生物化学杂志。2009年1月23日；284(4): 1982–1989.
妊娠期胆碱供应调节组蛋白H3的甲基化，组蛋白甲基转移酶G9a（Kmt1c）和Suv39h1（Kmt1a）的表达，以及大鼠胎肝及其相关基因的DNA甲基化大脑*
波士顿大学医学院病理学和实验医学系马萨诸塞州波士顿市医学院02118
1信件收件人：病理和实验室部门波士顿大学医学院医学院，东康科德街72号，L804，马萨诸塞州波士顿，邮编02118。电话：617-638-4829；传真：617-638-5400；电子邮件：ude.ub@atzsulbj. 收到日期：2008年10月3日；2008年11月10日修订
摘要
胆碱是一种必需的营养素，通过其代谢物甜菜碱发挥作用作为胎儿发育中使用的甲基的供体表观遗传DNA和组蛋白甲基化模式。补充胆碱在胚胎期（E）11-17天，大鼠的记忆能力提高成年后可防止与年龄相关的记忆力下降，而胆碱缺陷会损害某些认知功能。我们之前报道过胆碱缺乏胎儿的整体和基因特异性DNA甲基化增加大脑和肝脏，这些DNA甲基化的变化与DNA表达的明显补偿性上调甲基转移酶Dnmt1型在当前的研究中，喂养怀孕大鼠含有不同量胆碱的饮食（mmol/kg：0（缺乏），8（对照组）或36（补充组）），以及组蛋白指数E17检测肝脏和额叶皮层的甲基化。信使核糖核酸和组蛋白甲基转移酶G9a和Suv39h1的蛋白表达直接与胆碱的可用性有关。DNA甲基化G9a公司和Suv39h1号机组胆碱缺乏导致基因上调，提示这些酶的表达受到甲基化的负控制他们的基因。H3K9Me2和H3K27Me3的水平，转录标签被抑制的染色质被胆碱补充上调，而与活性启动子相关的H3K4Me2水平在胆碱缺乏大鼠。这些数据表明，母亲在妊娠改变胎儿组蛋白和DNA甲基化，表明协调的表观遗传学机制有助于长期发育不同胆碱摄入量的影响子宫内.
胆碱是一种基本营养素，在母亲的饮食中有充足的供应怀孕期间对胎儿的正常发育至关重要(1)，以及对人类的研究(2)和动物(三–6)表明其在妊娠期的摄入对中枢神经系统的正常发育和功能。例如，在使用怀孕大鼠或小鼠的后代食用仅在下半年的一周内，胆碱含量发生变化妊娠（E11–17），2胆碱缺乏会导致某些记忆任务受损(7)，而胆碱补充营养可以提高记忆力和注意力(7–14)值得注意的是，它可以防止与年龄相关的记忆力下降(三,5,14). 除了行为胆碱可用性改变改变胎儿海马细胞增殖(15,16)，凋亡(17)、和差异化(18,19). 高E11–17胆碱摄入增加成人基底前脑胆碱能神经元的大小(20)并增强乙酰胆碱储存(14)和释放(21)，提升大脑脑源性神经营养素神经生长因子的浓度神经营养因子和NT3(22–24)IGF2及其受体IGF2R(25)，降低刺激长时程增强诱导阈值(26,27)，并增强去极化诱导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）磷酸化(8)在出生后的海马体。此外，产前补充胆碱的动物的特征是出生后海马和大脑皮层基因表达模式发育和成年(28)并有增厚成人海马神经发生(23).
胆碱是某些磷脂的代谢前体(例如磷脂酰胆碱）和神经递质乙酰胆碱(三). 然而，它作为甲基供体可能是理解这种方法的关键营养导致行为、神经解剖和电生理产前补充剂和缺乏。胆碱成为酶的甲基来源胆碱脱氢酶催化氧化制甜菜碱后的甲基化(29). 后一种化合物可以用于同型半胱氨酸转化为蛋氨酸，随后S公司-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）(29)反过来，这就是大多数生物甲基化反应的甲基供体，包括DNA CpG二核苷酸序列中胞苷的甲基化组蛋白赖氨酸和精氨酸残基的甲基化(30).
我们之前报道过，肝脏和大脑中的AdoMet水平升高E17胎儿的皮层，其母亲自年以来一直食用补充胆碱的饮食E11号机组(31). 令人惊讶的是，然而，选定基因组位点的全球DNA甲基化和甲基化已知可以调节转录，即的DMR2区域胰岛素样生长因子2(免疫球蛋白2)基因，增加于胆碱缺乏动物。值得注意的是，DNA甲基化的这些变化与明显的代偿性上调表达相关DNA甲基转移酶1(Dnmt1型)(31). 此外，mRNA另一种DNA甲基转移酶在大脑和肝脏中的表达，Dnmt3a型甲基CpG-结合域2的(兆比特2)蛋白质as以及大脑DNA甲基转移酶，Dnmt3l型，则相反与胆碱摄入量相关(31). 其他调查人员也据报道，胆碱摄入量的改变导致全球和通过甲基可用性的改变实现基因特异性DNA甲基化(32–34),在小鼠模型中，妊娠期摄入的食物中作为代谢甲基供体和辅因子（胆碱、，甜菜碱、蛋氨酸、叶酸和维生素B12)影响与相关基因超甲基化相关的后代表型基因(35–37).
