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方法分子生物学。作者手稿；PMC 2010年1月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
方法分子生物学。2009; 497:167–186。
数字对象标识：10.1007/978-1-59745-566-4_11
预防性维修识别码：项目经理2739043
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院124911
PMID：19107417

SUMO结合酶的纯化及底物结合动力学分析

阿里·尤努斯和克里斯托弗·利马*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

SUMO与蛋白质底物的结合需要一种专用的E2泛素结合酶（Ubc9）和相关的E3连接酶的协同作用。虽然Ubc9可以直接识别和修饰SUMO修饰共识位点内的底物赖氨酸残基，但E3连接酶可以在体外和体内SUMO偶联期间重定向特异性并提高接合率。在本章中，我们将描述用于纯化SUMO结合酶的方法和可用于体外分析SUMO接合的模型底物。我们还将描述在E3依赖或E3依赖底物共轭期间提取动力学参数的方法。

1.简介

泛素（Ub）和泛素样（Ubl）蛋白质对底物进行翻译后共价修饰可以通过影响蛋白质稳定性、催化活性或通过重定向蛋白质在细胞内的定位来改变目标底物的活性(1–6)Ub/Ubl修饰剂对底物的修饰是通过至少三种酶或因子E1、E2和E3的顺序作用进行的(1)Ub/Ubl首先由蛋白酶处理，以显示一个保守的二甘氨酸基序，随后在ATP依赖反应中被E1腺苷化。然后将Ub/Ubl转移到保守的E1半胱氨酸残基上，形成E1~Ub/Ubl加合物（其中~表示硫酯键）。然后将E1~Ub/Ubl转移到保守的E2活性位点半胱氨酸残基上，形成E2~Ub/Ubl加合物。然后将Ub/Ubl修饰剂从E2~Ub/Ubl加合物转移到底物赖氨酸残基上，在Ub/Ubl C-末端甘氨酸和底物赖氨酸残基的ε-胺原子之间形成稳定的异肽键。E3连接酶可以通过提高转移速率或改变底物特异性来促进底物与E2~Ub/Ubl之间的反应。

SUMO是Ubl蛋白质家族的成员。酵母编码一个名为Smt3的SUMO同源序列，而人类编码四个名为SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4的SUMO-同源序列。尚不清楚SUMO-4是否具有共轭能力。SUMO激活需要一个专用的异二聚体E1（Aos1/Uba2或SAE1/SAE2）、一个E2酶（Ubc9）和至少两个不同的SUMO E3连接酶家族。Ubc9可以直接与含有可访问的共有基序Φ-K-x-E/D的SUMO底物相互作用并对其进行修饰，其中Φ是疏水性的，K是连接到SUMO的赖氨酸，x是任何氨基酸，E或D是酸性残基(7,8). 尽管SUMO E3连接酶增强了SUMO在体内外的结合，但许多SUMO底物可以在体外以E3依赖的方式结合。此外，SUMO E3在体外和体内修饰时可以赋予额外的底物特异性。SUMO E3连接酶有两个已知家族。SP-RING E3连接酶与泛素环E3具有有限的序列相似性，并且包括来自酵母（Siz1、Siz2、Mms21和Zip3）和高等真核生物中人类PIAS蛋白家族的成员(9——16). RanBP2/Nup358蛋白包含第二类SUMO E3连接酶，与RING或HECT E3连合酶家族无关(17——19).

最近对SUMO结合相关酶的分析阐明了E2-和E3-依赖反应中SUMO偶联的生化和结构基础。我们将描述用于分离SUMO结合酶的程序，以及提取E3依赖和E3依赖反应中SUMO接合动力学参数的方法。

