS分选富集的PC12–27/DBD细胞中不是明显可见的。用4μg cDNA获得的总体结果部分通过Western blotC类在数量上D类PC12–27/DBD细胞中的蛋白质已经显示出接近wt PC12的值，例如VAMP2（数据未显示）和Stx1a(C类,D类（右），BHC80–4标记转染仅略微增加。相比之下，ICA512在PC12–27/DBD细胞中表现出低蛋白水平(D'Alessandro等人，2008年)，显著增加，达到wt水平以上的值(C类,D类，右侧）。在PC12–27/DBD中，Syt1、SNAP25和Syp1在mRNA和蛋白质水平上的表达非常低，从2.5倍增加到4倍(C类,D类，左）。就ChgB而言，相对于wt PC12达到的水平较低（另见C类)然而，足够揭示（通过免疫细胞化学）细胞质斑点的数量(欧洲银行)PC12–27/DBD细胞缺乏(Ea公司). 有趣的是，用不同数量的BHC80–4标记cDNA对细胞进行并行转染得到的结果表明，神经分泌蛋白的重现性随细胞摄取cDNA的水平而变化。不同蛋白质的依赖性不同。例如，SNAP25在0.4时已显著增加，在4μg cDNA时进一步增加，而ChgB需要最高数量的cDNA才能明显增加(F类).
REST/BHC80与RE-1阳性基因关联的ChIP和免疫缺失分析
迄今为止报道的结果表明，REST对神经分泌基因表达的抑制是由BHC80调节的。这种效应是由REST阻遏系统中两种蛋白的结合引起的还是间接机制引起的，尚不清楚。为了研究REST和BHC80在单个RE-1基因上的可能关联，进行了ChIP实验。来自低REST wt PC12和高REST缺陷PC12-27细胞的交叉染色质制剂与抗REST和抗BHC80 Abs并行免疫沉淀。颗粒中富集了两个众所周知的含RE-1的基因，即编码更改B和国民账户体系25都对REST抑制敏感，但程度不同(D'Alessandro等人，2008年)，通过qPCR进行评估。,A类和B类，显示ChIP结果。在wt PC12中，这两个基因出现了不同的敏感性，因为更改B抗REST抗体沉淀的染色质中的基因数量很大，而国民账户体系25基因大约小了两倍(A类). 抗BHC80抗体的富集与抗REST抗体的富集没有显著差异(A类). 这些结果是特异性的，因为不相关的Ab（抗uPAR）不能诱导任何显著的沉淀，而不相关的序列（NSE公司)既不是由抗REST沉淀，也不是由抗BHC80和抗uPAR沉淀(A类). 此外，通过使用切换的抗体测试抗REST和抗BHC80 ChIP上清液进行的免疫耗竭实验未能诱导这两个基因进一步沉淀（数据未显示），表明在这两种情况下，与REST结合的组分大多与BHC80相关，反之亦然。
ChIP显示，在wt和缺陷PC12细胞克隆中，REST和BHC80与RE-1基因相互作用。A类指wt PC12并显示更改B和国民账户体系25基因ChIP结果。注意，抗REST和抗BHC80的免疫沉淀诱导了这两个基因的大量富集（19.3倍和23.5倍更改B基因；9.6倍和14倍国民账户体系25基因），远高于用对照抗体、抗uPAR获得的抗体。A类对，另一个基因的无关区域，即NSE公司三个Abs。B类、ChIP结果更改B和国民账户体系25缺陷PC12-27细胞的基因。注意，抗REST诱导了这两个基因的大量富集（72.3倍和43.5倍），而抗BHC80未能诱导任何明显的沉淀，证明这两个因子在更改B和国民账户体系25基因。对照Ab anti-uPAR与NSE无关区(B类)没有明显的降水。C类比较BHC80 ChIP结果更改B和国民账户体系25来自wt和缺陷PC12的基因，以及从瞬时转染BHC80的缺陷PC12细胞中获得的基因。注意，BHC80转染在PC12-27和PC12-27/DBD细胞中诱导了与这两个基因相关的BHC80的显著富集，相反，两者之间没有显著差异。BHC80转染细胞获得的完整ChIP和免疫缺失结果如补充图2和3所示，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料。
