Dre2是一种保守的真核Fe/S簇合蛋白，在细胞质Fe/S蛋白生物发生中的作用^▿

摘要

真核细胞中的Fe/S簇是模块化辅因子(4)在基本过程中起作用并位于不同的细胞隔室中(22). 线粒体Fe/S簇合蛋白介导线粒体电子传递链中的电子传递（例如络合物I、II和III）以及柠檬酸循环中的催化作用（例如乌头糖）。在某些情况下，Fe/S簇参与环境信号的传感（例如，IRP1或细胞质乌头糖，充当铁传感器）(34). 最近发现的Fe/S簇蛋白与DNA修复有关（FancJ和XPD）(36)，DNA复制（primase priL）(17)以及促进哺乳动物神经元生长的信号转导（sprouty）(44). 保守的[4Fe-4S]簇蛋白Rli1在细胞核的核糖体成熟和细胞质的翻译起始中发挥了重要作用。因此，干扰Fe/S簇合成的突变与核糖体加工和蛋白质翻译缺陷有关(16,45).

在细胞中，Fe/S簇的生物发生需要复杂的机制，包括半胱氨酸脱硫酶、组装中间体的支架蛋白、伴侣和还原酶(7,13,22). 线粒体具有所有这些基本成分，当提供关键成分（半胱氨酸硫和铁）时，可以自行合成簇(2). 其中一些生物合成蛋白（如Nfs1和Isu）在某些情况下也存在于线粒体外(8,43). 半胱氨酸脱硫酶Nfs1已被证明在线粒体内外都具有重要功能(29). 此外，还发现了一类线粒体外Fe/S簇缺失和线粒体Fe/S团保留的突变体(15,35). 这一类包括线粒体中Atm1和Erv1的突变以及细胞质和细胞核中Cfd1、Nbp35、Nar1和Cia1（所谓的CIA成分）的突变(22). Atm1是一种线粒体ABC转运体，在线粒体基质中具有ATP结合位点和假定的底物结合位点(19). 因此，以细胞质缺陷和线粒体Fe/S簇保存为特征的Atm1突变体的表型表明，其未知底物，可能是关键成分或信号分子，可能是外部簇形成所必需的(22).

线粒体载体蛋白Mrs3和Mrs4与线粒体内膜的铁传递有关，用于体内血红素和Fe/S簇合成(26,46,47). 然而，这些转运蛋白的许多方面仍然很神秘，例如进入线粒体（或流出线粒体）的转运底物的身份。双突变株与单突变株的突变表型显著增强（Δ3号夫人Δ4号mrs相对于Δ3号夫人或Δ4号mrs). 然而，即使是双突变体也是可行的，除非受到严重的铁缺乏，否则其生长旺盛。Δ3号夫人Δ磁共振波谱4突变体具有其他复杂的调控表型，包括降低细胞质铁和诱导高亲和力质膜铁摄取活性(21). 以此为背景，我们启动了一项合成致命基因筛查，寻找与Δ结合后导致致命性的突变3号夫人Δ4号mrs获得了一个线粒体外Fe/S簇缺失的突变体J137。相应的基因被鉴定为DRE2型，一个编码保守Fe/S簇蛋白的必要基因。

材料和方法

结果

采用Δ进行了合成致死筛查3号夫人Δ4号mrs突变体作为起点（图。​（图1）。1). 简言之，Δ磁共振3Δ4号mrs突变被引入一个带有ade2和ade3突变和MRS4系列放回2μm质粒上阿德3和URA3公司（图。​（图1A）。1安培). 亲本菌株96-47在富含低腺嘌呤的YPD培养基上表现出从红到白的扇形结构。紫外线诱变后，发现一个红色菌落J137（97-19），由于存在合成致命突变，该菌落不会丢失覆盖质粒（图。​（图1B）。1磅). 通过氟代甲酸治疗后的无活性证实了合成致死性（图。​（图1C）1摄氏度)并用完全不同的亮氨酸2-基于质粒携带MRS4系列或MRS3型（图。​（图1D）。一维). 合成致死突变是隐性的（图。​（图1E）1E级)并且可以在与野生型亲本菌株的回交中恢复为单个位点。基因组文库用于补充J137的非切割表型，并且互补活性位于携带MET1，YKR070W、和DRE2型打开阅读框（图。​（图2，2，第1行）。互补质粒的AccI消化和重定消除了互补，表明DRE2型负责（图。​（图2，2，第4行）。基因组拷贝DRE2型在J137中(dre1-137)获救后发现含有一个点突变，将密码子26改变为一个终止。

在单独的窗口中打开

图1。

使用Δ进行合成致命性分段筛选3号夫人Δ4号mrs.（A）应变。母株96-47含有Δ3号夫人Δ4号mrsΔade2Δade3（ade3）突变和2μm质粒17-1MRS4、URA3、和ADE3型该菌株在低腺嘌呤的YPD上产生红色和白色扇区。（B） 突变体选择。紫外线诱变后，鉴定出一个名为J137的菌落/克隆，该克隆未能扇形并保持红色。（C） 质粒依赖性测试。将亲本96-47和突变株J137 97-19暴露于氟代甲酸（FOA）中，以对抗质粒进行反选择，从而使前者存活，而后者不存活。（D） 质粒交换。用质粒17-37 pRS318转化亲本和突变体-MRS4-LEU2-CHY2型，并且两者都具有FOA抗性（未显示）。用环己酰亚胺（CHX）处理以去除新引入的质粒导致亲本的活力和突变体的不活力。（E） 遗传学。通过与Δ杂交分析J137（97-19）突变体3号夫人Δ4号mrsΔade2Δade3（ade3）相反交配型菌株93-71。Δ的二倍体纯合子3号夫人Δ4号mrs但是杂合子dre2-137（图纸2-137）FOA板上有突变条纹。二倍体能够生长，表明J137的突变是隐性的。