2.材料

2.1蛋白质表达和纯化

  1. Luria-Bertani（LB）培养基：10g杆菌胰蛋白胨，10g氯化钠，5g杆菌酵母提取物，置于1L水中。
  2. 超级肉汤（SB）培养基：32g胰蛋白酶，20g酵母提取物，5L水中的5g NaCl。
  3. 抗生素：氨苄西林，200 mg/ml，水中，过滤器消毒；卡那霉素，50 mg/ml溶于水中，过滤器消毒；氯霉素，34 mg/ml乙醇溶液。
  4. 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）：水中1 M，过滤器消毒。
  5. 质粒：pET-15b、pET-11c、pET-28b和pET-21b（Novagen）。pSMT3和TOPO-SMT3（见注1）。
  6. 细菌菌株：大肠杆菌BL21（DE3）RIL Codon Plus（Stratagene）或大肠杆菌BL21（DE3）pLysS（诺瓦根）。
  7. 发酵：BioFlo-3000发酵罐，配备14 L容器（新不伦瑞克）。
  8. 定点突变：QuikChange突变试剂盒（Stratagene）。
  9. 荧光：Alexa Fluor 488 C5马来酰亚胺染料（分子探针；Invitrogen）。
  10. PCR引物（Invitrogen）；聚合酶（Pfu turbo；Strategene）。
  11. 牛凝血酶（Sigma）：1 U/μl（0.33μg/μl）存于20 mM Tris-HCl pH 8.0、350 mM NaCl、1 mM BME或水中，并储存在−20°C下。
  12. Ulp1蛋白酶催化结构域（氨基酸403–621）：3 mg/ml，在20 mM Tris-HCl中，pH 8.0，350 mM NaCl，1 mMβ-巯基乙醇（BME），10%甘油，−80°C。
  13. 悬浮缓冲液：20%蔗糖，50 mM Tris-HCl pH 8.0。
  14. 溶解缓冲液：20%蔗糖、50 mM Tris pH 8.0、1 mM BME、350 mM NaCl、20 mM咪唑、20μg/ml溶菌酶、100μg/ml DNAse I、1 mM-苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.1%IGEPAL CA-630（Sigma）。
  15. Ni-NTA超流琼脂糖树脂（Qiagen）。
  16. 缓冲液A:20 mM Tris-HCl pH 8.0、350 mM NaCl、1 mM BME和20 mM咪唑。
  17. 缓冲液B:20mM Tris-HCl pH 8.0、350mM NaCl、1mM BME和400mM咪唑。
  18. 缓冲液C:20 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl和1 mM BME。
  19. 缓冲液D:20 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl和1 mM BME。
  20. 缓冲液E:20 mM Tris-HCl pH 8.0、1 M NaCl和1 mM BME。
  21. 缓冲液F:20 mM Tris-HCl pH 8.0、350 mM NaCl和1 mM BME。
  22. 缓冲液G：20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl和1 mM BME。
  23. AKTA-FPLC（GE Healthcare）配备凝胶过滤柱（Superdex-75 26/60和Superdex-200 26/60）和离子交换柱（Mono-Q 10/10和Mono-S 10/10）（见注2）。
  24. 具有适当分子量截止值（10 kDa、30 kDa或50 kDa）的Centricon或Centriprep微过滤装置（Amicon）。
  25. Bradford试剂（Bio-Rad）或BCA蛋白质分析试剂（Pierce）。

2.2 SUMO结合分析

  1. 脱盐柱：Micro-Bio-Spin Bio-gel P-6（Bio-Rad）。
  2. 缓冲液I：20 mM HEPES pH 7.5，50 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.1%（v/v）吐温-20。
  3. 缓冲液II：50 mM柠檬酸钠，pH 5.5，50 mM氯化钠，5%甘油。
  4. 缓冲液III：20 mM HEPES pH 7.5，50 mM NaCl，0.1%v/v Tween-20，5 mM EDTA。
  5. 缓冲液IV：50 mM Tris-HCl pH 6.8、2%十二烷基硫酸钠、4 M尿素、10%甘油和0.25%溴酚蓝。
  6. 缓冲液V:50mM柠檬酸钠，pH 6.8，75mM氯化钠，5mM氯化镁2.
  7. 缓冲液VI:20mM HEPES pH 7.5，50mM NaCl。
  8. 缓冲液VII:20 mM双三丙烷（pH值范围为7.07至10.6），50 mM氯化钠，0.1%v/v吐温-20，5 mM EDTA。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

  1. 使用MES或MOPS运行缓冲区（Invitrogen）进行SDS-PAGE分析的NuPAGE系统（Invit罗gen）。
  2. 4–12%梯度聚丙烯酰胺双三凝胶（Invitrogen）。

2.4蛋白质检测和分析

  1. 转移缓冲液：1x Tris甘氨酸（Genemate；ISC Bioexpress）缓冲液，含20%甲醇。
  2. 清洗缓冲液：磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，2.7 mM氯化钾，137 mM氯化钠；Sigma）和0.1%吐温-20（Bio-rad）。
  3. 封闭缓冲液：PBS中3%（w/v）的脱脂干乳。
  4. 免疫斑点™PVDF膜（BioRad）。
  5. 初级抗体：在封闭缓冲液中以1:1000稀释使用的抗人SUMO-1（Boston Biochem）抗体。
  6. 二级抗体：在封闭缓冲液中以1:2500稀释使用的抗抗体IgG辣根过氧化物酶连接的整体抗体（驴；GE Healthcare）。
  7. 转斑点半干电泳转移细胞（Bio-Rad）。
  8. 增强化学发光（ECL）+试剂（GE Healthcare）。
  9. 成像western blots：富士胶片LAS3000化学发光检测器。
  10. 图像处理和数据量化：Multi Gauge v2.02或Image Gauge v4.0（富士胶片）。