在有缺陷的PC12-27细胞中，结果大不相同。两者的丰富性更改B和按扣25由抗REST抗体免疫沉淀的染色质中的基因比在wt PC12中观察到的基因大得多（3.6倍和几乎5倍）。相反，使用抗BHC80抗体，未观察到两个基因的明显ChIP(B类). 同样，在这种情况下，结果是特异性的，因为三个被调查的序列没有与非特异性抗uPAR抗体沉淀，并且没有富集无关的国家安全委员会三种抗体的基因序列(B类). 在免疫耗竭实验中，抗REST从抗BHC80 ChIP上清液中诱导了两个基因的大量富集，而抗BHC80Ab免疫沉淀则没有从抗REST ChIP上清中获得这两个基因（数据未显示）。
对转染了BHC80型cDNA，使用未转染细胞作为参考（参见补充图2和3，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料，还包括含有抗uPAR抗体和NSE公司序列）。PC12–27/DBD细胞的结果与PC12–27细胞的结果几乎相同，即两者的大量免疫沉淀更改B和国民账户体系25抗REST抗体诱导的基因（补充图2和3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），抗BHC80抗体无明显免疫沉淀(C类). 然而，当用BHC80转染PC12-27和PC12-27/DBD细胞时，ChgB和SNAP25的免疫沉淀显著(C类)与wt PC12相比，抗BHC80抗体的基因再次出现，分别达到23和50%的水平（补充图2和3中的完整数据，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。总的来说，ChIP和免疫耗竭结果证明，在以极低REST为特征的wt PC12中，BHC80和阻遏物与分析的相对较低的更改B和国民账户体系25基因。相反，在富含REST的PC12-27和PC12-27/DBD细胞中，通过ChIP技术，BHC80与丰富相关阻遏物的可能共结合仍然不明显，但当转染后BHC80水平增加时，在有限的范围内再次出现。
转染BHC80的PC12-27/DBD细胞中ChgB的调节性释放
细胞液中ChgB的表达和ChgB阳性细胞器的出现并不能证明BHC80转染PC12-27/DBD细胞后重新建立了调节的神经分泌。事实上，ChgB可能并不是针对其生理细胞间室，即调节神经分泌的细胞间室的，而是针对其他细胞器，例如普遍存在的构成性释放途径的囊泡。为了确定ChgB阳性细胞器的性质并确定其可能释放的特性，我们使用了两种方法。一方面，我们研究了ChgB的细胞周转。当一种分泌蛋白被分类到组成性排出的细胞器中时，它的释放速度很快，甚至从静止的细胞中也能释放出来(t吨(1/2)～1小时，Malosio等人，2004年;D'Alessandro等人，2008年)；相反，当它被储存在由调节性胞吐释放的细胞器中时，蛋白质在静止时保持稳定，只有在适当的细胞刺激后才能释放。表明，在转染BHC80并在蛋白合成阻滞剂环己酰亚胺存在下孵育的PC12-27/DBD细胞中，尽管ChgB的水平远低于wt-PC12，但在6小时内保持稳定(A类). 这不包括构成性释放的ChgB。相反，在用钙刺激wt细胞和转染细胞后，释放了30-50%的ChgB2+离子载体，离子霉素（2μ米，15分钟）(B类). 第二种方法是免疫细胞化学。DCV胞吐后，部分排出的ChgB会附着在细胞表面一段时间。这是用离子霉素刺激PC12-27/DBD/BHC80细胞的情况(，比较D类至未刺激的PC12–27/DBD/BHC80细胞C类). 我们的结论是，在转染的PC12–27/DBD细胞中，储存ChgB的细胞器能够调节胞吐，这是真实DCV的典型特性。
