分子细胞生物学。2007年6月；27(11): 4018–4027.
Eos、MITF和PU.1招募骨髓祖细胞破骨细胞特异性基因的共同代表▿ †
，‡ ，‡ ， ， ，§和*
胡蓉（音）
俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学与综合癌症中心系，俄亥俄州哥伦布43210
Sudarshana M.Sharma女士
俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学与综合癌症中心系，俄亥俄州哥伦布43210
阿格涅斯卡·布罗尼兹
俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学与综合癌症中心系，俄亥俄州哥伦布43210
鲁奇卡·斯里尼瓦桑
俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学与综合癌症中心系，俄亥俄州哥伦布43210
乌玛·桑卡尔
俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学与综合癌症中心系，俄亥俄州哥伦布43210
迈克尔·奥斯特罗斯基
俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学与综合癌症中心系，俄亥俄州哥伦布43210
俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学与综合癌症中心系，俄亥俄州哥伦布43210
‡胡蓉（Rong Hu）和沙玛（Sudarshana M.Sharma）是这项工作的同等贡献者。
§现住址：北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心药理学和癌症生物学系，邮编27710。
2006年9月28日收到；2006年11月2日修订；2007年3月7日接受。
- 补充资料
[补充材料]
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摘要
转录因子MITF和PU.1协同增加靶基因的表达，如组织蛋白酶K(Ctsk公司)和酸性磷酸酶5(Acp5公司)在破骨细胞分化过程中。我们表明，这些因子还可以抑制能够形成巨噬细胞或破骨细胞的髓样前体中靶基因的转录。MITF和PU.1与锌指蛋白Eos（Ikaros家族成员）的直接相互作用对于抑制Ctsk公司和Acp5公司在靶基因启动子处，Eos与MITF和PU.1形成复合物，并通过共抑制因子CtBP（C末端结合蛋白）和Sin3A的募集抑制转录，但在破骨细胞分化过程中，Eos和Ctsk公司和Acp5公司启动子显著减少。随后，MITF和PU.1向这些靶基因招募辅激活子，从而使靶基因得到稳健表达。骨髓源性前体细胞中Eos的过度表达扰乱破骨细胞分化并选择性抑制MITF/PU.1靶点的转录，而Eos的小干扰RNA敲除导致破骨细胞的基础表达增加Ctsk公司和Acp5公司这项研究提供了一种机制，解释了在破骨细胞分化开始之前，对适当的细胞外信号作出反应，MITF和PU.1活性在定向髓系祖细胞中的调节。
破骨细胞来源于稳定的髓系祖细胞，这些祖细胞分化为高度专业化的多核细胞，能够在集落刺激因子1（CSF-1）和NF-κB配体受体激活剂（RANKL）的作用下进行骨吸收(36). 破骨细胞和成骨细胞在维持骨完整性和功能所必需的骨重塑过程中发挥相互作用。现在已经证实，许多人类骨骼疾病，包括骨质疏松症、佩吉特病和类风湿性关节炎，都是由这两种细胞类型的分化和功能失衡引起的(1).
MITF（小眼相关转录因子）是一种基本的螺旋环-亮氨酸拉链蛋白，与发育无关的细胞类型（包括破骨细胞、黑素细胞和色素性视网膜上皮细胞）的分化和存活有关(7，30，40). MITF和ETS家族转录因子PU.1之间的相互作用至少部分解释了MITF在破骨细胞分化过程中选择性调节靶基因的能力(22，27，39). 然而，MITF和PU.1在巨噬细胞和破骨细胞以及这两种细胞类型的共同单核前体中表达(13，38). 这就提出了一个普遍的问题，即基因调控模式是如何在密切相关的细胞谱系中维持的。在最近的研究中，我们证明，在缺乏CSF-1的原代细胞中，MITF通过与14-3-3蛋白的相互作用而被隔离在细胞质中，这为调节髓样前体细胞中MITF的活性提供了一种潜在机制(2).
Ikaros是五种相关的Kruppel锌指转录因子家族的创始成员，它们可以作为基因表达的阻遏物(6，9，14，29，31). 小鼠的敲除和显性阴性研究结果表明，Ikaros是淋巴细胞分化的中枢调节器之一(4，41). Ikaros和其他家族成员与两种共抑制剂Sin3和Mi-2复合物相关(15，17，18). Ikaros和Eos还可以与协同加压素CtBP（C末端结合蛋白）相互作用，后者可以以组蛋白去乙酰化酶（HDAC）非依赖性的方式抑制基因表达(16，33). 除了淋巴细胞外，Ikaros家族成员对其他造血细胞类型（包括髓系）的影响在很大程度上尚不清楚。以前有报道称Eos在大多数造血细胞类型中表达，但在单核细胞中表达水平最高(34).