在单独的窗口中打开

图2。

合成致死突变体J137的进一步遗传分析。通过与质粒YCplac111中的基因组文库互补，克隆了J137中突变基因的野生型拷贝。除了两个单独的大的白色菌落外，转化子大部分形成了小的非分割的红色菌落。（第1行至第4行）互补质粒（第1和第2行）被挽救，通过缺失灭活YKR070W（第3行）或DRE2型（第4行）。只有17-59保留了互补活性，表明DRE2型是负责任的。（第5行）J137的基因组突变，称为dre2-137（图纸2-137），在扩增DRE2型开放阅读框和侧翼区域。出现了一个单一的A-T改变，将密码子26从赖氨酸改变为终止密码子。这个dre2-137（图纸2-137）该菌株名为97-55，在J137与亲本菌株84-9回交、产孢和四分体分离后恢复。该菌株生长缓慢，但有活力，对铁缺乏敏感。（第6行）通过二倍体中杂合子基因缺失，用表达Dre2的质粒与CYH2公司标记（18-39）和孢子形成。洗牌应变（101-19）和Δdre2型::kanMX（汉字）在用环己酰亚胺对质粒进行反选择后，Dre2质粒所覆盖的缺失完全无效。（第7行）相比之下，在重新插入YCplac22（质粒18-65）的强GPD启动子控制下，带有Dre2的洗牌菌株在环己酰亚胺上是可行的。（第8行）与从GPD启动子表达的人类Dre2同源物相同的质粒（质粒B29-70）使环己酰亚胺上的洗牌菌株生长旺盛。（第9行）YCplac22-GPD-Dre2质粒发生突变，引入dre2-137（图纸2-137）点突变（密码子26从赖氨酸变为stop），将该质粒（18-67）导入shuffle菌株，使放线菌亚胺能够存活生长。（第10行）将YCplac22-GPD-Dre2（1-25aa）质粒（19-13）转化到洗牌菌株，产生无法在环己酰亚胺平板上生长的转化子。（第11行和第12行）然而，含有N末端截断的Dre2形式的质粒，YCplac22-GPD-Dre2（Δ26）（第11列）和YCPlac 22-GPD-Dre2（△119）（第12列），能够在环己酰亚胺上生长。FOA，氟代甲酸。

DRE2型在中添加了注释酵母菌属基因组数据库是一个功能未知的重要基因。合成致命相互作用波兰3-13，DNA聚合酶δ的突变等位基因，如前所述(6)最近的一篇文章证明了温度敏感等位基因对染色体传输保真度的影响，尽管这种影响的机制尚未被描述(5). 为了确认DRE2型，构建了一种混洗菌株，并显示对覆盖质粒的反选择产生了不可识别性（图。​（图3B）。3B公司). 厌氧生长或向培养基中添加铁（未显示）无法挽救无活力状态。J137中的突变等位基因通过质粒携带的DRE2型这就拯救了Δdre2型致命性。有趣的是，氨基末端26个氨基酸不具有互补活性，而从氨基酸27到末端或从内部甲硫氨酸120到末端的羧基末端部分能够在混洗菌株中互补致死性（图。​（图3B）。3B公司). 数据表明，含有dre2-137（图纸2-137）在开放阅读框中，位于第27位的终止密码子的等位基因由位于第120位的内部蛋氨酸的低水平下游启动维持。

在单独的窗口中打开

图3。

序列比对和洗牌菌株互补。（A） 使用Clustal W 2.0对人类Dre2（Q6F181，也称为CIAPIN1或anamorsin）和酵母Dre2氨基酸序列进行比对。在对齐下面，星号代表相同的残留物，点或冒号代表较小程度的保守变化。半胱氨酸呈红色，九个半胱氨酸中有八个完全对齐。在序列上方，残基26上的黑色圆圈表示突变的位置dre2-137（图纸2-137）将K更改为停止。箭头表示面板B中使用的截断结构的平移起点（箭头1包括标记为Δ26的位置27到348；箭头2包括标记为△119的位置120到348）。上划线表示可能的功能域：氨基末端结构域（a）、酸性和富含丝氨酸的补片（B）、基本结构域（c）、CX₂CXC域（d），双CX₂C基序（e）和意义未知的氨基酸区（f）。（B） 洗牌菌株与各种Dre2结构体和人类同源物的互补。用Δ洗牌（应变101-19）数据记录设备::kanMX（汉字）删除内容包括DRE2型携带野生型的（质粒18-39）DRE2型和CYH2公司用携带在质粒YCplac22上并由GPD启动子驱动的各种Dre2构建物转化反选择标记。顶部面板中显示的YCplac22结构如下：Dre2（Δ26）（1和2）、Dre2，dre2-137（图纸2-137）（9） 和人类Dre2开放阅读框（10）。具有可反选Dre2的转化子-CYH2公司和测试Dre2-TRP1号机组生长并拍照（中间面板）。然后通过在环己酰亚胺（CHX）上电镀去除覆盖质粒，只留下测试Dre2-TRP1号机组质粒（底部面板）。结果表明：DRE2型是生存所必需的，而缺失可以通过酵母野生型蛋白、人类同源物、点突变体的表达来挽救dre2-137（图纸2-137）或Δ26和Δ119截断，但不包括N末端氨基酸为1至25的片段。