组蛋白尾部在特定赖氨酸和精氨酸残基上的甲基化对于转录、细胞分裂、，异染色质的形成(38–40).组蛋白中甲基的添加根据残留物被甲基化。组蛋白3（H3K4）上赖氨酸4的甲基化是与转录活性基因相关(41–43),而组蛋白3上赖氨酸9和赖氨酸27的甲基化（H3K9和H3K27，分别）与转录抑制相关(44,45). 此外，学位某些残基的甲基化对染色质产生不同的影响状态。H3K9的ε-氨基上添加两个甲基为期间常染色区转录抑制的特征发展(46)，而同一残基的三甲基化与心周相关异染色质(45,47). 催化的酶这些修饰也与组蛋白甲基转移酶G9a不同（KMT1C，EHMT2）负责H3K9到H3K9Me2的二甲基化H3K27三甲基化为H3K27Me3(48)，和组蛋白甲基转移酶Suv39h1（KMT1A）负责H3K9到H3K9Me3型(49).
因此，除了调节DNA甲基化外，胆碱供应还可以影响组蛋白尾部氨基酸残基甲基化(50,51)，导致生长发育相关基因的表达。我们检查了E17肝脏中组蛋白3甲基化机制的几个成分不同剂量摄入母体的大鼠胎儿大脑皮层胆碱。H3K9和H3K27的甲基化以及G9a和Suv39h1与胆碱的可用性直接相关。符合我们以前的研究G9a公司和Suv39h1号机组胆碱缺乏显著上调了基因表达。后一个发现指出这些组蛋白的表达可能甲基转移酶受其甲基化的负控制基因。
实验程序
胚胎期饮食干预E11–E17-几组怀孕的Sprague-Dawley大鼠每个饮食组分为三组，每组四只动物E11-17期间补充胆碱、控制或缺乏胆碱的饮食妊娠期（AIN-76A啮齿动物净化饮食（染料公司））。不同于商业胆碱含量不受控制的大鼠，AIN-76A饮食是配方允许使用营养充足的饮食进行标准化研究大鼠和小鼠(52,53). 胆碱供应于胆碱补充饮食中的食物（如氯化胆碱）含有36mmol/kg胆碱，对照饮食中有8mmol/kg胆碱缺乏的饮食中胆碱含量为0 mmol/kg。The consumption of the孕期缺乏胆碱的饮食导致50%以上母体胆碱和磷胆碱库的减少(54). 这些动物被安置在家里单独进行12小时光/暗循环。平均产仔数不是受饮食影响（缺乏，12.4；控制，12.1；补充，12.1每只母鼠的胎儿）。所有动物程序均按照波士顿大学医学院批准的方案动物保护和使用委员会。
胚胎肝和额叶皮质的解剖-孕妇在一氧化碳麻醉后于E17进行安乐死2,将子宫切开，置于L15培养基（Invitrogen）中的冰上。这个从胚胎中分离出额顶叶皮层，使组织保持在用冰块将验尸后的变化降至最低。因为E17的额叶皮层不是但完全分化后，取整个额叶顶叶皮层，不包括嗅球。每个母亲四个胚胎的皮质是收集、合并并用于所有后续实验。对于肝脏，一部分对胚胎肝右叶进行了解剖。八个人的肝脏每个母亲的胚胎都被收集、汇集，并在随后的所有过程中使用实验。饮食对婴儿的平均体重没有影响肝脏或大脑（数据未显示）。数据来源于材料（DNA、RNA和蛋白质）从每个饮食组的四只怀孕动物中获得。
基因组DNA和总RNA的分离-对于DNA，组织是立即在干冰上冷冻，并在-70°C下储存，直至提取。为了从肝脏中获得高产量的纯基因组DNA，genomic tip 100/G按照制造商的协议使用试剂盒（Qiagen）。对于正面使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）制造商的协议。DNA浓度通过260nm分光光度法。
对于RNA，立即使用针头和注射器将组织均质化在冰柜中4米异硫氰酸胍溶液，pH 7.0，含100m米β-巯基乙醇和25 m米柠檬酸钠，置于干冰上，然后在-70°C下储存。核糖核酸用苯酚/氯仿法提取(55)，用沉淀乙醇，再悬浮在无核水中（Ambion），并用RiboGreen RNA定量试剂盒（分子探针）使用Victor3多标签平板阅读器（PerkinElmer Life Sciences）。
逆转录酶-PCR-反向分析RNA使用上标一步RT-PCR和铂Taq的转录酶PCR（Invitrogen）根据制造商的说明。第一链cDNA用10 ng RNA、寡核苷酸（dT）引物和反向引物进行合成转录酶在48°C下保持45分钟。使用以下引物集：G9a公司，正向，5′-CAA GGA TGG TGA GGT CTA CTG C-3′；反向，5′-GCT CTT GAT ATC CCA GAA CCG-3′；Suv39h1号机组,正向，5′-ATC CCT GCA CAA GTT TGC C-3′；反向，5′-TTTGCG GAT CTT TTC CAG C-3′；β-肌动蛋白，向前，5′-CACAGC TGA GAG GGA AAT C-3′；反向，5′-TCA GCA ATG CCT GGGTAC-3′。PCR在94°C下变性2分钟然后在94°C下进行34次循环，每次1分钟，58°C下1分钟70°C，在72°C下延伸7分钟反应条件被确定为在化验。产物在10%Tris缓冲EDTA聚丙烯酰胺上进行分解凝胶并用溴化乙锭染色。每个波段的强度为使用Kodak ID软件通过Kodak Image Station进行量化。表达式水平计算为正常化后对照组的百分比β-肌动蛋白.