2.5蛋白质检测和荧光分析

  1. 富士胶片FLA-5000带FITC过滤器。
  2. 图像处理和数据量化：Multi-Gauge v2.02或Image Gauge v4.0（富士胶片）。

2.6数据处理

  1. 原始数据用EXCEL（Microsoft）进行处理。
  2. 数据和回归分析：SigmaPlot 9.0（Systat Software Inc.）。

3.方法

3.1人和酵母E1（Aos1/Uba2）的克隆和纯化

  1. SUMO的E1酶是异二聚体，由两个单独编码的多肽组成，即Aos1和Uba2（也称为人类E1的SAE1和SAE2）。分别从人cDNA或酵母基因组DNA中扩增人或酵母基因。
  2. 用5′NcoI和3′BamHI将酵母Aos1亚基克隆到pET-15b中，用5′钕eI和3’BamHI.将人Aos1亚基克隆到了pET-11c中。在这两种情况下，Aos1编码为天然多肽。
  3. 分别用5′NheI和3′XhoI或5′NdeI和3’HindIII将全长人和酵母Uba2克隆到pET-28b中，编码融合到N末端凝血酶可裂解His的多肽6-标签。
  4. 设计引物分别使用5′BglII和3′SalI或5′NdeI和3′XhoI扩增人和酵母Uba2的C末端截短型（ΔC末端；人1–549；酵母1–554）。
  5. 编码各自E1亚单位（Aos1、Uba2或Uba2ΔC-term）的两个质粒被共同转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL Codon Plus。
  6. 通过37°C发酵培养10 L培养物至A6003.0，通过添加IPTG至最终浓度1 mM诱导，并在30°C下生长3小时。
  7. 通过离心（7000×g）收集细胞，将细胞颗粒悬浮在悬浮缓冲液中，最终浓度为2 ml/g细胞湿重。细胞悬浮液可以储存在−80°C下，以便在液氮中快速冷冻悬浮细胞后使用。
  8. 在超声处理之前，将冷冻的细胞颗粒解冻并在裂解缓冲液中平衡。
  9. 通过超声波破碎细胞，通过离心（40000×g）澄清细胞裂解液，以获得无细胞碎片的上清液（见注释3）。
  10. 将裂解液应用于装有Ni-NTA树脂的色谱柱上，并在用缓冲液B洗脱之前使用至少5个缓冲液a柱体积进行洗涤。异二聚体E1酶通过His分离6-Uba2上的标签。收集组分并通过SDS-PAGE进行分析。蛋白质含量通过Bradford分析进行量化。
  11. 用SDS-PAGE分析蛋白质组分，将含有E1的蛋白质组分合并到缓冲液F中的凝胶过滤柱（Superdex-200）中。SUMO E1异二聚体以单分散峰的形式迁移，表观分子量约为120 kDa。
  12. 通过SDS-PAGE分析馏分，将含有E1的馏分混合，脱盐到缓冲液D中，并应用于阴离子交换柱（Mono-Q）。使用梯度从缓冲液D洗脱到50%缓冲液E洗脱20个柱体积的蛋白质。SUMO E1在约200–250 mM NaCl下洗脱。
  13. 通过SDS-PAGE分析馏分，并将含有E1的馏分混合，脱盐至缓冲液H中，浓缩至约10 mg/ml，在液氮中快速冷冻并储存在−80°C下（见注释7）。

3.2人和酵母Ubc9的克隆和纯化

  1. 设计用于扩增人和酵母UBC9开放阅读框的引物，分别包括NdeI和XhoI在5′端和3′端的限制性位点。
  2. 分别从人cDNA和酵母基因组DNA中扩增出人和酵母UBC9。酵母UBC9在5′端附近含有一个内含子，因此5′引物被设计为包含5′外显子。
  3. PCR产物用适当的限制性内切酶消化，并连接到pET-28b质粒中，编码与凝血酶可裂解六组氨酸标签融合的Ubc9 N末端。
  4. 通过定点诱变产生含有点突变K153R的酵母UBC9。该Ubc9亚型将用于后面描述的分析。
  5. 质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL Codon Plus。
  6. 2 L LB培养物在37°C的有挡板的摇瓶中培养至A600为1.0。将培养物冷却至30°C，并将IPTG添加至最终浓度1 mM。然后在30°C下培养培养物3小时。
  7. 如第3.1节所述，收集细胞，处理细胞颗粒进行超声处理，并将裂解液涂敷在Ni-NTA树脂上。
  8. 来自2升培养物的裂解液含有大约100毫克的His6-Ubc9，需要约10 ml Ni-NTA树脂。
  9. 合并含有Ubc9的组分。他的6-以牛凝血酶与蛋白质的1:1000（w/w）比孵育去除凝血酶可裂解多肽。通过SDS-PAGE监测蛋白水解程度。
  10. 蛋白质水解完成后（室温下2-4小时或4°C下过夜），将样品应用于缓冲液F中的凝胶过滤（Superdex-75）。Ubc9作为表观分子量约为20 kDa的单分散蛋白质迁移。通过SDS-PAGE分析组分，并将含有Ubc9的组分合并，透析或脱盐到缓冲液C中。将该混合物加载到阳离子交换树脂（Mono-S）上，并使用梯度从缓冲液C到50%缓冲液E洗脱20个柱体积的蛋白质。Ubc9在约150 mM NaCl下从MonoS中洗脱。将含有蛋白质峰的组分交换到缓冲液C中，并浓缩至5–10 mg/ml。
  11. 将蛋白质在−80°C的液氮中液化并快速冷冻，以备日后使用。