的同源物酿酒酵母Dre2存在于真菌、植物和动物（称为CIAPIN1或anamorsin）中，但显然不存在于细菌中。酵母和人类蛋白质之间的相似性如Clustal比对所示（图。​（图3A）3A级)其特征是九个半胱氨酸中的八个与分布在蛋白质中的保守元素对齐。因此，我们努力测试酵母中表达的人类蛋白的互补活性。这个{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q6F181”，“term_id”：“81612893”，“term_text”：“Q6F181“}}Q6F181问题编码人类Dre2同源物（huDre2）的开放阅读框被克隆到TRP1号机组标记质粒。将人类蛋白表达质粒、酵母蛋白表达质粒或空质粒转化到Dre2洗牌菌株，并用放线菌酮处理转化子以去除洗牌质粒。在这些条件下，huDre2和酵母Dre2补充了致死性，而质粒为空的菌株没有生长。huDre2蛋白通过免疫印迹高度表达，尽管如这些细胞中未校正的Leu1活性所示，生物化学互补是不完整的（见下文）。

染色体的启动子交换DRE2型发起人镀锌1启动子在不同的酵母遗传背景下进行(23)，回交后，用Δ3号夫人Δ4号mrs被隔离（图。​（图4）。4). 诱导的基因组拷贝DRE2型与Δ结合3号夫人Δ4号mrs比单个突变体的情况稍差（图。​（图4B），4B类)与合成剂量致死性一致，但受抑制DRE2型与Δ结合3号夫人Δ磁共振波谱4更糟糕的是，从而重现了dre2型遗传筛查中的突变等位基因（图。4B和C). Δ3号夫人Δ磁共振波谱4菌株与其他突变体杂交或镀锌1-调控菌株和重组子被分离出来（图。​（图5）。5). 带有Δ的重组子3号夫人Δ4号mrs和抑制Gal-Atm1或Gal-Cfd1（图中用星号表示。​图5）5)与单独的突变体相比，它们形成了更小的菌落，表现出合成致死或合成致病相互作用。当Δ磁共振3Δ4号mrs与参与Fe/S簇组装的线粒体基质成分结合（Gal-Ssq1或Δisu1型)（由图中的数字符号表示。​图5）。5). Δ的十字3号夫人Δ4号mrs具有nfs1-14号文件，一种必需半胱氨酸脱硫酶的低形态突变体(20)显示在线粒体内外都起作用(29)，未显示任何合成交互作用。Δ的十字3号夫人Δ4号mrs带Δyfh1型，推测参与Fe/S簇合物合成的铁传递的frataxin同源物显示出显著的合成相互作用(47). 总之，这些遗传结果是复杂的，但提供了一些建议，即Dre2可以与线粒体外Fe/S簇组装途径的成分进行分组。

在单独的窗口中打开

图4。

使用Gal-Dre2综述合成相互作用。Gal-Dre2（98-67）与Δ交叉3号夫人Δ4号mrs菌株（87-13），产孢，在葡萄糖或半乳糖平板上解剖。（A） 显示的是在葡萄糖平板上解剖得到的四分体孢子克隆。盒装四分体是一种具有指定基因型的四分型。第d行中的孢子克隆被认为代表Gal-Dre2Δ3号夫人Δ4号mrs显微镜下可见，在不到20个细胞处被捕。（B和C）从半乳糖平板中取出不同基因型的四分体克隆并用水稀释，在半乳糖板（B）或葡萄糖板（C）上发现系列稀释液。注意诱导Gal-Dre2Δ的轻微生长缺陷3号夫人Δ4号mrs在半乳糖平板上，表明了合成剂量效应。在葡萄糖平板上，三重突变体（抑制Gal-Dre2Δ3号夫人Δ4号mrs)比单个突变体Gal-Dre2或Δ3号夫人Δ4号mrs应变。

在单独的窗口中打开

图5：。

遗传相互作用表型。基因缺失菌株或镀锌1启动子互换与一个具有Δ的同源菌株杂交3号夫人Δ4号mrs删除。在孢子形成和分离后，对四分体克隆的菌落大小和基因型进行评估。对于Gal-Cfd1或Gal-Atm1（用星号表示），三个突变集落小于单个或双突变体，但对于Gal-Ssq1或Δisu1型（用数字符号表示）。WT，野生型。

在含有Mrs3和Mrs4突变体的筛网中分离出Dre2，推测其为线粒体铁转运蛋白，因此，寻求与铁代谢的联系。J137的回交可以分离出不同基因型的重组体，令人惊讶的是，其中包括三个突变株（Δ磁共振3Δmrs4 dre2-137)尽管后者增长极为缓慢。对不同基因型的菌株在一系列可用铁浓度的平板上进行铁依赖性生长评估（图。​（图6）。6). 如前所述(21)，Δ3号夫人Δ磁共振波谱4在铁浓度最低时，菌株表现出生长受限（图。​（图6A，6A级, Δ第3/4夫人)以及在较高铁浓度下恢复正常生长（图。6B至D, Δ第3/4夫人). 这个dre2-137（图纸2-137）单个突变体也表现出铁依赖性生长，尽管这仅通过铁的添加得到部分纠正。Δ3号夫人Δmrs4 dre2-137三重突变体比Δ3号夫人Δ4号mrs或dre2-137（图纸2-137）突变体分别位于低铁板上（图。6 A至C)但不适用于高铁板（图。​（图6D）。第6天). 这些数据表明Δ3号夫人Δ4号mrs和dre2-137（图纸2-137）并且还表明，向生长介质中添加铁可以减轻这种影响。