免疫印迹法-E17皮层和肝脏的组织提取物通过添加裂解缓冲液（50 m米Tris，pH 7.5，150米米氯化钠、1%诺奈德P-40、10%甘油、2米米4-（2-氨基乙基）-苯磺酰基氟化物，1μg/ml亮氨酸肽，2μg/ml抑肽酶，2μg/ml胃蛋白酶抑制素），然后超声处理和离心。蛋白质浓度由BCA测定。蛋白质（25–30μg）在NuPAGE Novex上溶解4–12%1×NuPAGE MOPS-SDS运行缓冲液（Invitrogen）和使用iBLOT设备转移到硝化纤维素膜（Invitrogen）。用5%脱脂奶粉在1×含0.1%吐温20的三缓冲盐水浸泡1小时，然后用一级抗体过夜。使用的主要抗体为：多克隆抗体抗H3（AbCam）1:2000稀释，抗H3K4Me2（AbCam）1:3000稀释，以及抗G9a（AbCam）4μg/ml，单克隆抗H3K9Me2（AbCam）3μg/ml，抗H3K27Me3（AbCam）3μg/ml，抗SUV39H1（AbCam）4μg/ml抗β-肌动蛋白（Sigma）以1:2000稀释。初级治疗后抗体，膜在抗兔或抗鼠中孵育辣根过氧化物酶结合二级抗体（Bio-Rad实验室）使用柯达短暂接触化学发光试剂后检测到带有柯达ID软件的图像工作站。
甲基化特异PCR-来自E17肝脏的1微克DNA用亚硫酸氢钠处理额叶皮层的EZ DNA甲基化试剂盒（Zymo Research）并通过甲基化特异性PCR分析检测位于基因启动子区的CpG岛的甲基化状态G9a公司和Suv39h1号机组使用MethPrimer设计底漆(56)具体针对模板中甲基化或非甲基化的CpG。对于G9a、，前锋引物跨越两个CpG，反向引物包含三个CpGs。这个引物序列为：甲基化正向，5′-GTT-GTT-GGA-GGAGTT TC-3′；甲基化反式，5′-GAC GAT AAC AAT AACCGA-3′；非甲基化前向，5′-TTG TTG GAG AAG GAG TTTTGA-3′；非甲基化逆转，5′-AAC AAT AAT AAC AAC AAC-CAAA-3′。对于Suv39h1，正向引物跨越四个CpG启动子和反向引物包含三个CpG。底漆序列为：甲基化正向，5′-AGT AGC GAG TAT CGG CGTTC-3′；甲基化逆转，5′-GAA CCT AAA CCT CGC GA-3′；非甲基化前向，5′-TAA AAG TAG TGA GTA TTG TTT GA-3′；非甲基化逆转，5′-AAA CCT AAA CCT CGC GA-3′。每个用60ng模板进行反应。反应条件为：94°C的一个循环2分钟，退火温度下1分钟70°C，然后在94°C下进行37次变性循环30 s，退火40 s，72°C下伸长率1 min，然后70°C的一个循环持续10分钟。退火温度为：G9a公司、甲基化和非甲基化，55.0°C；Suv39h1号机组，甲基化，59.0°C，和非甲基化，55.8°C。反应条件确定为在分析的线性范围内。PCR产物的分辨率为10%三缓冲EDTA聚丙烯酰胺凝胶并用溴化乙锭染色。这个使用柯达成像仪对每个波段的强度进行量化ID软件。甲基化水平使用甲基化产物的强度除以非甲基化产物。
统计分析-通过分析方差。重大影响(对<0.05）进一步分析使用SYSTAT软件（SYSTAT software）进行Tukey多重比较测试Inc.制造）。数据表示为平均值±S.E。
结果
E17肝脏和皮层中的H3K9Me2水平-分析H3K9Me2通过免疫印迹，其水平归一化为总组蛋白3的水平。这个后者不受母亲饮食的影响（数据未显示）。H3K9Me2是通常与常染色区的转录抑制有关(48). 在肝脏和大脑皮层，H3K9Me2水平随着母亲胆碱摄入量的增加而增加。水平E17胚胎肝脏中的H3K9Me2()来自喂食补充胆碱饮食的怀孕大鼠比对照组高40%并且比胆碱缺乏胚胎高60%(对<0.04和对分别<0.02）。控制和胆碱缺乏动物具有相似量的H3K9Me2。E17皮层()，金额补充胆碱的胚胎中H3K9Me2的含量是补充胆碱胚胎的9倍胆碱缺乏胚胎(对< 0.05). H3K9Me2在对照组介于其他两组之间，无统计学意义与任何一个都不同。
肝脏中的H3K9Me2(A类)和皮层(B类).H3K9Me2型通过免疫印迹分析E17上的蛋白质水平，并将其归一化为总量组蛋白3（参见印迹嵌件). 参见“结果”了解统计数据。条形和污点标签：S公司，补充胆碱；C类,控制；D类，胆碱缺乏。
E17肝脏和皮质中的H3K27Me3水平-类似二甲基化在赖氨酸9中，组蛋白3上赖氨酸27的三甲基化也有助于转录抑制(44). 在E17的肝脏中胚胎(),补充胆碱组的H3K27Me3比补充胆碱组高2.7倍胆碱缺乏型(对<0.008）与对照组显示H3K27Me3的中等水平。在额叶皮层H3K27Me3在对照组和胆碱补充组中相似，虽然前者往往更高。H3K27Me3的水平为胆碱缺乏大鼠与对照组相比显著降低（60%）控件(对< 0.01).
