美国国家科学院院刊。2008年5月13日；105(19): 6924–6929.
腊肠通过抑制白介素-8抑制致癌诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭
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安东内拉·卡索拉
†德克萨斯州加尔维斯顿德克萨斯大学医学分院感染科儿科，邮编77555-0366
理查德·佩塞尔
*癌症生物学和
‡马萨诸塞州费城南十街233号托马斯·杰斐逊大学肿瘤医学院，邮编：19107；和
*癌症生物学和
‡马萨诸塞州费城南十街233号托马斯·杰斐逊大学肿瘤医学院，邮编：19107；和
†德克萨斯州加尔维斯顿德克萨斯大学医学分院感染科儿科，邮编77555-0366
由Hilary Koprowski，宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学，于2008年3月10日传达。
作者贡献：S.K.、A.L.和M.L对本作品的贡献相等；KW设计研究；K.W.、S.K.、A.L.、M.L.、X.Ju、V.M.P.和X.Jiao进行了研究；A.C.提供了新试剂/分析工具；K.W.、M.P.L.和R.G.P.分析数据；R.G.P.写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
癌基因介导的向宿主环境的信号传导可诱导细胞因子和趋化因子的子集。这个果蝇Dac该基因促进眼睛发育过程中形态发生沟的迁移。细胞脂肪决定因子的表达腊肠犬（DACH1）在预后不良的浸润性乳腺癌中丢失。小鼠胚胎成纤维细胞来源于第1天−/−小鼠表现出内源性第1天构成性抑制细胞迁移。DACH1抑制癌基因（Ras、Myc、ErbB2、c-Raf）转化的人类乳腺上皮细胞的细胞迁移和侵袭。一项无偏见的蛋白质组分析和免疫中和抗体及重组实验表明，IL-8是DACH1介导乳腺癌细胞迁移和转移的关键靶点体内DACH1结合内源性白介素-8ChIP分析中的启动子并抑制白介素-8启动子通过AP-1和NF-κB结合位点。总的来说，我们的数据确定了内源性细胞脂肪决定因子通过关键的异质性介质阻断癌基因依赖性肿瘤转移的途径。
关键词：DACH1，转移
控制肿瘤发生的发生和发展的分子事件包括内源性生长抑制剂的顺序失活和致癌突变的获得(1). 癌基因转化细胞获得的功能特征包括摆脱正常生长限制、细胞代谢变化以及迁移和侵入当地宿主环境的能力(2). 细胞迁移对哺乳动物的正常发育、组织修复和癌细胞的转移表型至关重要。粘附在细胞基质上会引发突出活动(三,4). 细胞的定向迁移需要在前缘形成新的粘附结构和后缘的分离(5).
癌基因维持宿主与细胞之间的相互作用，促进侵袭性，招募炎症介质和发展血管生成网络。Ras和Myc通过上调VEGF和抑制血小板反应蛋白1（TSP-1）促进肿瘤血管生成(6). 此外，Ras激活可诱导炎症介质。炎症介质白细胞介素-8（CXCL-8/IL-8）是Ras的转录靶点，在Ras诱导的肿瘤生长和血管生成中发挥重要作用体内(7,8). 通常抑制人类乳腺癌中这些致癌途径的分子机制尚不清楚。
人乳腺癌中细胞脂肪决定因子DACH1表达降低与预后不良相关(9). 对2000多个人类乳腺癌样本的分析表明，DACH1表达的缺失与40个月前乳腺癌的死亡相关。这个果蝇腊肠(数模转换器)基因是DACH核蛋白亚家族的创始成员，在促进细胞分化中起着重要作用果蝇属眼睛和四肢(10). 这个数模转换器基因构成视网膜决定（RD）信号通路的一部分果蝇属。RD路径需要无眼的(艾娅/第6页),眼正弦(所以,六),眼睛缺失(艾娅/埃亚）、和腊肠犬(数模转换器/达奇)，它们共同作为这个网络的遗传成分发挥作用(11——13). 在果蝇属,所以作为DNA结合因子发挥作用数模转换器/艾娅是转录辅因子。在哺乳动物细胞中，c-Jun作为DNA结合因子发挥作用，DACH1通过其调节基因转录，从而抑制细胞生长(14). DACH1在细胞迁移或侵袭中的作用尚不清楚。鉴于DACH1在转移性乳腺癌中的表达降低，我们研究了DACH1对人类乳腺癌细胞迁移和侵袭的调节作用。
结果
为了确定DACH1是否调节不同癌基因的促迁移作用，使用了不朽的人类乳腺MCF10A细胞。与亲代细胞相比，MCF10A-Ras细胞的迁移增加了约30倍，在DACH1诱导后，transwell迁移减少了>75%(A） ●●●●。DACH1表达降低细胞运动率≈30%(B类). DACH1的晶体结构预测了具有保守结构域的螺旋-转-螺旋结构(D类交流和S公司ki/Sno域1）。DS结构域的缺失消除了DACH1抑制细胞跨井迁移的作用(C类). 用激活的ErbB2表达载体转导的MCF10A细胞诱导迁移15倍，DACH1表达减少60%(C类)不影响ErbB2表达(D类). DACH1诱导c-Myc转化的MCF10A细胞迁移减少50%(E类)不影响c-Myc丰度[支持信息（SI）图S1A类].