在单独的窗口中打开

图6。

突变体的铁依赖性生长。J137（97-19）与MRS3 MRS4对亲本菌株（84-9）进行孢子化，并对四分体进行解剖和分析，生成不同基因型的活克隆：野生型（97-53）、Δ第3/4夫人(97-52),第2-137页（97-55），以及dre2-137（图纸2-137）Δ第3/4夫人(97-54). 用水冲洗细胞，5×10的1:5系列稀释液⁵细胞被镀在铁锌缓冲板上。螯合剂板含有50mM吗啉乙磺酸缓冲液（pH 6.1）和1mM铁螯合剂铁锌（A）或与20μM硫酸亚铁铵（B）、100μM硫酸亚铁铵（C）或350μM硫酸亚铁铵（D）相同的螯合剂。与野生型相比，Δ第3/4夫人和dre2-137（图纸2-137）菌株表现出铁依赖性生长，三重突变体在低铁培养板上受损最严重。

以人细胞溶质乌头糖（IRP1）为报告物，检测了Dre2在细胞溶质Fe/S簇合物中的功能。此前，IRP1在酵母的细胞质中表达并被发现具有活性，这表明酵母能够表达人类蛋白并插入其[4Fe-4S]簇(35). 在强GPD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）启动子下含有IRP1的质粒被转化为dre2-137（图纸2-137）突变体和相应的野生型。将转化子培养在具有不同铁浓度的特定葡萄糖培养基中，并通过凝胶内乌头酶分析评估裂解产物的乌头酶活性（图。​（图7）7) (2,43). 观察到与内源性线粒体乌头酶（Aco1）和质粒表达的细胞质异源乌头酶相对应的两条带。线粒体乌头酸酶在所有样品中均得到一致表达，但IRP1在野生型和突变型菌株中均表现出对培养基中铁添加的依赖性。然而，在dre2-137（图纸2-137）突变体中，铁水平显著降低，即使在最高铁水平也没有达到野生型的活性。在将Dre2表达的诱导条件（含棉子糖和半乳糖的培养基）转换为非诱导条件（不含半乳糖棉子糖）后，对Gal-Dre2菌株进行了类似的实验。在这个实验中（图。​（图8），8)Aco1活性高于IRP1活性，可能是由于碳源效应。这些细胞生长在棉籽糖-半乳糖或棉籽糖中，因此不会受到分解代谢抑制，从而提高线粒体顺乌头酸酶活性。GPD启动子表达的IRP1也由于碳源效应而不太高表达。然而，IRP1活性在零时间点Dre2耗竭的时间过程中以及转换到非诱导状态后的2或4小时内出现，在6小时时降低，此后几乎不存在（图。​（图8A）。第8页). 相比之下，线粒体Aco1活性在6小时时增加，在8小时和10小时时显著增加，然后略有下降（图。​（图8A）。第8页). Gal-Dre2抑制的裂解物中IRP1蛋白水平最低，Pgk1没有改变（图。​（图8B），8B类)表明Dre2缺失细胞保留了IRP1载脂蛋白的表达。总之，在低形态突变体和野生型缺失实验中，结果表明IRP1细胞质乌头酶活性依赖于不同碳源中的Dre2。

在单独的窗口中打开

图7。

野生型和野生型不同铁生长条件下的异源IRP1活性dre2-137（图纸2-137）突变菌株。CDV38a野生型（菌株84-1）和第2-137页用质粒（YCplac22-GPDprom-IRP1，质粒18-3）转化突变株（菌株97-55）以表达人细胞溶质乌头糖IRP1。细胞在规定的选择性葡萄糖培养基中生长到固定相以保持IRP1质粒并稀释至OD₆₀₀在相同成分的培养基中添加不同数量的铁作为硫酸亚铁铵。经过四次加倍后，收集细胞并用酶消化，用天然凝胶电泳分离100μg细胞裂解液。如前所述，通过凝胶内分析揭示了天然凝胶电泳分离的裂解液中乌头酶的活性(2,43). 指出了内源性线粒体乌头酶活性（Aco1）和质粒表达的细胞质乌头酶活力（IRP1）的位置。泳道1、2、3、4和5分别是在添加了0、100 nM、1μM、10μM和20μM的铁中生长的野生型裂解物。车道6、7、8、9和10为dre2-137（图纸2-137）菌株分别在添加铁的0、100 nM、1μM、10μM和20μM中生长的裂解产物。11号通道含有100μg纯化线粒体。

在单独的窗口中打开

图8。

Dre2缺失细胞缺乏IRP1活性。用YCplac22-GPDprom-IRP1（质粒18-3）转化Gal-Dre2菌株（98-67）。细胞在半乳糖（含2%棉子糖和0.5%半乳糖的规定培养基）存在下生长，离心，并在无半乳糖情况下重新悬浮指定时间，从而耗尽Dre2。（A） 耗尽时间过程：在换班后立即收集细胞（零时间），并在换班2、4、6、8、10、12、14和16小时后收集细胞。酶解酶消化产生的裂解物通过天然凝胶电泳进行解析，并进行了附子酶的凝胶内测定。线粒体顺乌头酸酶活性（Aco1）和质粒表达的细胞质顺乌头酸酶活性（IRP1）均显示出来。最左边的通道（“mito”）含有100μg来自未转化亲本菌株YPH499的纯化线粒体。（B） IRP1蛋白的免疫印迹。通过SDS-PAGE分析未转化亲本菌株YPH499（第1道）的全细胞裂解物、诱导表达IRP1的Gal-Dre2（第2道）和生长16小时后未诱导表达IRP1的Gal-De2（第3道），并用抗IRP1或细胞质标记Pgk1进行免疫印迹作为对照（每道100μg蛋白质）。wt，野生型。