肝脏中的H3K27Me3(A类)和皮层(B类).H3K27Me3型通过免疫印迹分析E17上的蛋白质水平，并将其归一化为总量组蛋白3（参见印迹嵌件). 参见“结果”了解统计数据。条形和污点标签：S公司，补充胆碱；C类,控制；D类，胆碱缺乏。
E17肝脏中的H3K4Me2水平-尽管H3K9Me2和H3K27Me3组蛋白3二甲基化是转录抑制染色质的特征赖氨酸4存在于活性基因的启动子上(42). 相比之下膳食胆碱摄入量与组蛋白3与转录抑制相关（图。和)，肝脏的水平H3K4Me2与胆碱的摄入量呈负相关。具体来说E17胚胎肝脏中H3K4Me2的水平()从喂食补充胆碱的饮食比缺乏胆碱的胚胎低55%(对< 0.05). 我们没有测量H3K4Me2在皮质。
肝脏中的H3K4Me2。E17肝脏中H3K4Me2蛋白水平为通过免疫印迹分析并归一化为总组蛋白3（参见印迹嵌件). 有关统计信息，请参阅“结果”。棒材和螺栓标签：S公司，补充胆碱；C类，控制；D类,胆碱缺乏。
E17肝脏和皮质中的G9a甲基转移酶水平-G9a公司（KMT1C）是H3K9的主要甲基转移酶，催化加成反应两个甲基对该底物体内(46). 反向采用转录聚合酶链反应和免疫印迹技术分析母体的影响胆碱摄入量对G9a mRNA和蛋白质水平的影响E17的肝脏和皮层。在这两种组织中，G9a信息和蛋白质与母亲胆碱摄入量直接相关。在肝脏中，G9a公司胆碱缺乏大鼠的mRNA水平分别下降到18%和15%分别在补充胆碱的胚胎和对照胚胎中发现(对<0.0004）(). 在大脑皮层G9a公司信使核糖核酸与对照组相比，在补充胆碱的胚胎中观察到胆碱缺乏型(对< 0.004)(). 金额E17肝脏和额叶皮质中存在的G9A蛋白与RT-PCR数据。补充胆碱的胚胎肝脏中G9A含量高44%比胆碱缺乏动物(对< 0.04)()和中的胆碱缺乏大鼠大脑皮层G9A蛋白水平降至～30%在补充胆碱和对照胚胎中发现的(对<两者均为0.005）().
G9a在肝脏和皮层。 A类，RNA是从E17胚胎的肝脏，并用于G9a公司并标准化为β-肌动蛋白（参见中的示例凝胶嵌入物).B类，G9A通过免疫印迹分析E17肝脏中的蛋白质水平，并将其归一化为β-肌动蛋白（参见印迹嵌件).C类，RNA是从E17胚胎皮层分离并用于RT-PCRG9a公司并标准化为β-肌动蛋白（参见凝胶嵌入物).D类用免疫印迹和归一化为β-肌动蛋白水平（参见印迹嵌件).有关统计信息，请参阅“结果”。条形标签：S公司,胆碱补充；C类，控制；D类，胆碱缺乏。
E17肝脏和皮层Suv39h1甲基转移酶水平—组蛋白甲基转移酶Suv39h1（KMT1A）也催化甲基化因此有助于转录抑制。与G9a不同的是倾向于合成H3K9Me2产品，据报道Suv39h1负责H3K9Me3的生成(57). 反向转录酶聚合酶链式反应用于分析母体胆碱摄入的影响在层次上Suv39h1号机组E17肝和额叶皮质mRNA表达。在胆碱缺乏胎儿的肝脏中，Suv39h1号机组mRNA水平为对照组的四分之一和胆碱补充大鼠(对<0.001和对< 0.01,分别）(). 后两组的Suv39h1号机组信使核糖核酸(). 在皮层，Suv39h1号机组mRNA表达为补充胆碱的胎儿比缺乏胆碱的动物高40%(对< 0.015) (). 与RT-PCR数据一致，SUV39H1蛋白胆碱水平与肝脏和肝脏中胆碱的摄入直接相关皮质。在肝脏中，SUV39H1蛋白水平在与对照组相比，补充胆碱的胚胎增加了31%，增加了64%与胆碱缺乏大鼠相比(对<0.01和对分别<0.0004）(). 在皮层中，SUV39H1蛋白高1.8倍相对于缺陷组的补充胚胎(对<0.0004），比对照组高58%(对< 0.001)().
Suv39h1存在于肝脏和皮层。 A类，RNA是从E17胚胎的肝脏并用于RT-PCRSuv39h1号机组和归一化为β-肌动蛋白（参见中的示例凝胶嵌入物).B类免疫印迹分析E17肝脏中SUV39H1蛋白水平并归一化为β-肌动蛋白（参见印迹嵌件).C类，从E17胚胎皮层中分离出RNA，用于的RT-PCRSuv39h1号机组并归一化为β-肌动蛋白（请参见中的示例凝胶嵌入物).D类E17中SUV39H1蛋白质水平通过免疫印迹分析大脑皮层，并将其归一化为β-肌动蛋白（参见印迹嵌件). 查看“结果”用于统计。条形标签：S公司，补充胆碱；C类,控制；D类，胆碱缺乏。
G9a和Suv39h1启动子CpG甲基化特异性PCR分析岛屿-甲基化特异性PCR用于检测甲基化基因启动子区内几个CpG的状态G9a公司和Suv39h1号机组检查以下表达式发生变化的可能性母体胆碱诱发的这些酶可能由DNA改变介导甲基化。在E17肝脏中，甲基化模板与非甲基化模板的比率这个G9a公司胆碱缺乏胎儿的启动子高2.7倍与控件相比(对<0.0004），当与胆碱补充大鼠的比较(对< 0.0006)(). 曾经有过饮食对G9a公司皮层启动子甲基化（数据未示出）。在肝脏里()，甲基化模板与非甲基化模板的比率这个Suv39h1号机组胆碱缺乏动物的启动子高3.8倍与对照组和补充组大鼠进行比较(对<0.0002). 在Suv39h1号机组E17皮层启动子()，比率甲基化到非甲基化的模板在与对照组相比，胆碱缺乏胚胎高出2.2倍胆碱补充大鼠(对<0.0011和对< 0.0014,分别）。
甲基化特异PCR(MSP公司)分析G9a公司和Suv39h1号机组启动子CpG岛。 A–C，基因组DNA从E17肝脏分离(A类和B类)或皮层(C类)是用亚硫酸氢钠处理并用甲基化特异性PCR进行分析。这个插入显示了使用引物获得的PCR产物的示例旨在放大甲基化(米)和非甲基化(u个)DNA模板。有关统计信息，请参阅“结果”。Bar和PCR产品标签：S公司，补充胆碱；C类，控制；D类,胆碱缺乏。
讨论