DACH1抑制癌基因诱导的乳腺癌细胞迁移。(A类)用编码GFP或DACH1-IRES-GFP的逆转录病毒表达载体转导MCF10A或MCF10A-Ras细胞，并进行GFP-FACS分类，随后通过跨孔分析进行细胞迁移分析。数据显示为迁移细胞数量的平均值±SEMn个>5个单独的实验。显示了在transwell分析中迁移的MCF10A-Ras细胞的结晶紫染色。(B类)对单个细胞进行视频显微镜定量，以确定转染对照（GFP）或DACH1表达载体的MCF10A-Ras细胞的细胞迁移距离和方向。(C类)分析MCF10A-ErbB2（NeuT）转化细胞的迁移情况。显示了用编码GFP或DACH1-IRES-GFP的逆转录病毒载体转导的MCF-10A癌基因转化细胞的每个场迁移细胞数的平均数据。(D类)MCF10A-ErbB2细胞的Western blot分析显示C类带有所示抗体。(E类)用DACH1或控制载体转导的MCF10A-c-Myc细胞进行迁移分析，如A类. *,P（P）<0.01。
为了确定DACH1是否抑制Ras诱导的Ras下游迁移，我们检测了Ras效应物c-Raf。DACH1表达降低MCF10A-Raf跨阱迁移约50%(A类)并抑制伤口闭合>80%(B类). DACH1抑制迁移方向性的持续性，使细胞速度降低40%，细胞距离迁移50%(C类).
DACH1抑制伤口愈合和迁移方向的持续性。(A类)MCF10A-Raf转化细胞的迁移分析。用编码GFP或DACH1的逆转录病毒载体转导细胞。数据为五个单独实验的平均值±SEM，用于任一井间迁移(A类)，伤口闭合分析(B类)或相位对比视频显微镜(C类). 测定用控制载体或DACH1转导的单个MCF10A-Raf细胞的迁移速度和迁移距离。数据平均值±SEMn个>5个单独的事件。(D类)用对照（GFP）或DACH1转化的MCF10A-Ras/ErbB2细胞的迁移分析。数据平均值±SEMn个>5个单独的实验(左侧)或在表达GFP、DACH1或DACH1 DS结构域突变（DACH1ΔDS）的细胞产生的上清液中进行跨孔分析(赖特). 在来源于DACH1转导细胞的培养基中，迁移减少。DACH1和DACH1ΔDS域的示意图。*，P（P）<0.01。
与MCF10A细胞相比，癌基因转导的MCF10A细胞（Ha-Ras/ErbB2）增强了细胞迁移，DACH1的表达使细胞迁移减少了6倍(D左). 添加来自DACH1转导的MCF10A-Ras/ErbB2细胞的条件培养基可使细胞迁移减少>60%(D右侧). 相反，来自MCF10A-Ras/ErbB2细胞的上清液经含有DACH1 DS结构域突变的DACH1蛋白转导后，并未显著抑制细胞迁移(D右侧).
总之，这些研究表明，DACH1抑制由不同癌基因（Ha-Ras、c-Raf、c-Myc和ErbB2）转化的MCF10A细胞的迁移。高转移性MDA-MB-231人乳腺癌细胞系由编码DACH1的表达载体在磷甾酮A反应增强子的控制下转导(9,14). MDA-MB-231细胞在基质凝胶中的细胞集落远端出现扩张性微突起(A上部，放大400倍）。相反，DACH1的诱导基本上消除了扩展过程的数量(A下部).