苹果酸异丙酯异构酶（Leu1）活性也被用作细胞质Fe/S簇状态的指示物(15). 这种细胞质酶含有[4Fe-4S]簇并催化酵母细胞质中亮氨酸生物合成的第二步(18). 带有C末端His的Leu1过表达质粒₆tag被引入Gal-Dre2菌株，可以追踪Leu1蛋白水平。转化后的Gal-Dre2菌株在诱导或非诱导的特定培养基中培养16 h。在测量Leu1活性之前，制备细胞质裂解物并通过顺序硫酸铵沉淀进行分级。对于诱导细胞，Leu1-His₆蛋白质和异构酶活性存在于50%至65%的组分中。活动记录为OD随时间变化的减少₂₃₅，由消耗柠檬酸盐引起(18). Dre2诱导的裂解物的吸光度连续下降，三次连续追踪的吸光度下降率相似（图。​（图9A，9安，左面板），而Dre2抑制的裂解物的吸光度没有变化，表明检测不到Leu1活性（图。​（图9A，9安，右侧面板）。在30分钟内，还测量了不同数量的裂解物的活性。Dre2诱导的样品表现出对输入裂解物量的依赖性，而Dre2抑制的样品在任何情况下都没有活性（图。​（图9B）。9亿). 抗His的蛋白质印迹分析₆抗体显示同等数量的Leu1-His₆-在抑制（R）或诱导（I）条件下标记的蛋白质（图。​（图9B，9亿，插图）。因此，Dre2缺失细胞裂解液中没有Leu1活性，但Leu1蛋白（可能是载脂蛋白）仍然存在。

在单独的窗口中打开

图9：。

Dre2缺失的细胞缺乏异丙基苹果酸异构酶（Leu1）活性。带有质粒pRS426-Leu1-His的Gal-Dre2菌株₆在含有半乳糖-棉子糖或棉子糖的选择性培养基中培养，以耗尽Dre2。（A） 苹果酸异丙酯异构酶（Leu1）活性记录为OD的降低₂₃₅由Dre2诱导的（左图）或耗尽的（右图）部分纯化的裂解液中人工底物柠檬酸盐的异构化引起。在室温下记录示踪3分钟，并对每个10μl裂解液重复两次，相当于100μg蛋白质。（B） Leu1活性（OD减少₂₃₅对于Dre2抑制（R）或诱导（I）裂解物，测量50、100或200μg细胞裂解物。试验进行了三次，结果相似，每种情况下抑制样品的活性可忽略不计。插图：用抗-His抗体进行免疫印迹。用100μg来自抑制和诱导样品的蛋白质测量50%至65%硫酸铵部分的活性和蛋白质。

最近发现，具有Fe/S簇形成缺陷的突变体，如CIA突变体（例如，Cfd1、Nbp35、Nar1和Cia1突变体），可能是由于Rli1功能障碍，在细胞核中表现出核糖体蛋白绿色荧光蛋白（GFP）报告子的保留(16,45). Rli1是一种Fe/S簇合蛋白，在细胞核和细胞质之间穿梭并调节细胞核中核糖体的加工(16,45). Eduard Hurt为我们提供了质粒Rpl25-eGFP和Rps2-eGFP，分别表达与GFP报告子融合的核糖体大亚基和小亚基蛋白，用于评估Dre2表型，因为它在许多方面与其他CIA成分相似(45). 用报告质粒转化的Gal-Dre2细胞在含有或不含半乳糖的特定培养基中培养16小时，然后在显微镜下检查DAPI和GFP信号。Dre2表达细胞（图。10个，上部面板）用DAPI染色，但显示可忽略的弥漫性GFP信号。相反，在Dre2缺失的细胞中（图。10个，下部面板），在一些细胞的细胞核中发现明亮的Rpl25-eGFP信号。其他细胞显示更多的核仁信号，在DAPI染色的较大细胞核内形成一个亮点或新月形。许多但并非所有细胞（来自多个显微镜视野的105个细胞中的24个）显示出突变表型；当表达Dre2时，没有细胞显示这种突变表型（155个细胞中的0个）（图。10A和B). 在小核糖体蛋白亚单位Rps2-eGFP融合的平行实验中，同样只有Dre2缺失的细胞显示出强烈的核染色（数据未显示）。因此，核糖体大小亚基蛋白保留在Dre2缺失细胞的细胞核中。此外，与CIA突变体类似，Dre2缺失细胞积累的细胞铁略多于表达细胞（2.45±0.73对1.23±0.24 pmol/μg蛋白质），但未能在线粒体中积累铁（2.65±0.1对3.13±0.1 pmol/微克蛋白质）。

在单独的窗口中打开

图10。

Dre2缺失细胞中核糖体蛋白的核滞留。质粒pRS316-Rpl25-eGFP转化为Gal-Dre2菌株。Dre2蛋白在含有棉籽糖-半乳糖或仅含棉籽糖的特定培养基中分别生长16小时后表达或耗尽。（A）显示了Gal-Dre2诱导（顶部）和Gal-Dre-2缺失（底部）细胞的DAPI和Rpl25-eGFP荧光图像。（B） Dre2耗竭后来自Gal-Dre2培养物的单个细胞，显示差异干扰对比度（DIC）（a）、DAPI（B）和Rpl25eGFP（c）图像。GFP荧光信号只有在Dre2耗尽的条件下才出现核积累。