在哺乳动物中，单碳代谢依赖于甲基供体和辅因子：蛋氨酸、胆碱、叶酸和维生素B类12(58)和我们的以前的研究表明，孕妇的饮食胆碱摄入量增加大鼠升高胎鼠肝脏和大脑中AdoMet的浓度组蛋白甲基转移酶的甲基基团供体底物(31). 最近的研究有表明成年大鼠和小鼠的膳食甲基缺乏导致甲基化组蛋白水平的变化(51,59–61).在这里，我们发现妊娠期胆碱的可用性也影响组蛋白发育中胚胎的甲基化。H3K9Me2和H3K27Me3的水平胎儿肝脏和大脑皮层与胆碱摄入量直接相关此外，H3K9甲基化的变化与类似的改变相关两种组蛋白甲基转移酶G9a的mRNA和蛋白的表达和SUV39H1，对赖氨酸9的甲基添加进行催化组蛋白3。因此，似乎胆碱对H3K9甲基化的调节供应可能由两种机制调节，包括甲基转移酶的蛋白质含量及其浓度基底，AdoMet。与H3K9Me2和H3K27Me3的量相比肝脏H3K4Me2水平与胆碱摄入量成反比。二甲基化H3K9和H3K27的三甲基化与转录相关压制(44,48)，而H3K4Me2与转录激活相关(42). 总的来说观察到的组蛋白甲基化模式可能表明产前增加胆碱的可用性导致普遍的转录容许性降低染色质状态比胆碱缺乏。然而，更有可能的是染色质的变化是非常特殊的。利用染色质的未来研究使用不同特异性抗体的免疫沉淀技术甲基化组蛋白3将有助于解决这个问题。
我们以前的研究表明，胎儿对短E11–E17期间饮食胆碱摄入量的改变孕妇，包括肝脏和大脑皮质DNA的变化多个基因的甲基化和修饰表达，包括编码DNA甲基转移酶Dnmt1型和Dnmt3a型以及DNA甲基化调节器，Dnmt3l型和兆比特2(31). 在这些研究中，我们观察到，在E17动物的肝脏中，胆碱缺乏导致基因特异性高甲基化，可能由补偿性诱导引起Dnmt1型后者与a的低甲基化有关CpG在其调控区域(62)在中观察到胆碱缺乏胎儿。在最近的一项研究中，波格里布尼等。(61)发现一个甲基缺乏症36周（无胆碱和叶酸饮食含有0.18%蛋氨酸）的成年Fischer 344大鼠引起表观基因组DNA以及大脑中的蛋白质改变，包括普遍的DNA超甲基化，H3K9Me3和H3K27Me3的低甲基化和DNMT3A的过度表达。此外，这些作者观察到这些动物的大脑和甲基-CpG结合水平的增加蛋白质2。因此，根据之前的研究(31,61)以及提供的数据在这里，似乎对甲基有高度协调的反应这种剥夺在产前和成年动物中是相似的。当前结果证实并扩展了我们之前的观察结果，并表明的发起人G9a公司和Suv39h1号机组都是戏剧性的胆碱缺乏胚胎中的高甲基化。目前尚不清楚这些启动子区域的甲基化是否调节G9a公司和Suv39h1号机组然而，我们的数据显示这些基因在胆碱缺乏大鼠中的表达（其特征是DNA超甲基化）与DNA甲基化的概念一致在大多数基因的调节区域内，它们的表达减少(63–66).因此，现在有可能提出一种模型，即胆碱的供应子宫内导致多种表观遗传适应。具体来说，当胆碱供应不足，DNMT1和DNMT3A表达高，导致DNA超甲基化，导致G9a和SUV39H1，导致H3K9Me2和H3K27Me3丰度低。（请注意，尽管G9a可以催化H3K27的甲基化(48)，H3K27Me3的大部分可能由KMT6/EZH2生产(44).) 相比之下胆碱导致DNA甲基转移酶表达降低，DNA含量降低甲基化以及伴随的G9a和SUV39H1的高表达，导致H3K9Me2和H3K27Me3的高丰度进一步被高水平加速AdoMet的。因此，提出低胆碱供应可能通过DNA高甲基化下调基因表达，而高胆碱摄入可以通过增加抑制甲基化水平来实现这一点组蛋白3(即H3K9和H3K27）。
越来越多的证据表明组蛋白甲基化，如DNA甲基化是一种稳定的、可遗传的表观基因组染色质修饰用于调节基因表达的长期变化。一种机制用于这种稳定的遗传涉及蛋白HP1与甲基化的结合H3K9与多种生物中的基因沉默相关(67–69).结合后，HP1招募SUV39H1，负责初始甲基化H3K9。因此，H3K9甲基化和HP1能够连续扩散核小体在有丝分裂和减数分裂中的自繁殖(70–72).研究表明，DNA和组蛋白甲基化对神经细胞分化以及高阶认知功能，如学习和记忆(73,74). 有趣的是修改似乎涉及到对另一方的监管。DNA甲基化被发现影响组蛋白甲基化甲基化胞嘧啶与H3K9Me3损失相关(75)H3K4Me2的减少在甲基化CpG区域观察到(76). 反过来，研究粗糙脉孢菌(77)和拟南芥塔利安人一个(78)有表明H3K9甲基化具有直接DNA甲基化的能力。在有证据表明，DNMT3A和DNMT3B的DNA甲基化依赖于SUV39H1介导的组蛋白甲基化(79). 它正在变得越来越清楚的是，DNA和组蛋白甲基化可能相互作用加强关系，这两项修改对长期来说都至关重要表观基因组的调控。最近开发的方法允许伴随DNA甲基化的高通量和高分辨率分析DNA相关蛋白的分析，包括特异性甲基化组蛋白，揭示了组蛋白和DNA的甲基化模式相互关联和调控基因组的DNA甲基化域随着细胞分化而动态变化(80,81). 我们的数据表明的影响子宫内表观基因组上胆碱的供应可被视为适应可用性的属性并可能解释其长期作用。会很有趣的因此，应用这些新技术来详细探索表观遗传学景观由妊娠期胆碱摄入量决定。
除了充分供应胆碱的作用外子宫内用于成年大鼠大脑的发育和功能（见上文），我们最近发现高E11–17胆碱摄入减缓了致癌物治疗诱发的乳腺肿瘤生长成年期7,12-二甲基苯并[α]蒽，并改变基因表达，以及这些肿瘤中的DNA甲基化模式(82). 这些数据指向在此之前，充足的胆碱营养在妊娠预防和/或改善成人乳腺癌目前关于胆碱摄入量的指南建议女性食用孕期和哺乳期胆碱含量增加（非妊娠期425mg/天，妊娠期450 mg/天、哺乳期550 mg/天）(1). 个人然而，要求可能会有所不同，并且还取决于基因型，因为胆碱和叶酸相关酶基因的多态性新陈代谢(6,83). 重要的是，基因它们可能受到胆碱的表观遗传反馈调节。
笔记
*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生研究院拨款来自NIA的AG009525。这篇文章的出版费用部分由付款支付共页费用。因此，必须在此标记此物品“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节只是为了表明这一事实。
脚注
2使用的缩写是：E，胚胎日；AdoMet公司，S公司-腺苷蛋氨酸；逆转录PCR；拖把，4-吗啉丙基磺酸；双三角形，2-（双（2-羟乙基）氨基）-2-（羟甲基）丙烷-1,3-二醇。
工具书类
1食品和营养委员会（1998年）饮食的硫胺素、核黄素、烟酸、维生素的参考摄入量B类6、叶酸、维生素B12，泛音酸、生物素和胆碱华盛顿国家学院出版社，哥伦比亚特区[公共医学] 2Shaw，G.M.、Carmichael，S.L.、Yang，W.、Selvin，S.和Schaffer，D.M.（2004）美国流行病学杂志。