在这里，我们证明Ikaros家族蛋白Eos的表达在破骨细胞分化过程中受到时间调节。骨髓源性前体细胞中Eos的过度表达扰乱破骨细胞的分化并抑制破骨细胞标志基因的转录，如组织蛋白酶K(Ctsk公司)和酸性磷酸酶5(Acp5公司). 我们提供了直接证据，证明Eos与MITF和PU.1相互作用，通过招募辅阻遏物Sin3A和CtBP来抑制特定启动子的转录。这项工作提供了一种机制，通过调节髓系前体和巨噬细胞中的MITF和PU.1活性来防止破骨细胞特异性基因的不当表达激活。
材料和方法
抗体。
使用肽SSGDSSLEKDSL（对应于小鼠Eos的氨基酸[aa]8至19）在兔子体内制备针对Eos的特异性抗体（QCB/Biosource，Hopkinton，MA）。先前描述了抗MITF和PU.1的抗体(24). 抗BRG1抗体在别处描述(42). 抗-CBP抗体是来自加利福尼亚州圣地亚哥Marc R Montmini的一份礼物。其他商用抗体包括：Flag M2和血凝素（HA）（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）、6，谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）、mSin3A、组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）、CtBP和Mi-2（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）以及组蛋白H3（弗吉尼亚州夏洛茨维尔上游细胞信号传导）。
细胞培养和转染。
使用磷酸钙程序转染NIH 3T3细胞。表达载体pCDNA3-Flag-Eos是澳大利亚悉尼Merlin Crossley赠送的礼物，如前所述(34). MITF和PU.1的荧光素酶报告子结构和表达载体已在前面描述过(22). 使用Lipofectamine试剂（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）转染COS-7细胞。最近描述了标记MITF和截断突变体的DNA构建(2). 在pCGN载体中构建了HA-标记的PU.1和缺失。为了产生pEBG-GST-Eos，从pCDNA3-Flag-Eos质粒中PCR扩增全长Eos cDNA或Eos cDNA的各种截短片段，并将其亚克隆到哺乳动物GST表达载体（pEBG）中。所有扩增序列均经DNA测序验证。
破骨细胞的培养和分析。
采用C57B/6J小鼠制备骨髓前体进行体外破骨细胞分化实验。这个Mitf-vga公司小鼠从Lynn Lamoreux（德克萨斯农工大学）获得。有条件的“floxed”钚.1等位基因和诱导条件Pu.1程序用聚（dI-C）诱导法删除Mx1-芯之前描述过(12). 含有钚.1“floxed”等位基因是Dan Tenen（哈佛医学院哈佛医学院）赠送的礼物。本研究中对小鼠的使用和护理得到了俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。先前已经描述了从小鼠制备的骨髓源巨噬细胞（BMM）中分化破骨细胞的详细程序(25，26). 简单地说，从股骨中冲洗骨髓，并在50 ng/ml CSF-1存在下在非问题培养皿中培养3天。在这一点上，在指定的时间段内，采集含有承诺破骨细胞祖细胞的非粘附细胞群（零时间点对照）或用50 ng/ml CSF-1（昆士兰大学David Hume的礼物）和100 ng/ml RANKL（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）培养。耐酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）/Acp5公司使用白细胞酸性磷酸酶试剂盒（Sigma）进行染色。
Co-IP、GST下拉分析和Western blotting。
最近描述了共免疫沉淀（Co-IP）、GST下拉分析和Western blotting的程序(2). 重组蛋白的生产大肠杆菌如前所述进行体外GST下拉分析(22).
EMSA。
如前所述进行电泳迁移率变化分析（EMSA）(21，22). 代表小鼠的感觉链寡核苷酸Acp5公司近端序列为5′-TTCTGGGGAAGTCACAGTGCCAGTCACACA-3′。共识Eos结合位点在M1（GGAA到TTTT）和M2（GTCC到CAAA）两个区域突变。
逆转录病毒的产生和转导。
MSCV-FlagEos-IRES-GFP（其中MSCV是小鼠干细胞病毒，IRES是内部核糖体进入位点，GFP是绿色荧光蛋白）是通过将标记的Eos cDNA插入XhoI消化的MSCV-IRES-GFP载体构建的。使用Phoenix细胞系进行逆转录病毒包装。用50 ng/ml CSF-1培养2天的骨髓源破骨细胞祖细胞被转移到12孔板中，并使用前面描述的逆转录病毒上清液进行转导(11). 在转导后的20小时内，用上述CSF-1和RANKL联合处理细胞。
Eos的siRNA敲除。
分别针对外显子6和外显子7的两个单独的小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸（Eos siRNA1[5′-CGGCCAACUUUCAUUGAUCt3-′]和Eos siRNA 2[5′-CGGCCAACUCUUCAUGt3′]；小写字母区分siRNA设计中与Eos序列没有同源性的悬垂部分），从Ambion（德克萨斯州奥斯汀）购买，以及一个控制siRNA，该siRNA编码一个与任何已知序列没有特定同源性的加扰序列。在溶液T（Amaxa Biosystems）中以500 nM的浓度将这两个siRNAs组合引入5×106在核感染器（Amaxa Biosystems）中使用T-020程序的髓系前体。
在转染后72小时收获细胞，并通过实时PCR和蛋白质印迹分析来分析Eos敲低。通过Eos靶点的相对表达分析来分析Eos击倒的效果，例如Ctsk公司和Acp5公司.