转染BHC80的PC12-27/DBD细胞通过调节性胞吐发生ChgB释放。在A类在4个6 cm培养皿中瞬时转染BHC80（4μg cDNA）的wt PC12和PC12–27/DBD细胞单层在37°C下与环己酰亚胺（20μg/ml）平行培养6 h，以阻止蛋白质合成，而不施加任何刺激。在指定的时间点，去除单个培养皿，将单层膜溶解并通过Western blotting进行处理。通过定量特定带确定ChgB的数量。请注意，在这些静息状态下，wt和PC12–27/DBD/BHC80细胞的ChgB水平（表示为0时间wt PC12水平的百分比）在培养过程中保持不变，即，两个细胞单层中没有明显的成分释放。所示数据为三个实验的平均值±SD。B类，在KRH缓冲液中悬浮wt PC12和暂时转染BHC80的PC12–27/DBD细胞，如上所述，仅在添加溶剂（DMSO，1.5μl）或含有Ca的溶剂后培养15分钟2+离子载体，离子霉素（2μ米). 注意，在两种细胞悬液中，药物诱导的ChgB大幅下降，这是一种调节释放反应。所示数据以暴露于二甲基亚砜的样品百分比表示，是三个实验±SD的平均值。C类,D类，两个PC12–27/DBD/BHC80单层细胞的ChgB表面免疫标记，一个暴露于二甲基亚砜(C类)另一种是离子霉素B类然而，持续2分钟(D类). 请注意，受刺激细胞沿其表面（箭头）显示出清晰的标签，而静止细胞几乎完全为表面阴性。比例尺：（inC类)C类,D类，3微米。
讨论
这项工作是为了研究神经分泌的调控机制，从与其他细胞类型异源融合后神经分泌在缺陷的高REST PC12中的再现开始(Malosio等人，1999年). 为了进行细胞遗传学研究，选择产生新的杂交克隆系的细胞是h淋巴细胞。我们的结果首先排除了神经分泌恢复归因于REST减少的可能性。事实上，在所有阳性杂交克隆中，阻遏物的水平与缺陷PC12中一样高。因此，我们认为恢复的可能性是由于负REST调制，依赖于人类基因编码的因子。基于细胞遗传学分析，我们确定了BHC80的候选基因编码，BHC80是BHC的一个成员，包含植物同源结构域锌指结构域。BHC是一种结合REST C末端结构域的复合物，据报道，它包括其他复合物中也存在的各种蛋白质（Co-REST、HDAC1、HDAC2、LSD1），以及两种特定蛋白质BRAF35和BHC80。其功能是将阻遏物与其靶基因的结合转化为表观遗传信号(Hakimi等人，2002年;Iwase等人，2004年;Shi等人，2005年;Lan等人，2007年).
BHC80过度表达对REST的抑制并不是全新的。在之前的一项研究中，BHC80的转染被发现可以缓解含有RE-1报告质粒的REST依赖性抑制，而BHC复合物的其他成分BRAF35和HDAC1的共同转染则可以消除这种抑制作用(Hakimi等人，2002年). 基于这些结果，BHC80被认为是一种支架蛋白，当过度表达时，可诱导抑制BHC复合物(Hakimi等人，2002年;Iwase等人，2004年). 然而，最近的研究中出现了一种更具体的机制。BHC80和BHC复合物的另一种成分组蛋白去甲基化酶LSD1在与DNA的结合方面相互依赖(Shi等人，2005年;Lan等人，2007年). 然而，BHC80的功能作用仍存在争议。在无细胞系统中，BHC80可诱导LSD1的剂量依赖性抑制(Shi等人，2005年)而在HeLa细胞中，发现它可以诱导酶活性的增强，这可能是通过增强LSD1与其组蛋白H3靶点的关联来介导的(Lan等人，2007年).