160102–109 [公共医学][谷歌学者] 三。Blusztajn，J.K.（1998）科学类 281794–795 [公共医学][谷歌学者] 4Meck，W.H.和Williams，C.L.（2003）神经科学。生物行为学。版次。
27385–399 [公共医学][谷歌学者] 5.McCann，J.C.、Hudes，M.和Ames，B.N.（2006）神经科学。生物行为学。版次。
30696–712 [公共医学][谷歌学者] 7Meck，W.H.和Williams，C.L.（1997）神经报告 83045–3051 [公共医学][谷歌学者] 8Mellott，T.J.、Williams，C.L.、Meck，W.H.和Blusztajn，J.K。(2004)美国财务会计准则委员会J。
18NIL412–NIL427[公共医学][谷歌学者] 9.Meck，W.H.、Smith，R.A.和Williams，C.L.（1988）发展心理学。 21339–353 [公共医学][谷歌学者] 10Meck，W.H.、Smith，R.A.和Williams，C.L.（1989）行为。神经科学。 1031234–1241 [公共医学][谷歌学者] 11Meck，W.H.和Williams，C.L.（1997）神经报告 82831–2835 [公共医学][谷歌学者] 12Meck，W.H.和Williams，C.L.（1997）神经报告 83053–3059 [公共医学][谷歌学者] 13Meck，W.H.和Williams，C.L.（1999）开发大脑研究。 11851–59 [公共医学][谷歌学者] 14Meck，W.H.、Williams，C.L.、Cermak，J.M.和Blusztajn，J.K。(2008)前部集成。神经科学。
17[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15奥尔布赖特·C.D.、蔡·A.Y.、弗里德里希·C.B.、马·M.H.和Zeisel，S.H.（1999）开发大脑研究。
11313–20 [公共医学][谷歌学者] 16奥尔布赖特·C.D.、弗里德里希·C.B.、布朗·E.C.、马·M.H.和Zeisel，S.H.（1999）开发大脑研究。
115123–129 [公共医学][谷歌学者] 17Holmes-McNary，M.Q.，Loy，R.，Mar，M.H.，Albright，C.D.和Zeisel，S.H.（1997）开发大脑研究。
1019–16 [公共医学][谷歌学者] 18Craciunescu，C.N.，Albright，C.D.，Mar，M.H.，Song，J.和Zeisel，S.H.（2003）《营养学杂志》。
1333614–3618[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19医学博士尼古列斯库（Niculescu，M.D.）、C.N.Craciunescu和S.H.Zeisel。(2005)摩尔大脑研究。
134309–322 [公共医学][谷歌学者] 20Williams，C.L.、Meck，W.H.、Heyer，D.和Loy，R。(1998)大脑研究。
794225–238 [公共医学][谷歌学者] 21Cermak，J.M.、Holler，T.、Jackson，D.A.和Blusztajn，J.K。(1998)美国财务会计准则委员会J。
12349–357 [公共医学][谷歌学者] 22Sandstrom，N.J.、Loy，R.和Williams，C.L.（2002）大脑研究。 9479–16 [公共医学][谷歌学者] 23Glenn，M.J.，Gibson，E.M.，Kirby，E.D.，Mellott，T.J。，Blusztajn，J.K.和Williams，C.L.（2007）欧洲药典。神经科学。 252473–2482[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Glenn，M.J.、Kirby，E.D.、Gibson，E.M.、Wong-Goodrich，S.、。，Mellott，T.J.、Blusztajn，J.K.和Williams，C.L.（2008）大脑研究。 1237110–123[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Napoli，I.、Blusztajn，J.K.和Mellott，T.J。(2008)大脑研究。
1237124–135 [公共医学][谷歌学者] 26Jones，J.P.、Meck，W.H.、Williams，C.L.、Wilson，W.A.和Swartzwelder，H.S.（1999）开发人员大脑物件。 118159–167 [公共医学][谷歌学者] 27Pyapali，G.K.，Turner，D.A.，Williams，C.L.，Meck，W.H.和Swartzwelder，H.S.（1998）J。神经生理学。 791790–1796 [公共医学][谷歌学者] 28Mellott，T.J.、Follettie，M.T.、Diesl，V.、Hill，A.A.、。，Lopez-Coviella，I.和Blusztajn，J.K.（2007）财务会计准则委员会J。 211311–1323 [公共医学][谷歌学者] 29Finkelstein，J.D.、Martin，J.J.、Harris，B.J.和Kyle，W.E。(1983)《营养学杂志》。
113519–521 [公共医学][谷歌学者] 30Chiang，P.K.、Gordon，R.K.，Tal，J.、Zeng，G.C.、博士，B.P.、。，Pardhasaradhi，K.和McCann，P.P.（1996）财务会计准则委员会J。 10471–480 [公共医学][谷歌学者] 31科瓦切娃，V.P.，梅洛特，T.J.，戴维森，J.M.，瓦格纳，N。，Lopez-Coviella，I.、Schnitzler，A.C.和Blusztajn，J.K。(2007)生物学杂志。化学。
28231777–31788 [公共医学][谷歌学者] 32Wainfan，E.，Dizik，M.，Stender，M.和Christman，J.K。(1989)癌症研究。
494094–4097 [公共医学][谷歌学者] 33Christman，J.K.、Sheikhnejad，G.、Dizik，M.、Abileah，S.和Wainfan，E.（1993）致癌作用