3.3人SUMO-1和酵母SUMO（Smt3）的克隆、纯化和荧光标记

在本节中，我们讨论了SUMO-1和Smt3天然和突变亚型的纯化方案。我们还讨论了用Alexa Fluor 488 C标记突变SUMO蛋白的程序5马来酰亚胺染料共价且不可逆地修饰半胱氨酸残基。产生突变异构体（SUMO-1 K9C和Smt3 K11C）以引入半胱氨酸残基。野生型Smt3不含半胱氨酸残基，尽管人类SUMO-1在52位含有半胱氨酸残留。该残基通过改变SUMO-1 K9C结构中的相应密码子突变为丙氨酸。K9C和K11C位于结构无序的N末端结构域。我们和其他人已经确定，在SUMO激活或SUMO与底物结合期间，该区域的缺失没有可检测到的有害影响。这些标记的SUMO蛋白将用于文中所述的后续分析。

3.3.1加工人SUMO-1的纯化

  1. 按照详述内源性底物蛋白水解的章节（Reverter和Lima）所述，克隆并纯化了带有C末端六组氨酸标签的全长SUMO-1。
  2. 通过定点突变获得了含有点突变K9C的人SUMO-1亚型。

3.3.2精制Smt3 K11C

  1. 使用NcoI和XhoI限制性位点将酵母SMT3插入pET-28b，以C末端His编码SMT36-标签。
  2. 通过定点突变获得含有点突变K11C的Smt3亚型。
  3. 用于表达野生型和突变型Smt3蛋白的质粒被转化为大肠杆菌BL21（DE3）肽。
  4. 菌株在37°C的LB培养基中生长至外径1.0，然后添加IPTG至最终浓度1 mM。培养物在30°C下额外生长3小时。
  5. 如上所述对细胞颗粒进行超声处理（第3.1节）。
  6. 将裂解液用于缓冲液A中的Ni-NTA树脂，并从缓冲液B中的色谱柱中洗脱。
  7. 拆除C端子His6-tag，将含有该蛋白质的组分与Ulp1蛋白酶以1:1000（w/w）的比例在室温下培养2-4小时或在4°C下培养过夜。
  8. 将该混合物用于缓冲液F中的凝胶过滤（Superdex-75）。Smt3以表观分子量接近20kDa的单分散峰洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，将含有Smt3的级分合并并脱盐到缓冲液C中，并将其应用于阴离子交换树脂（Mono-Q）。在20个柱体积上，使用从缓冲液C到50%缓冲液E的梯度从柱中洗脱Smt3。Smt3在~150 mM NaCl下洗脱。
  9. 通过SDS-PAGE分析馏分，将含有Smt3的馏分合并，浓缩至约4 mg/ml，使用液氮快速冷冻，并储存在−80°C下以备将来使用。

3.3.3用Alexa Fluor 488 C标记SUMO K9C或Smt3 K11C5马来酰亚胺

  1. 300μM Smt3 K11C或SUMO-1 K9C（~4 mg/ml）与10摩尔过量的Alexa Fluor 488 C孵育5马来酰亚胺染料。
  2. 以滴加方式将染料添加到蛋白质溶液中，并在4°C下培养过夜。
  3. 将混合物涂在脱盐柱上，使反应停止，多余的染料被去除，脱盐柱与缓冲液D平衡。
  4. 将所得混合物浓缩至至少1 mg/ml，在液氮中快速冷冻，并储存在−80°C下以备日后使用。