为了在细胞中定位Dre2蛋白，HA_三表位标签插入基因组中Dre2的C末端(23). 该改良菌株在生长和Fe/S簇组装活性方面与亲本对照无明显区别。进行亚细胞分离，在细胞质和线粒体中发现标记的Dre2（图。​（图11）。11). 携带Dre2 HA的细胞_三用酶处理去除细胞壁，然后用Dounce匀浆使细胞破裂。总裂解物（T）在47 kDa时显示出强烈的HA信号迁移，并且在低速离心使未破碎的细胞和细胞核颗粒化后，HA信号未减弱（数据未显示）。然后将裂解产物分为PMS和CM。CM在Nycodenz梯度（GM）上进行额外的纯化步骤。Dre2-HA_三蛋白质存在于PMS和线粒体组分中，无论是粗的还是梯度纯化的（图。11安). HA的模式_三就线粒体定位而言，在细胞组分中是模棱两可的。虽然是HA的信号_三在纯化的线粒体中发现，胞质标记物磷酸甘油酸激酶（PGK）的信号也存在。然而，HA的相对抗性证明线粒体中存在Dre2_三涉及蛋白酶处理。用蛋白酶K处理细胞组分，中和蛋白酶，并通过免疫印迹观察剩余蛋白质。线粒体Dre2-HA_三在CM和GM中受到保护，而线粒体外蛋白未被发现，可能被消化（图。11亿，左侧面板）。对蛋白酶消化的保护与一部分Dre2在线粒体膜结合室中的定位一致。用胰蛋白酶或蛋白酶K处理的CM重复该实验。获得了类似的结果，表明Dre2-HA的一部分具有蛋白酶保护作用_三相反，Tom70是一种暴露的线粒体外膜蛋白，它被任一蛋白酶消化，而基质蛋白Yfh1则没有被消化（图。11亿，右侧面板）。线粒体Dre2-HA_三CM受到低张休克，离心后收集IMS内容物并从线粒体颗粒中分离。线粒体Dre2-HA_三信号几乎全部出现在上清液部分，表明该蛋白存在于IMS中。该蛋白的行为类似于已知的IMS蛋白Ccp1。IMS蛋白负荷增加与Ccp1信号增加和Dre2-HA增加相关_三信号。相比之下，基质蛋白Yfh1的IMS反应性没有增加，这与该部分中存在少量基质污染一致（图。11摄氏度). 因此，Dre2-HA_三在细胞质和线粒体IMS中发现。

在单独的窗口中打开

图11：。

Dre2-HA的细胞定位_三（A）用SDS-PAGE从总细胞裂解物（T）、PMS、CM和GM中分离出等效蛋白量（100μg）并进行印迹，印迹用HA标签、Yfh1（线粒体）或Pgk1（细胞质）抗体形成。（B） 细胞组分在冰上用蛋白酶K处理30分钟，并通过HA印迹分析（左面板）。CM用蛋白酶K或胰蛋白酶处理，并用HA印迹法或抗Tom70或Yfh1的对照抗体进行分析（右表）。（C） CM接受低渗休克治疗，恢复IMS（分别为100、200或500μg，指定为1X、2X或5X）或有丝分裂体（100μg，标记为1X），并用HA、Ccp1或Yfh1抗体进行印迹分析。氨基黑色染色膜显示蛋白质模式。MP，有丝分裂体颗粒。

在初步研究表明细菌中表达的Dre2蛋白是棕色的之后，考虑了辅因子可能参与的可能性，并优化了条件以有利于铁的可用性和蛋白质的溶解性。Dre2和他的₆标记以表示大肠杆菌在低温（25°C）下培养3h，在诱导之前和诱导期间向生长培养基中添加铁。Dre2蛋白在Ni-NTA琼脂糖上纯化，条件是使用脱气缓冲液和添加10%甘油的所有溶液，以最小化氧化剂损伤。纯化蛋白的棕色（图。​（图12，12，inset）表明存在辅因子，酸处理后蛋白质的化学分析表明存在不稳定的铁和硫化物。13 mg/ml或300μM浓度的纯化蛋白释放出265μM铁和396μM硫化物，因此，在这些细菌表达条件下，铁硫化学计量比大约为1:1，可能存在不完全的Fe/S簇负载。

在单独的窗口中打开

图12：。

纯化的Dre2。德雷2-His₆蛋白质在温和条件下快速纯化，最大限度地减少氧化剂损伤和空气暴露，脱气缓冲液中含有10%的甘油。提纯（蓝色示踪）和添加新制的10 mM连二亚硫酸钠（棕色示踪）或10分钟后（绿色示踪），立即记录光谱。空气氧化样品在314、420、458和500 nm处的峰随连二亚硫酸钠还原立即消失，而560 nm的峰消失得较慢。插图：纯化Dre2-His₆与缓冲液（左侧）相比，蛋白质（13-mg/ml浓度）呈深棕色（右侧）。