14551–557 [公共医学][谷歌学者] 34医学博士尼古列斯库（Niculescu，M.D.）、C.N.Craciunescu和S.H.Zeisel。(2006)美国财务会计准则委员会J。
2043–49[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35沃尔夫·G·L、科德尔·R·L、摩尔·S·R和库尼·C·A。(1998)美国财务会计准则委员会J。
12949–957 [公共医学][谷歌学者] 36Waterland，R.A.和Jirtle，R.L.（2003）分子细胞。生物。 235293–5300[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Waterland，R.A.，Dolinoy，D.C.，Lin，J.R.，Smith，C.A.，Shi，X.和Tahiliani，K.G.（2006）起源
44401–406 [公共医学][谷歌学者] 38Jenuwein，T.和Allis，C.D.（2001）科学类 2931074–1080 [公共医学][谷歌学者] 39Jenuwein，T.（2006）FEBS J公司。
2733121–3135 [公共医学][谷歌学者] 40Strahl，B.D.和Allis，C.D.（2000）自然 40341–45 [公共医学][谷歌学者] 41Noma，K.、Allis，C.D.和Grewal，S.I.（2001）科学类 2931150–1155 [公共医学][谷歌学者] 42Schneider，R.、Bannister，A.J.、Myers，F.A.、Thorne，A.W.、。，Crane-Robinson，C.和Kouzarides，T.（2004）国家。细胞生物学。 673–77 [公共医学][谷歌学者] 43B.D.斯特拉尔、R.奥巴、R.库克和C.D.艾利斯。(1999)程序。国家。阿卡德。科学。美国。
9614967–14972[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Cao，R.，Wang，L.J.，Wang-H.B.，Xia，L.，Erdjument-Bromage，H。，Tempst，P.、Jones，R.S.和Zhang，Y.（2002）科学类 2981039–1043 [公共医学][谷歌学者] 45.Rea，S.，Eisenhaber，F.，O'Carroll，D.，Strahl，B.D.，Sun，Z.W。，Schmid，M.、Opravel，S.、Mechtler，K.、Ponting，C.P.、Allis，C.D.和Jenuwein，T.（2000）自然
406593–599 [公共医学][谷歌学者] 46Tachibana，M.、Sugimoto，K.、Fukushima，T.和Shinkai，Y。(2001)生物学杂志。化学。
27625309–25317 [公共医学][谷歌学者] 47Nakayama，T.、Watanabe，M.、Yamanaka，M.，Hirokawa，Y.、Suzuki，H.、。，Ito，H.、Yatani，R.和Shiraishi，T.（2001）实验室。投资。 811049–1057 [公共医学][谷歌学者] 48Tachibana M.、Sugimoto K.、Nozaki M.、Ueda J.、Ohta T.、Ohki，M.、Fukuda M.、Takeda N.、Niida H.、Kato H.和Shinkai Y。(2002)基因发育。
161779–1791[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Aagaard，L.、Laible，G.、Selenko，P.、Schmid，M.、Dorn，R.、。，Schotta，G.，Kuhfittig，S.，Wolf，A.，Lebersorger，A.，Singh，P.B.，路透社，G.和Jenuwein，T.（1999）EMBO J。
181923–1938[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50Zhu，X.N.，Mar，M.H.，Song，J.N.和Zeisel，S.H。(2004)开发大脑研究。
149121–129 [公共医学][谷歌学者] 51Dobosy，J.R.、Fu，V.X.、Desotelle，J.A.、Srinivasan，R.、。，Kenowski，M.L.、Almassi，N.、Weindruch，R.、Svaren，J.和Jarrard，D.F。(2008)前列腺
681187–1195 [公共医学][谷歌学者] 52Bieri，J.G.、Stoewsand，G.S.、Briggs，G.M.、Phillips，R.W.、。，Woodard，J.C.和Kanapka，J.J.（1977）J。螺母。 1071340–1348[谷歌学者] 53Bieri，J.G.（1980）《营养学杂志》。
1101726[谷歌学者] 54Zeisel，S.H.、Mar，M.H.、Zhou，Z.W.和Da Costa，K.A。(1995)《营养学杂志》。
1253049–3054 [公共医学][谷歌学者] 55Chomczynski，P.和Sachi，N.（1987）分析。生物化学。 162156–159 [公共医学][谷歌学者] 56Li，L.C.和Dahiya，R.（2002）生物信息学（牛津）
181427–1431 [公共医学][谷歌学者] 57Rice，J.C.，Briggs，S.D.，Ueberheide，B.，Barber，C.M。，Shabanowitz，J.、Hunt，D.F.、Shinkai，Y.和Allis，C.D。(2003)摩尔细胞
121591–1598 [公共医学][谷歌学者] 58.Van den Veyver，I.B.（2002年）每年。版次。螺母。 22255–282 [公共医学][谷歌学者] 59Pogribny，I.P.，Ross，S.A.，Tryndyak，V.P.，Pogribna，M。，Poirier，L.A.和Karpinets，T.V.（2006）致癌作用 271180–1186 [公共医学][谷歌学者] 60.Pogribny，I.P.、Tryndyak，V.P.，Muskhelishvili，L.、Rusyn，I.、。，和Ross，S.A.（2007）《营养学杂志》。