3.4 SUMO底物的克隆和纯化

3.4.1人p53 C末端结构域的克隆和纯化

  1. 设计引物克隆人类p53的C末端四聚体结构域（残基320-393），作为与Smt3的C末端融合。用pSMT3克隆PCR扩增的ORF。
  2. 质粒DNA转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL Codon Plus细胞。
  3. 通过在37°C下发酵至A培养基培养10 L培养物6003.0，通过添加IPTG至最终浓度1 mM诱导，并在30°C下额外生长3小时。
  4. 按照前面的描述处理细胞颗粒（第3.1节）。
  5. 将裂解液应用于Ni-NTA树脂，该树脂与缓冲液A预平衡。蛋白质用缓冲液B洗脱。
  6. 通过SDS-PAGE和含有His的组分进行分析6-Smt3-p53在Ulp1蛋白酶（1:1000 w/w）存在下通过透析或缓冲液G中的脱盐进行混合和平衡，以从His中释放p536-Smt3标记。透析和卵裂可以通过在4°C下过夜培养或在室温下培养3-4小时脱盐后同时进行。在进行第7步之前，通过SDS-PAGE评估卵裂程度。
  7. 将样品应用于阳离子交换树脂（Mono-S）上，并使用梯度从缓冲液G到50%缓冲液E，在20个柱体积上进行洗脱。人p53在~325 mM NaCl下洗脱。他的6-Smt3标签不与MonoS树脂相互作用。
  8. 将含有p53的组分应用于缓冲液F中的凝胶过滤（Superdex-75）。以表观分子量约32kDa的四聚体形式洗脱C-末端p53结构域。将含有p53的组分混合，脱盐到缓冲液D中，浓缩至~6 mg/ml，混匀，冷冻在液氮中，并储存在−80°C。

3.4.2酵母PCNA（K127G）的克隆和纯化

  1. 设计引物用Pfu涡轮聚合酶从酵母基因组DNA扩增野生型PCNA。引物包括分别位于基因5′端或3′端的NdeI和XhoI限制性位点。
  2. PCR产物用适当的限制性内切酶消化，并连接到pET-21b，以编码酵母PCNA，无任何亲和标记。
  3. 非感官赖氨酸残基（K164）是Siz1依赖性SUMO修饰PCNA的主要位点(21,22). 然而，在一些体外和体内条件下的Ubc9-dedendent反应中，少量SUMO修饰产物积聚在SUMO共识位点（K127）内的赖氨酸残基上。为了简化E3介导的K164偶联反应的动力学分析，我们将该侧链突变为甘氨酸，这是在其他PCNA家族成员中观察到的残基。K127G PCNA突变是通过定点突变引入的。
  4. 携带PCNA的质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL Codon Plus。
  5. 通过37°C至A的发酵培养10 L培养物6003.0，调整到1 mM的IPTG浓度，并在30°C下再生长3小时。
  6. 细胞培养物按照上述方法进行处理（第3.1节）。
  7. 用于蛋白质纯化的细胞颗粒分批处理，相当于约4 L的细菌培养物。
  8. 将固体硫酸铵缓慢添加到上清液中，搅拌至45%饱和度，从可溶性部分纯化PCNA。通过7500×g离心30分钟去除沉淀物质。回收上清液，进行第二次硫酸铵沉淀，使其达到70%的饱和度。沉淀物质中含有主要种类的酵母PCNA（经SDS-PAGE分析确认）。将该部分悬浮在缓冲液F中，并在4°C下对同一缓冲液进行通宵透析。
  9. 将该混合物应用于缓冲液F中的凝胶过滤（Superdex-200）。通过SDS-PAGE分析含有酵母PCNA的馏分，将其混合，并与缓冲液C进行透析。
  10. 将该混合物应用于阴离子交换树脂（Mono-Q），并使用梯度从缓冲液C到50%缓冲液E，在20个柱体积上洗脱PCNA。PCNA在约300 mM NaCl下洗脱。通过SDS-PAGE分析含有PCNA的峰馏分，汇总，浓缩至约3 mg/ml（根据BCA蛋白质分析估计），在液氮中快速冷冻，并储存在−80°C。

3.5 SUMO E3连接酶的克隆和纯化

3.5.1 RanBP2/Nup358IR1的克隆和纯化

  1. 使用TOPO-SMT3载体克隆Nup358/RanBP2（残基2632-2695）(19). 这个Nup358/RanBP2片段被命名为IR1*。
  2. 质粒被转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）RIL Codon Plus。
  3. 2 L LB培养物在37°C至A的温度下生长600将IPTG添加至最终浓度1mM之前。培养物在30°C下培养3-4小时。
  4. 伊斯6-通过将混合物应用于缓冲液A中的Ni-NTA树脂，从细胞裂解液中纯化Smt3-Nup3586-Smt3-Nup358从缓冲液B中的树脂中洗脱。
  5. 将样品应用于缓冲液F和含有His的组分中的凝胶过滤（Superdex-75）6-Smt3-Nup358通过SDS-PAGE、pooled和His进行分析6-Smt3标签通过孵化His从IR1*中解放出来6-Smt3-Nup358与Ulp1的比率分别为1000:1（w/w）。
  6. 样品在6 M盐酸胍中变性，并应用于Ni-NTA树脂以去除His6-Smt3标记。Nup358 IR1*被收集在流通级分中。
  7. 通过将混合物应用于与缓冲液F平衡的脱盐柱中，去除样品中的盐酸胍，缓冲液F中的BME被2 mM DTT取代。然后将样品应用于缓冲液F中的凝胶过滤（Superdex-75）。
  8. 通过SDS-PAGE分析含有Nup358 IR1*的馏分，将其混合，浓缩至5–10 mg/ml，在液氮中快速冷冻，并储存在−80°C下。