DACH1抑制高转移性MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。(A类)诱导表达DACH1的MDA-MB-231细胞的相差显微镜观察(下部)与车辆处理细胞相比(上部). （放大倍数：左侧, 200×;赖特, 400×.) (B–D类)对稳定表达磷甾酮A诱导的DACH1的MDA-MB-231细胞进行跨阱迁移评估(B类)、基质凝胶入侵(C类)，伤口闭合(D左)或通过视频显微镜在单细胞水平上分析速度(D右侧)，平均数据显示为360分钟*，P（P）<0.01。
进行侵袭试验，比较诱导表达DACH1的细胞(B类). 波那斯特龙A诱导的DACH1表达使穿过跨阱室的细胞数量减少了50%以上(B类). 相反，波那斯特龙A单独对细胞迁移没有直接影响(B类). DACH1表达的诱导使侵入基质凝胶产品的细胞数量减少约65%(P（P）< 0.001C类). 类似地，DACH1的表达减少了伤口闭合(D左)和迁移速度(D右侧)约60%。
与癌基因转化的MCF10A细胞一样(E类)，DACH1转导的MDA-MB-231细胞的上清液足以阻止MDA-MB231细胞的迁移(A类). 采用无偏见的蛋白质组学方法，通过抗体阵列分析确定受DACH1表达调控的候选蛋白，证明DACH1的表达与IL-8和相关趋化因子IL-1、IL-6、GRO和MIP1（α、β、γ）分泌减少相关(B类). IL-8（而非相关的趋化因子GRO、MCP1或MIP1α）能够挽救DACH1介导的迁移缺陷(C类).
DACH1调节的趋化因子的蛋白质组分析。(A类)用来自溶媒对照细胞或波那司酮A处理细胞的条件培养基处理MDA-MB-231细胞的跨阱迁移分析。(B类)对MDA-MB-231细胞的上清液进行细胞因子阵列分析，该上清液经载体或磷甾酮A处理后诱导DACH1，确定了一组受DACH1差异调节的细胞因子。将DACH1表达细胞（PonA）与对照组进行比较，显示出相对丰度。(C类)用细胞因子（包括5 ng/ml的白细胞介素-8或对照IgG）处理的MDA-MB-231细胞的Transwell迁移分析。细胞迁移显示为每个场的细胞数，数据为平均值±SEMn个>5个单独的实验。(D类)在存在IL-8或载体的情况下，对表达对照（GFP）或DACH1的MCF10A-Ras细胞进行三维胶原侵袭试验。平均迁移深度显示为平均值±SEM(E类)MEF的细胞迁移来源于第1天WT或敲除小鼠，使用延时视频显微镜。第1天−/−（KO）MEF显示细胞迁移速度和距离增强(P（P）< 0.01). (F类)注射转导pLRT-DACH1的Met-1细胞、用载体或多西环素DACH1或CRCL1/KC免疫中和抗体治疗的裸鼠肺转移的数量，P（P）<0.01。
评估MCF10A-Ras细胞侵袭胶原基质的能力(15)，因为此过程可能会更紧密地概括体内侵袭性表型。5天后在细胞边缘远端发现的不可折射细胞被用作胶原细胞侵袭的测量。DACH1表达减少胶原基质细胞侵袭约50%(D类). IL-8的加入挽救了DACH1介导的细胞迁移抑制。Dach1基因敲除小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）通过延时视频显微镜显示迁移速度和移动距离增加了一倍(E类). 因此，内源性Dach1抑制细胞迁移。
接下来，我们研究了DACH1和IL-8在调节乳腺癌转移中的作用体内使用高转移性乳腺癌细胞系。在跨阱分析中，强力霉素诱导Met-1细胞中DACH1表达抑制迁移(图S2A类和B类). 印度墨水染色和组织病理学证明，所有注射Met-1细胞的小鼠都发生了广泛的肺转移(F类). 由于DACH1抑制MDA-MB-231细胞中IL-8的产生，并抑制小鼠IL-8同源物的产生，CRCL1/KC(16)，在Met-1细胞中(图S2C类)，我们确定了KC（细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子）在Met-1细胞转移中的作用体内将Met-1细胞导入裸鼠后，使用KC的免疫中和抗体。αKC抗体阻断乳腺肿瘤转移(F类).
更改了的表达式白介素-8该基因存在于许多癌症中，其表达增加与乳腺癌细胞的转移潜能密切相关(17)Ras诱导的IL-8表达对肿瘤生长和血管生成至关重要(7). 这个白介素-8该基因与促进乳腺癌细胞迁移密切相关。白介素-8DACH1使MCF10A-Ras和MDA-MB-231细胞的mRNA水平降低约90%(A类). TNF-α依赖性IL-8表达(18)被DACH1表达抑制(A类). DACH1以剂量依赖的方式抑制IL-8启动子，需要DS结构域(B类).