RNA表达分析。
使用TRIzol试剂盒（Invitrogen）提取RNA，并使用Superscript III逆转录酶（Invit罗gen）逆转录。进行实时PCR，并按照前面所述计算相对mRNA表达水平(43). 用于实时PCR的引物由Oligo v4.0软件挑选，所用序列可根据要求提供。
ChIP和ReChIP。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析采用Luo等人的方法进行(23). 简单地说，骨髓细胞的密度为3×106每个10厘米培养皿中的细胞数，并按照图中图例所示进行处理。细胞交联，通过超声处理制备平均大小为200至1000 bp的可溶性染色质。如图图例所示，将预先清除的可溶性染色质与5μg特异性抗体孵育。免疫沉淀的DNA-蛋白复合物被广泛洗涤、洗脱和去交联。根据制造商的说明书（QIAGEN），使用QIAGEN PCR纯化试剂盒进一步纯化沉淀的DNA样品。对于顺序ChIP（ReChIP）分析，在用Eos抗体进行第一次免疫沉淀后清洗小球，将免疫沉淀的染色质在37°C的10 mM二硫苏糖醇中洗脱30分钟，并在ChIP稀释缓冲液中稀释50倍。将洗脱的免疫复合物分离，并用图中所示的第二种特异性抗体进行免疫沉淀。样品通过实时PCR或SYBR绿色超级混合物（Bio-Rad）进行分析Ctsk公司启动子或罗氏通用探针库（Roche）探针使用Faststart TaqMan主试剂盒（罗氏）Acp5公司，Bcl-2型，或c-飞行管理系统发起人。被研究启动子的阈值由输入值的阈值调整，并表示为相对富集。通过熔融曲线分析和琼脂糖凝胶对所有定量PCR（qPCR）进行分析，以确认存在单一特异条带。
结果
Eos在破骨细胞分化过程中下调，可以抑制Ctsk公司和Acp5公司启动子活性。
使用DNA微阵列测定体外衍生破骨细胞样细胞（OCL）的基因表达谱（数据未显示）。Ikaros家族成员Eos公司是一个在CSF-1和RANKL启动的破骨细胞分化过程中下调的基因，选择该基因进行进一步分析。动力学Eos公司使用定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证OCL分化不同阶段的mRNA表达。来自野生型小鼠的骨髓源性前体细胞仅与CSF-1（BMM）培养3天，然后用重组CSF-1和RANKL刺激以诱导体外破骨细胞分化（图。). 与微阵列数据一致，Eos公司仅用CSF-1处理的OCL前体细胞（第0天）或细胞分化早期阶段（第0.5天）的mRNA表达最高。Eos公司在破骨细胞分化和MITF/PU.1靶基因表达的同时，在细胞因子刺激3或5天后，mRNA表达减少了5倍以上，如组织蛋白酶K(Ctsk公司)和酸性磷酸酶5(Acp5公司)/抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是强健的（图。). Eos蛋白的表达是使用我们实验室中产生并表征的抗体进行评估的（参见材料和方法），分析表明，在CSF-1/RANKL诱导破骨细胞分化过程中，Eos蛋白表达也显著降低（图。).