3.5.2酵母E3连接酶Siz1的克隆和纯化

  1. 通过PCR从酵母基因组DNA中扩增编码E3连接酶活性的最小Siz1片段（残基172-443），并使用定向TOPO-SMT3载体进行克隆。
  2. 质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL Codon Plus。
  3. 通过37°C至A的发酵培养10 L培养物600在30°C下诱导蛋白表达3-4小时，添加IPTG至最终浓度1 mM。
  4. 如前所述，对细胞培养物进行储存和超声处理（第3.1节）。
  5. 裂解液用于缓冲液A和His中的Ni-NTA树脂6-使用缓冲液B从色谱柱中洗脱Smt3-Siz1。
  6. 通过SDS-PAGE分析组分，并对含有His的组分进行分析6-将Smt3-Siz1混合并与缓冲液F进行透析。将Ulp1蛋白酶以蛋白质与Ulp1的1000:1（w:w）比例添加到混合物中，并在4°C下培养过夜。
  7. 移除他的6-将混合物Smt3应用于缓冲液A中的新鲜Ni-NTA树脂。Siz1在流通馏分中回收。
  8. 将含有Siz1的组分混合，并应用于缓冲液F中的凝胶过滤（Superdex-200）。Siz1以表观分子量约35 kDa的单分散峰迁移。通过SDS-PAGE分析组分，将含有Siz1的组分合并，并与缓冲液C进行透析。
  9. 将含有Siz1的部分应用于缓冲液C中的阳离子交换树脂（Mono-S）中，并通过从缓冲液C到50%缓冲液E的梯度进行洗脱。Siz1在约125 mM NaCl下洗脱。
  10. 通过SDS-PAGE对组分进行分析，将含有Siz1的组分合并，浓缩至15 mg/ml，在液氮中快速冷冻，并储存在−80°C下。

3.6单循环条件下底物结合物的测定

在SUMO、底物、镁和ATP存在的情况下，仅使用E1和E2（Ubc9）就可以将SUMO偶联到许多底物上。这些分析包含试剂的复杂混合物，每个反应物必须与至少一个或多个其他反应物相互作用。因此，在多次翻转条件下，在底物结合期间提取相关动力学参数仍然很困难。为了解决这个问题，我们使用了单一周转分析来检测SUMO结合。这是通过使用E1、E2、SUMO和ATP在没有E3和底物的情况下分离Ubc9~SUMO（其中“~”表示硫酯加合物）来实现的。在本节中，我们描述了在存在或不存在E3连接酶的情况下，使用Ubc9~SUMO结合底物滴定进行单循环分析的方法。我们还将描述在共轭期间确定pK值的方法。此外，我们将描述从这些分析中提取动力学参数的方法。

3.6.1 Ubc9-SUMO硫代酯的制备及人SUMO结合系统的单周转结合分析

3.6.1.1利用天然SUMO-1进行分析
  1. Ubc9~SUMO加合物的形成是在1μM E1、10μM成熟SUMO-1和5μM Ubc9的反应缓冲液I中进行的。
  2. 通过添加10μM ATP启动反应，并在37°C下培养20分钟。
  3. 通过将混合物应用于与缓冲液II平衡的脱盐柱中，去除镁和多余的ATP，使反应停止。缓冲液II的较低pH值增加了Ubc9~SUMO在−80°C下长期储存的稳定性。
  4. 将0.6μl Ubc9~SUMO添加到带底物的反应缓冲液III（反应体积：50μl）中进行单次翻转反应。这通常会导致最终Ubc9~SUMO浓度在5-20 nM之间。在这种情况下，我们在37°C或4°C下使用了浓度为2μM至94μM的人p53 C末端结构域（见上文）。这些分析也在IR1*（一种SUMO E3连接酶）存在下进行，浓度为60 nM。含有E3连接酶的反应在4°C下进行，因为反应太快，无法在较高温度下重复测量速率。
  5. 在不同的时间点（每个基质浓度至少3个时间点）取出样品，并通过添加缓冲液IV进行淬火，用液氮速冻，并储存在−80°C下。
  6. 反应产物通过在MES缓冲液中以180v的恒定电压进行非还原性SDS-PAGE分离60分钟，然后转移到PVDF膜（见注释4）。半干转移在室温下在20V下进行40分钟。
  7. PVDF膜在室温下封闭1小时，或在封闭缓冲液中在4°C下隔夜。
  8. 在室温下用抗人SUMO-1的一级抗体在封闭缓冲液中探测PVDF膜1小时或在4°C下过夜。
  9. 用Wash缓冲液清洗PVDF膜30分钟，并更换三次缓冲液，以去除多余的未结合初级抗体。
  10. 然后将PVDF膜与二级抗体在室温下孵育1小时。通过在洗涤缓冲液中冲洗3次，去除多余的二级抗体。
  11. PVDF膜与ECL-Plus试剂孵育，并使用LAS-3000化学发光检测器成像(图1A)（见注释5）。
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    Ubc9介导的SUMO与人p53结合