这个白介素-8启动子被需要DS结构域的DACH1抑制。(A类)通过QT-PCR测定表达DACH1的MCF10A-Ras或MDA-MB-231细胞中IL-8 mRNA的丰度。在MDA-MB-231细胞中，TNF-α被用于诱导IL-8的产生。(B类和C类)DACH1表达载体和突变体的示意图-8启动子和点突变荧光素酶报告基因收缩。DACH1对白介素-8作为内部控制，启动子活性被标准化为Renilla荧光素酶活性。数据为平均值±SEMn个>5个单独的实验。(D类)DACH1招募至内源性白介素-8MDA-MB-231细胞中的启动子（如上）或转染白介素-8编码WT、AP-1或NFκB点突变体的启动子结构白介素-8HEK293细胞中的启动子。每项实验都使用FLAG抗体进行了至少两次单独的实验，也使用了具有类似结果的针对DACH1的抗体进行。DACH1补充相对丰度的定量数据白介素-8启动子显示为平均数据。*，P（P）<0.01。
为了确定DACH1抑制白介素-8启动子，检测关键转录调控元件内的一系列点突变(C类). DACH1抑制了白介素-8启动子增加80%。IL-8启动子AP-1位点的突变使IL-8的启动子活性降低75%，导致启动子片段在DACH1介导的抑制中显著减少。同样，NFκB结合位点的突变显著降低了DACH1的阻遏作用(C类). DACH1通过MBA-MB-231细胞中的ChIP分析鉴定，在内源性的背景下使用FLAG抗体白介素-8发起人(D类). 使用FLAG抗体免疫沉淀DACH1的ChIP分析表明，AP-1或NFκB位点突变后招募减少(D类).
讨论
抑制控制癌基因诱导的肿瘤进展和侵袭的异型信号的分子机制尚不清楚。目前的研究表明，在预后不良的侵袭性乳腺癌中，细胞脂肪决定因子DACH1的表达缺失(9)，抑制细胞迁移和转移。我们对2000个以上乳腺癌样本的研究结果与40个月前肿瘤DACH1表达减少的患者死于乳腺癌相关(9). 与正常乳腺组织相比，浸润性乳腺癌中DACH1的表达显著降低，浸润性癌中DACH1的表达与非浸润性癌相比显著降低(9). 使用来源于第1天−/−小鼠，我们在此证明内源性Dach1具有组成性抑制细胞迁移和细胞迁移速度的作用。
Ras诱导的IL-8生成在肿瘤进展中起关键作用(7). 在此，DACH1抑制IL-8的表达和分泌。IL-8的恢复挽救了DACH1诱导的细胞迁移缺陷，并且DACH1或IL-8的鼠同源物的免疫中和抗体（CRCL1/KC）足以阻断乳腺癌向肺部的转移体内总之，这些研究表明DACH1抑制IL-8的产生是DACH1抗迁移功能的关键机制。DACH1抑制乳腺癌细胞迁移，该细胞迁移涉及一种分泌因子，通过无偏见的蛋白质组分析确定为IL-8。DACH1直接抑制了白介素-8启动子，定义乳腺癌趋化因子产生和乳腺癌进展可能被减弱的机制。
生理水平的DACH1抑制了IL-8的产生。DACH1的丰度在细胞周期的2到3倍期间发生变化，而桥甾酮A诱导的细胞总DACH1相对丰度增加了2到3倍数(9). 在稳定表达DACH1的细胞和诱导急性表达DACHl的细胞中观察到IL-8生成的抑制，这表明IL-8的减少不是DACH1持续表达的代偿性延迟次级事件后果的结果。DACH1抑制Ras或c-Myc转化的MCF-10A细胞产生IL-8并抑制IL-8启动子活性(图S1B类和C类). 白细胞介素-8（IL-8）是一种CXC趋化因子，最初被纯化为一种小的碱性蛋白，起中性粒细胞趋化剂的作用(19). 与低转移性乳腺癌细胞系相比，高转移性乳腺肿瘤细胞系产生大量IL-8(20). 目前的研究表明，IL-8的小鼠同源物（CRCL1/KC）也控制细胞转移，DACH1是CRCL1/KC生成的关键调节器。
临床研究证明CXCL-8在人类乳腺癌中上调(17)和非小细胞肺癌(17)、黑色素瘤(21)和结肠癌。CXCL-8的表达与几种肿瘤类型（包括人结肠癌、胰腺癌和前列腺癌）的预后不良和转移表型有关。DACH1表达抑制IL-8分泌、mRNA丰度和白介素-8启动子活性。DACH1抑制白介素-8启动子需要AP-1和NF-κB结合位点，DACH1在白介素-8ChIP分析中局部染色质背景下的启动子。研究表明，DACH1被招募到六个结合位点或AP-1结合位点，并且DACH1在局部染色质的背景下被招募来执行转录调控功能(9,11). DACH1不被认为以特定于DNA序列的方式直接结合DNA。相反，已知DACH1通过向c-Jun的γ结构域招募HDAC1和HDAC3来抑制c-Jun转录激活(14)在ChIP分析中，这并不影响IL-8启动子的c-Jun或p50占有率(图S1D类).