纯化后立即记录紫外可见吸收光谱，显示出314、420、458和500 nm左右的宽吸收峰/峰肩（图。​（图12，12，Dre2 Ox）。纯化后的Dre2的光谱在室温下数小时内没有变化，这表明Dre2蛋白在有氧条件下相对稳定。在连二亚硫酸钠还原后，整个可见区域的吸光度被猝灭（图。​（图12，12，Dre2红色）。数据表明，Dre2含有具有氧化还原活性的Fe/S簇合物。EPR研究证实了从细菌中分离的Dre2蛋白中存在Fe/S簇（图。​（图13）。13). 在较高温度（45 K）和5 mW微波功率下，连二亚硫酸钠还原蛋白显示出[2Fe-2S]簇的EPR谱克值(克_{z、 y、x}分别=2.00、1.96和1.92）（图。13安). 在低温（6K）和5mW下，还原的Dre2蛋白显示出[4Fe-4S]簇的信号特征。然而，在光谱中仍然有来自[2Fe-2S]团簇的小信号（图。13亿). 因此克值(克_{z、 y、x}分别为2.00、1.95和1.90）。当微波功率增加到20 mW时，[4Fe-4S]团簇的EPR信号大大增强。此外，周围新出现的信号克=2.10和1.80变得明显，表明[4Fe-4S]簇和可能的[2Fe-2S]簇或其他未确认物种之间存在一些相互作用。目前正在进行进一步的详细调查。[3Fe-4S]产生的非常小的EPR信号⁺氧化样品中检测到簇合物。

在单独的窗口中打开

图13。

EPR谱。纯化的Dre2蛋白在45 K和5 mW（A）以及6 K和5 m W（B）下的EPR谱。样品（13 mg/ml）在pH 7.5的50 mM Tris-HCl中，含有50 mM NaCl和10%甘油，用10 mM连二亚硫酸钠还原。EPR条件：微波频率，9.45GHz；调制幅度，8.034 G；调制频率，100 kHz；时间常数，82 ms，主要克指示值。

讨论

在线粒体携带者Mrs3和Mrs4的合成致死性基因筛查中，发现Dre2与铁传递到线粒体有关dre2-137（图纸2-137）突变体携带一个基本基因的功能低下等位基因。突变细胞和Dre2缺失细胞的表型相似，特征是细胞质Fe/S簇蛋白活性缺乏，线粒体Fe/S团保留。合成致死性的铁依赖性（低铁时更差）可以通过Dre2突变体中缺陷细胞质Fe/S簇组装的部分铁依赖性恢复来解释。细胞质铁缺乏与Δ3号夫人Δ4号mrs激活液泡铁摄取导致的突变(21)，可能与受损的细胞质Fe/S簇合物结合在一起dre2型突变体组装产生致命性。

的表型dre2型突变体或Dre2缺失细胞类似于所谓的CIA成分(22,35). 线粒体外含Fe/S簇的蛋白质缺乏，而线粒体内的Fe/S团（乌头糖和琥珀酸脱氢酶）保持不变或在某些情况下增加。苹果酸异丙酯异构酶（Leu1）和IRP1（酵母细胞质中表达的人细胞溶质乌头糖酶）在两种基因中均显著受损dre2型突变和Dre2缺失细胞。此外，在Dre2缺失的细胞中，大小核糖体亚基的GFP标记蛋白Rpl25和Rps2保留在细胞核和核仁中，这表明核糖体组装功能有缺陷，可能是由于Rli1缺乏。Rli1是一种细胞质和细胞核的Fe/S簇合蛋白，是核糖体成熟和翻译起始所必需的(16,45). 有趣的是，一篇描述全面的酵母温度敏感突变资源的出版物在染色体传输保真度中暗示了温度敏感的Dre2等位基因(5). 最近发现的参与DNA修复的Fe/S簇蛋白（Rad3、Pri2和Ntg2）可能是这种效应的介质，但这尚未在实验中得到证实。

细胞质Fe/S簇合物的合成必须涉及簇合物本身的主要成分铁和硫的传递。支架、伴侣和还原剂的其他作用可能与线粒体Fe/S簇的合成有关(22). 细胞质Fe/S簇的铁和硫可能起源于线粒体内部并被运输出去，或者这些成分可能来源于线粒体外部，或者两者兼而有之。为Fe/S簇合成提供硫化物的唯一半胱氨酸脱硫酶具有线粒体内外的双重定位。其他成分，即使是通常或主要存在于线粒体基质中的成分，也已被证明在一些细胞中具有替代性的线粒体外定位(8,29,43). 线粒体外的Fe/S簇需要CIA蛋白（Cfd1、Nbp35、Nar1和Cia1）。蛋白质本身主要存在于细胞质和细胞核中，这些蛋白质的线粒体定位尚未报道。它们本身是Fe/S簇蛋白（除Cia1外），协调[4Fe-4S]簇(22). 其中两种蛋白质，Cfd1和Nbp35，是同源的，并且彼此之间有强烈的相互作用，形成了暂时相关簇的支架，可以转移到诸如Leu1等底物蛋白质(30). 其他组装蛋白的作用尚未被很好地描述，但它们可能在组装过程中作用于Cfd1和Nbp35之后(30).