    (A类)在用SDS-PAGE分离并用抗SUMO-1抗体检测后，在不同p53浓度下，对SUMO从E2-SUMO硫酯转移到人类p53的C末端四聚体结构域进行单循环分析的时间进程。(B类)图A中的数据通过线性回归分析计算不同p53浓度下的反应速率。(C类)反应速率（Y轴）根据不同的p53浓度（X轴）绘制，数据拟合成形式为Y=ax/（b+X）的矩形双曲线。数据点表示三个独立实验的平均值，误差条表示一个标准偏差。

  12. 使用MultiGauge v2.02或ImageGauge v4.0处理图像并量化数据。
  13. 用EXCEL处理原始数据，利用线性回归分析提取不同底物浓度下的反应速率(图1B).
  14. 随后使用在不同底物浓度下获得的初始速率值，通过将数据非线性拟合到双参数矩形双曲函数来导出最大速率和表观离解常数(图1C)（见注6）。用于拟合数据的双曲函数的形式为v=v最大值[S] /（Kd日+[S]），其中V最大值=k2[英]t、，k个2是速率常数，[E]t吨是E2-SUMO硫代酯浓度，Kd日是表观解离常数，[S]是底物浓度。表观速率常数k2可以通过除以V来计算最大值由[E]t吨.
  15. E2~SUMO的浓度（[E]t吨)通过量化E2~SUMO相对于已知输入SUMO-1浓度的分数来确定。在共轭反应中，E2~SUMO的最终浓度在5-20nM之间，具体取决于分析条件和制备日期。

3.6.1.2使用和不使用E3的Ubc9~SUMO-1的pH滴定分析
  1. 反应在4°C下进行，因为在较高pH条件下的反应速度太快，无法在22°C或37°C下重复测量。
  2. Ubc9~SUMO硫代酯的生成如3.6.1.1所述。
  3. 如第3.6.1.1节所述，在不同pH值下进行单次周转分析，但在缓冲液VII中进行，以便于在广泛的pH范围内进行分析。
  4. 在没有IR1*的情况下，将人p53作为pH分析的底物，在94μM和1μM的情况下使用p53进行分析。按照上一节所述对反应进行分析和处理(图2A和2B).
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    pH滴定及Ubc9介导的SUMO与人p53结合分析

    (A类)经SDS-PAGE分离并用抗SUMO-1抗体检测后，在4°C的不同pH值下，在94μM单循环条件下SUMO与p53结合的时间过程。(B类)A中的数据用图形表示，以计算不同pH值下的反应速率。通过线性回归分析计算反应速率。(C类)初始反应速率（Y轴）绘制为pH值的函数，数据符合S形函数（详见正文）。垂直线表示半衰期的pH值（可滴定组的pK）。数据点表示两次独立实验的平均值，误差条表示一个标准偏差。

  5. pH滴定数据符合L型的S形函数H（H）=（L哈【H】+]+升A类-K） /（K+[H+])（其中LH（H）是特定pH值下的反应速率；L（左）哈和LA类-是表示反应基团的酸或碱形式对反应速率的贡献的常数；K是酸离解的平衡常数；和L哈=0，如果只有基本形式的物种有助于反应速率）。通过非线性曲线拟合估算可滴定组的pK(8,23).