DACH1抑制ERK但不抑制Akt活性(图S1E类)表明ERK在调节IL-8并被DACH1抑制的细胞内信号通路中可能发挥作用。虽然低氧诱导因子1（HIF1）并不直接介导低氧诱导IL-8的机制，但已知低氧诱导IL-8的产生。IL-8的诱导涉及NF-κB(8). 已知致癌Ras和Rac可诱导NF-κB(22)和IL-8丰度(7). DACH1抑制是否涉及NF-κB信号仍有待确定。
人类乳腺癌中DACH1表达降低，DACH1抑制乳腺癌细胞增殖和DNA合成(9). 这个DACH1号机组基因产物与Six相关，Dac/Six共同参与发育中的RD途径。人类癌症中也存在六种蛋白的错误表达(23). HSIX1，人类果蝇六号该基因在乳腺癌中过度表达，强迫Six1表达可减弱G2细胞周期检查点(23). Six1参与调节转移，增强转移不良的横纹肌肉瘤肿瘤的迁移(24). 本文描述的由DACH1控制的迁移和入侵途径通过包括Eya/Six在内的细胞命运决定途径的遗传靶点发挥作用的可能性尚待确定。
方法
详细材料和方法见SI方法简言之，DACH1、单独的DACH1DS结构域（DS）或缺失的DACH1DS结构域（ΔDS）的表达质粒（包括N-末端FLAG肽）、ponasterone调节的表达系统、白介素-8启动子荧光素酶报告子的构建，见参考文献。25——28.MCF10A-ΔRaf-ER电池(29)、MCF10A-Ras、Ras/ErbB2、ErbB2（NeuT）、c-Myc转化细胞(9)和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）第1天−/−老鼠(30)被培养(25,31). 使用细胞周期蛋白D1、ErbB2、磷酸化-ERK、磷酸化-AKT、Myc、FLAG抗体和负荷控制鸟嘌呤解离抑制剂（GDI）进行蛋白质印迹分析(27,32). 细胞的三维培养(33)，跨井迁移分析(34)和3D侵入活动(15)进行了评估。
迁移和在体内转移分析。
体内在国家癌症研究所（National Cancer Institute）的裸鼠尾静脉注射后，使用1×104单元格(9). 使用多西环素通过饮用水诱导DACH1转基因表达，最终浓度为1μg/ml。使用印度墨水对Met-1细胞的肺转移进行染色(35). 抗鼠CRCL1/KC抗体（研发系统）(36)通过静脉注射（100μg）获得IL-8抗体(8). 在伤口愈合试验中，细胞生长在12孔板上汇合(37). 使用Metamorph 3.5版软件收集时间间隔视频图像并将其存储为图像(34).
细胞因子阵列分析。
硝酸纤维素膜上发现的人类细胞因子阵列来自Raybiotech(33). 通过在无血清DMEM中培养细胞24–48 h，从表达磷甾酮调节的DACH1的MDA-MB-231细胞制备条件培养基。
实时PCR评估IL-8转录物的表达和ChIP分析。
使用缺血逆转录酶试剂盒（Bio-Rad）对等量的纯化RNA样本进行逆转录，形成cDNA，并采用SYBR Green实时PCR相对定量法扩增IL-8转录物(15). 内源性的白介素-8启动子ChIP分析使用直接针对DACH1或内源性DACH1的FLAG表位的抗体和人类引物白介素-8基因启动子。
致谢。
我们感谢Vassilis Altmazoglou和Trias Thiraiou将Affometric基因ID映射到Ensemble基因ID，并对六聚体分布进行了初步计算。这项工作得到了美国国立卫生研究院R01CA70896、R01CA75503、R01CA 86072、R01CAP107382（R.G.P.）和Margaret Q.Landenberger研究基金会（K.W.）的部分支持。Kimmel癌症中心得到了国立卫生研究院癌症中心核心拨款P30CA56036（发给R.G.P.）的支持。该项目的部分资金来自拉尔夫和玛丽安·C·福尔克医学研究信托基金，以及宾夕法尼亚州卫生部（R.G.P.）的拨款。
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