137216S–222S[公共医学][谷歌学者] 61Pogribny，I.P.，Karpf，A.R.，James，S.R.，Melnyk，S.，Han，T。，和Tryndyak，V.P.（2008）大脑研究。
123725–34 [公共医学][谷歌学者] 62Slack，A.、Cervoni，N.、Pinard，M.和Szyf，M。(1999)欧洲生物化学杂志。
264191–199 [公共医学][谷歌学者] 63Nan，X.，Ng，H.H.，Johnson，C.A.，Laherty，C.D.，Turner，B.M。，Eisenman，R.N.和Bird，A.（1998）自然 393386–389 [公共医学][谷歌学者] 64Jones，P.L.、Veenstra，G.J.、Wade，P.A.、Vermaak，D.、Kass，S。U.、Landsberger，N.、Strouboulis，J.和Wolffe，A.P.（1998）自然遗传学。 19187–191 [公共医学][谷歌学者] 65.Eden，S.、Hashimshony，T.、Keshet，I.、Cedar，H.和Thorne，A.W。(1998)自然
394842. [公共医学][谷歌学者] 66Takizawa，T.、Nakashima，K.、Namihira，M.、Ochiai，W.、Uemura，A.、。，Yanagisawa，M.、Fujita，N.、Nakao，M.和Taga，T.（2001）开发单元 1749–758 [公共医学][谷歌学者] 67Bannister，A.J.、Zegerman，P.、Partridge，J.F.、Miska，E.A.、。，Thomas，J.O.、Allshire，R.C.和Kouzarides，T.（2001）自然 410120–124 [公共医学][谷歌学者] 68Lachner，M.、O'Carroll，D.、Rea，S.、Mechtler，K.和Jenuwein，T。(2001)自然
410116–120 [公共医学][谷歌学者] 69Snowden，A.W.、Gregory，P.D.、Case，C.C.和Pabo，C.O。(2002)货币。生物。
122159–2166 [公共医学][谷歌学者] 70Cheutin，T.、McNairn，A.J.、Jenuwein，T.，Gilbert，D.M.、Singh、，P.B.和Misteli，T.（2003）科学类
299721–725 [公共医学][谷歌学者] 71Felsenfeld，G.和Groudine，M.（2003）自然 421448–453 [公共医学][谷歌学者] 72.Hall，I.M.，Shankaranarayana，G.D.，Noma，K.，Ayoub，N.，Cohen，A.和Grewal，S.I.（2002）科学类
2972232–2237 [公共医学][谷歌学者] 73.Lubin，F.D.、Roth，T.L.和Sweatt，J.D.（2008）《神经科学杂志》。 2810576–10586[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 74Ooi，L.和Wood，I.C.（2008）生物化学。J。 414327–341 [公共医学][谷歌学者] 75Reik，W.、Dean，W.和Walter，J.（2001）科学类 2931089–1093 [公共医学][谷歌学者] 76.Higashimoto，K.、Urano，T.、Sugiura，K.，Yatsuki，H.、Joh，K。，Zhao，W.、Iwakawa，M.、Ohashi，H.、Oshimura，M.、Niikawa，N.、Mukai，T.和Soejima，H.（2003）Am.J.Hum.遗传学。
73948–956[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 77.Tamaru，H.和Selker，E.U.（2001）自然 414277–283 [公共医学][谷歌学者] 78Jackson，J.P.、Lindroth，A.M.、Cao，X.和Jacobsen，S.E。(2002)自然
416556–560 [公共医学][谷歌学者] 79Lehnertz，B.、Ueda，Y.、Derijck，A.A.H.A.、Braunschweig，U.、。，Perez-Burgos，L.、Kubicek，S.、Chen，T.P.、Li，E.、Jenuwein，T.和Peters，A.H.F.M.（2003）货币。生物。
131192–1200 [公共医学][谷歌学者] 80Meissner，A.，Mikkelsen，T.S.，Gu，H.，Wernig，M.，Hanna，J。，Sivachenko，A.，Zhang，X.，Bernstein，B.E.，Nusbaum，C.，Jaffe，D.B。，Gnirke，A.、Jaenisch，R.和Lander，E.S.（2008）自然 454766–770[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 81Gal-Yam，E.N.，Egger，G.，Iniguez，L.，Holster，H.，Einarsson，S。，Zhang，X.、Lin，J.C.、Liang，G.、Jones，P.A.和Tanay，A。(2008)程序。国家。阿卡德。科学。美国。
10512979–12984[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 82科瓦切娃，V.P.，戴维森，J.M.，梅洛特，T.J.，罗杰斯，A.E。，Yang，S.、O'Brien，M.O.和Blusztajn，J.K。财务会计准则委员会J。（2008年12月1日）1996年10月10日至12月8日[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考] 