破骨细胞分化过程中Eos表达下调。（A） 相对（rel）表达式Eos公司，Acp5公司、和Ctsk公司在指定时间（天[d]）和细胞因子治疗时，通过qRT-PCR测量mRNA。三个独立实验的结果显示为平均值加上平均值的标准误差（误差条）。（B） 使用抗Eos抗体通过Western blotting分析在指定时间（天[d]）从破骨细胞中提取的核提取物。组蛋白H3用作负荷对照。
据报道，Eos之前识别了一致的Ikaros结合位点GGGAATRCC和相关序列(29，34). 潜在的共识Eos识别位点与功能性PU.1位点重叠Acp5公司和Ctsk公司启动子序列（图。) (22，27). 检查Eos是否可以监管Acp5公司和Ctsk公司通过这些识别基序的基因，用荧光素酶报告子进行瞬时转染分析（图。). 这些分析表明Eos表达抑制了Acp5公司和Ctsk公司由MITF和PU.1单独或组合激活报告器。c-飞行管理系统启动子由PU.1而非MITF调节，不受Eos过度表达的抑制（数据未显示）。
Eos抑制两者Acp5公司和Ctsk公司启动子活性。（A）Acp5公司和Ctsk公司小鼠和人类细胞的启动子序列，具有保守的MITF和PU.1结合位点（用括号表示）和假定的Eos结合位点（下划线）。如图所示，M1和M2显示Eos DNA共识中的序列替换。（B） NIH 3T3细胞的瞬时转染分析。要么Acp5公司荧光素酶报告子(Acp5公司-luc）或Ctsk公司荧光素酶报告子(Ctsk公司-luc）单独或与编码MITF、PU.1和Eos的表达载体的指定组合一起转染。通过添加空表达载体，每次转染的总DNA保持不变。相对（Rel）荧光素酶活性表示为与基础启动子活性的差异(n个-折叠）（设置为1）。三个独立实验的结果显示为平均值加上平均值的标准误差（误差条）。（C） 使用γ的EMSA-32P端部标记Acp5公司寡核苷酸和重组GST或GST-Eos（101-230）蛋白。DNA-Eos复合物（箭头）的形成与不断增加的冷量竞争Acp5公司探查。（D） 使用γ的EMSA-32P末端标记野生型或突变型Acp5公司重组His存在下的寡核苷酸6-PU.1和GST-Eos（101-230）蛋白质。显示了Eos-DNA复合体（粗箭头）、PU.1-DNA复合物（细箭头）和包含Eos和PU.1的超移带（折断箭头）。
EMSA使用代表Acp5公司含N末端DNA结合域的启动子区和重组Eos蛋白(34). 实验表明，Eos可以直接与Acp5公司靶序列，通过向EMSA反应混合物中添加未标记探针来完成结合（图。). Eos与Acp5公司将探针与重组PU.1进行比较（图。，车道3与车道2）。出乎意料的是，PU.1和Eos的孵化导致了包含这两个因子的更大复合物的形成（图。，泳道4）。Eos一致序列任意一半的突变（M1【GGAA突变为TTTT】和M2【GTCC突变为CAAA】；图。)导致Eos结合丧失（图。，第6和第9车道）。PU.1与Acp5公司突变M1也显著减少（图。，车道5）。然而，较大的PU.1/Eos复合物形成于Acp5公司突变M1或M2（图。，第7和第10车道）。这一结果表明，形成更大的复合物可能不需要Eos直接与DNA结合。
Eos通过两个不同的域直接与PU.1和MITF相互作用。
EMSA结果表明Eos和PU.1可能直接相互作用，GST下拉和Co-IP分析测试了这种可能性（图。). 用于这些实验的各种PU.1和Eos结构如图所示。Eos与其他Ikaros家族成员共有两个结构域：一个N端结构域包含四个锌指，对序列特异性DNA结合至关重要，另一个C端结构域具有两个锌指参与同源或异源二聚体(29，34). GST-Eos（101-230）（含有aa 101至230的GST-Eo）蛋白质，含有锌指1至4，用于下拉各种PU.1肽（图。). 这些实验将Eos相互作用区域映射到PU.1的C末端DNA结合域（DBD）/ETS域（图。). 在一项平行分析中，融合到GST的Eos的C末端结构域（aa 231至532）无法拉下全长HA-PU.1或HA-DBD-PU.1（参见补充材料中的图S1A）。体外结果通过使用标记Eos（50-230）（带有aa 50-230的Eos）和在COS-7细胞中表达的HA-标记PU.1表达结构的Co-IP分析得到证实（图。). 在Co-IP分析中使用标记的全长Eos蛋白时获得了相同的结果（数据未显示）。