Dre2在这一过程中的作用尚未明确，尽管线粒体IMS中一部分蛋白质的定位令人感兴趣。如果Fe/S簇组装的关键成分从线粒体运输到细胞质，如其他地方所建议的那样(15)这可能表明线粒体IMS中的Dre2的功能先于细胞质中的其他CIA成分。线粒体中的Dre2可能产生一种成分或信号，允许细胞质中随后的组装步骤。另一个尚未解决的问题与Fe/S团簇组件中团簇的功能有关。不同的Fe/S团簇具有明显不同的功能。例如，Cfd1-Nbp35簇被证明是不稳定的，并且容易转移到受体载脂蛋白，这表明它们是支架组分。相比之下，体内需要Nar1簇，体外Fe/S簇组装则不需要(30). Dre2中[2Fe-2S]团簇的存在是独特的，因为其他组件中的Fe/S团簇都是[4Fe-4S]型。此外，Dre2的簇显然比其他组分的簇更稳定，因为它们在净化过程中即使暴露在空气中数小时也不会散开。人们可以想象Dre2在铁结合和铁还原中的特殊作用，可能涉及酸性斑域和Fe/S簇，尽管这是非常推测的。这种还原酶活性的电子源仍需确定。

线粒体由不同的亚室、外膜、IMS、内膜和基质组成。Dre2为细胞核编码，但具有双重定位，既存在于细胞质中，也存在于线粒体IMS中。问题是如何实现这种双重本地化。线粒体蛋白质必须通过靶向信号引导至IMS，以允许通过导入的转位酶。随后，IMS蛋白必须通过折叠或与伙伴蛋白相互作用而保留在这个隔间内(31). 在某些情况下，折叠步骤由由Mia40和Erv1组成的专用氧化酶机制介导，形成二硫化物并将底物困在IMS中。Mia40-Erv1的大多数已知底物是具有特征半胱氨酸基序的小蛋白（孪生CX_三C、 双CX₉C、 或最近发现的孪生CX₂C）(12). 有趣的是，Dre2有两个CX₂尽管Dre2比其他Mia40-Erv1底物大，但与其他一些IMS蛋白类似的C基序。双细胞蛋白分布可以用线粒体外Dre2前体的折叠与IMS内的氧化折叠（和捕获）竞争的动力学过程来解释(25). 铜锌超氧化物歧化酶Sod1也有类似的蛋白质分布(42). 在Sod1的情况下，通过与Ccs伴侣相互作用，介导在该空间形成关键的二硫键，以及伴侣辅助的辅因子插入，前体被困在IMS中(42). Dre2可能在IMS中经历类似类型的加工、氧化折叠和辅因子插入。IMS体积很小，可能小于蜂窝体积的0.5%(42)因此，尽管Dre2（如Sod1）与总细胞蛋白群体相比似乎含量较低，但IMS内的局部浓度可能相当高。

Dre2的另一个独特特征是，它是IMS中的可溶性Fe/S簇蛋白。虽然没有直接证明这些簇是以IMS定位形式存在的，但这将是非常新颖的，并提出了许多关于不同细胞室中Fe/S簇生物发生的新问题。线粒体IMS中存在的蛋白质必须通过外膜TOM转定位酶进入该隔室。后者只允许未折叠的蛋白质，因此，具有辅因子的蛋白质存在于IMS中，被认为是在折叠到这个隔间时获得辅因子的(31). 以类似的方式，Dre2可以在细胞质核糖体上翻译，以未折叠状态导入IMS，然后在IMS内装载其Fe/S簇。然后必须考虑IMS中是否存在IMS机械或少量CIA机械部件。就IMS Fe/S簇合蛋白而言，唯一的另一个例子是复合物III的Rieske蛋白。该蛋白含有Cx₂C基序和分子内二硫化物，表明它可能与氧化陷阱途径相互作用(12). 然而，与Dre2不同的是，Rieske蛋白与内膜相连，并与呼吸复合物III的其他蛋白质组分相关。Rieske蛋白质与复合物III组装需要一种称为Bcs1的特殊伴侣(32). 其Fe/S簇的生物成因尚未根据遗传和生化要求进行研究，Rieske蛋白Fe/S集群的成分，如Dre2生物成因的成分，可能来自线粒体内部和/或细胞质。

Dre2序列和序列基序在酵母和人类之间保守，人类蛋白能够纠正酵母Δ的致死性dre2型删除。然而，就细胞质Fe/S簇组装功能的生化校正而言，互补并不完全。数据可能表明，酵母Dre2的Fe/S簇组装功能部分由人类蛋白质提供，但效率低下，或者酵母Dre1和人类Dre2具有重叠和不同的功能。哺乳动物同源物的研究主要集中在它们的抗凋亡作用上，而这些同源蛋白尚未与Fe/S簇组装相关，也未显示携带Fe/S团簇。人类同源物，命名为CIAPIN1（细胞因子诱导的细胞凋亡抑制剂1），被发现在癌症耐药性的背景下上调。此外，其在HL60细胞系中的过度表达使其对癌症药物（阿霉素和长春新碱）产生耐药性(10). 在细胞分馏研究中，发现人类蛋白存在于细胞质、细胞核和核仁中，但线粒体没有被特别检测(11). 发现Dre2（anamorsin）的小鼠同源物可防止前B细胞系Ba/F3在细胞因子退出时发生凋亡(38). 此外，由于明确的造血缺陷，小鼠对anamorsin的敲除是无效的。细胞因子引起的髓系和红系集落形成活性受到严重破坏，可能是由于细胞凋亡异常所致(38). 人类或小鼠Dre2同源物在阻止凋亡和促进造血细胞发育方面的作用机制尚未阐明。一种可能性是哺乳动物Dre2同源物相互作用并负向调节IMS中的关键凋亡成分（例如细胞色素c（c）). 或者，如果Fe/S簇合物合成需要哺乳动物同源物，如酵母Dre2，则其抗凋亡活性可能由未知的Fe/S集群蛋白介导。

致谢

脚注

参考文献