迄今为止，为确定BHC80的作用而进行的研究存在一个问题，这取决于该蛋白在不同细胞和器官中的差异表达。特别是，BHC80在大脑中含量高，其中REST含量低，许多含RE-1的基因高表达，而在许多外周器官和非神经、富含REST的细胞中含量低，其中含RE-1的基因被抑制(Iwase等人，2004年和2006). 由于这些截然不同的条件，很难确定在非神经细胞中获得的结果如何在神经元中工作。在这里，我们使用了神经细胞模型PC12、wt和神经分泌缺陷的克隆。这种差异是由于它们REST的表达差异很大（在缺陷克隆中高出60到80倍）(Pance等人，2006年;D'Alessandro等人，2008年). 相反，BHC80的水平相近，在wt和缺陷克隆中分别以小剪接形式BHC80-4和BHC80-6为主。在功能上，这两种拼接形式似乎是多余的(Iwase等人，2004年)（另见本研究的初步数据）。因此，将wt和缺陷克隆平行用于研究BHC80在REST水平差异较大的细胞中的作用。
神经分泌基因的表达，通过其mRNA的再现或增加显示，尤其是那些由对REST最不敏感的基因编码的基因(VAMP2型,ICA512公司,拉布3a) (D'Alessandro等人，2008年)用BHC80瞬时转染缺陷PC12后观察到。然而，在这些细胞中，相应的蛋白质及其胞外细胞器DCV仍然微不足道。因此，在神经分泌方面，转染BHC80的PC12-27细胞可能与杂交细胞不同，尽管神经分泌蛋白的平均水平很低，但一些细胞显示出由对REST高度敏感的基因编码的蛋白，如ChgB和Syt1，以及DCV。然而，应该强调的是，由于h染色体的不稳定性，杂交后代是h-BHC80阳性细胞和阴性细胞的混合体。因此，最有可能的是，与转染细胞相比，显示DCV和神经分泌蛋白的杂交细胞的总BHC80更丰富，而转染细胞在FACS选择后，均为外源性BHC80阳性。当使用的缺陷PC12表达REST（DBD）的显性阴性结构时，BHC80转染的结果发生了变化，已知该结构通过竞争RE-1结合减弱阻遏物的作用。在这些PC12-27/DBD细胞中，BHC80转染前也存在一些神经分泌蛋白，但ChgB和DCV完全缺乏(D'Alessandro等人，2008年). 转染BHC80后，一个明显完整的神经分泌表型重新出现，包括DCV及其调节性胞吐，与真正的PC12细胞的神经分泌型相似，尽管不太明显。
关于BHC80在wt和缺陷PC12中调节神经分泌表达的机制的提示，来自对两个基因的ChIP和染色质免疫耗竭分析，这两个基因对REST抑制高度敏感，但对REST抑制的敏感性不同：ChgB最高，SNAP25不太明显。出乎意料的是，我们发现，在这两个基因中，BHC80在wt和缺陷细胞中的关联显著不同。在wt细胞中，与基因结合的相对较低的REST在很大程度上与BHC80有关；在缺陷细胞中，没有检测到明显的BHC80与两个基因结合的更大的REST分数相关。通过用BHC80转染的缺陷PC12获得的结果证实了关联的变化在抑制中起作用的可能性，其中观察到BHC80与两个分析的基因明显明显明显的关联。相反，显性阴性REST结构DBD的表达既没有改变缺陷PC12中两个基因中观察到的BHC80相关性缺失，也没有改变BHC80转染后观察到的它们的相关性。这些结果证实DBD和BHC80通过不同的机制影响REST基因的抑制：DBD情况下RE-1结合的直接竞争(Bruce等人，2006年:D'Alessandro等人，2008年)；BHC80对其转导的调节。
总之，我们的结果是通过在mRNA/蛋白质和细胞水平上研究神经分泌PC12细胞系特征克隆中一组单细胞过程神经分泌特异性基因的表达而获得的，这为BHC80对REST基因阻遏的调节提供了直接证据。然而，基于无细胞和非神经细胞的研究，以前曾提出过这种类型的过程(Hakimi等人，2002年;岩濑等人，2004年;Shi等人，2005年;Lan等人，2007年). 此外，我们还表明，BHC80与REST的关联及其随后的调节作用取决于这两个因子表达的相互水平，这一发现似乎与先前由Hakimi等人（2002年）在HeLa细胞中。我们的结果应该与最近发现REST基因抑制的其他结果一起考虑，它们比之前设想的开/关系统更清晰。特别是，介导不同基因抑制的REST复合体被证明包含不同的辅因子，即使在同一细胞中也是如此(Greenway等人，2007年;Mulligan等人，2008年). 此外，在干细胞向神经细胞分化的过程中，REST与其他转录因子和辅阻遏物的组合调控表现出不同(Sun等人，2005年;Johnson等人，2008年). 我们的研究首次提供了相同细胞系克隆中单个基因的REST转导差异的证据，尽管它们的REST表达水平差异很大。在这些细胞中，BHC80的表达是组成性的还是调节性的尚不清楚。然而，可以假设，在特定条件下，BHC80表达的变化有助于调节REST功能。鉴于阻遏物及其相关复合物在基因表达中的关键作用，BHC80的调节可能对细胞生理学和病理学产生深远影响。