3.6.1.3使用标记SUMO-1的Alexa Fluor 488进行结合分析
  1. Ubc9~SUMO硫酯在37°C的缓冲液V中用0.27μM E1、12.5μM Alexa Fluor 488标记SUMO-1和33μM Ubc9生成。通过向最终浓度为5 mM的ATP中添加ATP来启动反应。
  2. 通过将反应施加到与缓冲液II平衡的脱盐柱上，以去除多余的镁和ATP，从而终止反应。将混合物稀释3.3倍，得到3.8μM的最终SUMO浓度和10μM的最后Ubc9浓度，在液氮中速冻，并在−80°C下储存，直到再次使用。
  3. 在存在或不存在SUMO E3连接酶IR1*的情况下，通过向50μl反应缓冲液VI中添加0.6μl的E2~SUMO和浓度为512μM至0.25μM的人p53，启动SUMO与人p53的单转换偶联。100 nM时E3连接酶反应含有IR1*。
  4. 在不同的时间点（每个浓度至少3个时间点）取出样品，并通过添加缓冲液IV进行淬火。样品在液氮中快速冷冻，并在−80°C下储存，直至分析。
  5. 反应物通过非还原性SDS-PAGE进行分解，并立即用FLA-5000成像以缓解凝胶中的扩散。用蓝色激光（473nm）激发Alexa 488荧光团，并通过FITC滤波器检测荧光信号。
  6. 图像和数据处理的方式与第3.6.1.1节中描述的化学发光分析类似。

3.6.2 Ubc9~SUMO的制备和酵母SUMO结合系统的单循环结合分析

3.6.2.1使用Alexa Fluor 488 C进行结合分析5-马来酰亚胺标记的Smt3
  1. 酵母Ubc9~Smt3硫酯的形成如上文所述（第3.6.1.3节）。
  2. 反应混合物包括缓冲液V与0.27μM酵母E1、12.5μM Alexa Fluor 488标记的Smt3K11C和33μM酵母Ubc9，其中包含K153R点突变，以抑制SUMO与K153处E2的自结合。
  3. 通过向最终浓度为5 mM的溶液中添加ATP来启动反应。
  4. 通过将反应施加到与缓冲液II平衡的脱盐柱上，以去除多余的镁和ATP，从而抑制反应。将混合物稀释3.3倍，得到3.8μM的最终Smt3浓度和10μM的最终Ubc9浓度，在液氮中快速冷冻，并储存在−80°C下以备将来使用。
  5. 将0.6μl的E2-Smt3硫代酯反应添加到50μl的缓冲液VI中，在Siz1（172–443）存在下，PCNA K127G与PCNA在40μM至2.5μM浓度范围内进行单翻转偶联。
  6. 在秒到分钟的时间点（每个浓度至少2个时间点）取出等分样品，并通过添加缓冲液IV进行淬火。用液氮快速冷冻样品。
  7. 按照第3.6.1.3节所述对反应产物进行解析、成像和处理(图3)
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    Siz1-dependent Smt3-Alexa-Fluor 488与酵母PCNA的结合

    (A类)通过SDS-PAGE分离并检测荧光信号后，在不同PCNA浓度下，对Smt3从E2~Smt3硫酯转移到酵母PCNA突变株K127G的单一周转分析的时间进程。(B类)A中的数据用图形表示，用线性回归分析计算不同底物浓度下的反应速率。(C类)根据不同酵母PCNA浓度绘制初始反应速率（Y轴），数据拟合成形式为Y=ax/（b+x）的矩形双曲线。数据点表示三个独立实验的平均值，误差条表示一个标准偏差。

4.注意事项

  1. pSMT3载体来源于pET-28b，包括N末端六组氨酸融合酿酒酵母Smt3公司(20). pSMT3可以将感兴趣的基因克隆到MCS中，通常使用BamHI位点将感兴趣蛋白（POI）与N末端His融合6-Smt3多肽生成His6-Smt3-gly-gly-er-POI融合多肽。然后，可以使用Ulp1蛋白酶将His6-Smt3从感兴趣的蛋白质C末端切割为Smt3二甘氨酸序列，以用非天然N末端丝氨酸残基释放POI。TOPO-SMT3载体基于pSMT3，但定制的TOPO-适应于促进定向皮瓣结扎（TOPO-由Invitrogen适应）。N-末端Smt3与蛋白质的融合可以增强难以表达的蛋白质的表达和溶解性。
  2. 为了确保再现性并保护色谱柱免受磨损，所有色谱步骤均使用由MilliQ（Millipore）水或等效物制备的过滤缓冲溶液进行。所有缓冲液在使用前应在真空下脱气至少1小时。
  3. 所有蛋白质纯化均在4°C下进行，以避免降解和/或聚集。在应用于色谱介质之前，所有蛋白质制剂都要经过0.2μm的过滤器。所有蛋白质在储存于−80°C之前均在液氮中闪速冷冻。
  4. 虽然免疫印迹和检测提供了足够的信号来量化蛋白质带，但蛋白质向PVDF膜的不均匀转移可能会导致实质性伪影。建议每个实验使用重复的凝胶和转移步骤，以确保再现性。
  5. 信号的集成需要正确的背景选择。
  6. 对于动力学参数的提取，重要的是在底物浓度下获得至少比结合常数高十倍的速度，以确保反应接近饱和。
  7. SUMO结合酶容易氧化和损伤。制备完成后，酶应小批量校准，以避免重复冻融循环。

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