环氧乙烷与聚氨酯的物理相互作用。（A） 本研究中使用的Eos和PU.1结构域以及各自缺失突变的示意图。Eos中的锌指表示为黑色垂直日食。AD，激活域；DBD，DNA结合域。（B） 重组GST-Eos（101-230）和His-tagged全长（f.l）PU.1，以及PU.1的不同缺失，用于体外GST下拉分析，并用抗-His抗体进行Western blotting分析。（C） 如图所示，使用用编码Flag-Eos（50-230）和HA-PU.1的表达载体转染的COS-7细胞的提取物进行Co-IP测定。箭头表示重链（H.C）和轻链（L.C）。在B组和C组中，使用所示的适当抗体，通过Western blotting或免疫印迹（IB）分析输入对照。
使用图中所示的MITF结构研究了Eos是否也与MITF直接交互。使用与GST-Eos和Flag-MITF表达结构共转染的COS-7细胞提取物进行的GST下拉分析表明，MITF与全长GST-Eo一起下拉（图。，车道3）。此外，MITF（1-218）的N末端区域（MITF带有aa 1到218），而不是C末端的基本螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链区域（aa 219到419），与GST-Eos形成复合物（图。（分别为第4和第5车道）。互惠分析表明，Flag-MITF（1-218）与C端Eos（aa 231至532，包含锌指5和6）形成复合物，但与N端Eos片段无关（图。). 使用重组GST标记的全长MITF和His标记的C末端Eos（aa 231至532）进行的体外GST下拉分析表明，这两种蛋白质之间的相互作用是直接的（参见补充材料中的图S1B）。GST-MITF和His-Eos（231-532）也可以在Acp5公司靶DNA序列由EMSA测定（参见补充材料中第3栏图S1C），而His-Eos（231-532）没有与Acp5公司顺序（参见补充材料中的图S1C，车道1）。
Eos和MITF之间的物理相互作用。（A） 本研究中使用的MITF结构的示意图。B、 基础；HLH，螺旋-环-螺旋；LZ，亮氨酸拉链。（B） 使用表达全长（f.l）GST-Eos的COS-7细胞和MITF的标记全长、N末端（aa 1至218）和C末端（aa219至419）片段的GST下拉分析。（C） 使用与标记的N末端MITF（1-218）和全长（f.l）GST-Eos或Eos缺失突变共同转染的COS-7细胞进行GST下拉分析。根据指示，使用适当的抗体，通过Western blotting或免疫印迹（IB）分析输入对照。（D） 如图所示，内源性Eos、MITF和PU.1蛋白与来自单用CSF-1生长的骨髓祖细胞核提取物的特异性抗体共免疫沉淀。最右边的通道（仅珠子）是非特异性兔免疫球蛋白G对照物。
通过共免疫沉淀分析（图。). 分析表明，Eos、MITF和PU.1可以在原代细胞的复合体中发现（图。). 综上所述，结果表明Eos可以分别通过不同的N端（aa 101到230）和C端（aa231到532）结构域与PU.1和MITF结合。
Eos/MITF/PU.1复合物在定向破骨细胞祖细胞中选择性富集靶基因。
ChIP用于确定破骨细胞靶启动子处与MITF和PU.1的复合物中是否存在内源性Eos。以下地区Ctsk公司和Acp5基因图中描述了按照ChIP程序通过qPCR分析的基因。.设计PCR引物扩增Ctsk公司（−1548至−1396）和Acp5公司（−210到−1）启动子区域，之前已经证明包含功能性MITF和PU.1结合位点(21，32). 除了Ctsk公司和Acp5公司基因，一个对应于内部外显子/内含子区域的3′区被用作阴性对照（图。，左侧面板）。另一个阴性对照是未向ChIP反应混合物中添加初级抗体的反应。显示了一个代表性的控制实验Ctsk公司随着研究时间的推移，带有Eos抗体的基因（图。，右侧面板）。在40个PCR周期后，阴性对照中未检测到任何产物。组蛋白H3常规用作阳性对照。随后针对这两种药物进行的所有ChIP实验均使用了相同的对照组Ctsk公司和Acp5公司基因（数据未显示）。
招聘Eos、MITF和PU.1到Acp5公司和Ctsk公司破骨细胞分化过程中的启动子。（A） （左）分析区域的图形表示Ctsk公司和Acp5公司ChIP分析中的基因。（右）Eos ChIP的代表性凝胶图片Ctsk公司基因，经过40个PCR周期。输入表示添加抗体前每个分析中的总DNA。阴性对照包括无抗体（no Ab）和3′外显子/内含子区（exon）。使用抗组蛋白H3作为阳性对照。d、 天。（B） ChIP分析以研究Eos、MITF和PU.1与Ctsk公司和Acp5公司单用CSF-1处理细胞中的启动子（第0天）或随后使用CSF-1和RANKL处理0.5、3和5天。相对富集，相对富集。（C） MITF、PU.1和Eos在Bcl2公司和c-飞行管理系统促破骨细胞前体中的启动子。（D） MITF、PU.1和Eos在Acp5公司CSF-1单独作用于细胞的启动子MITF公司vga/vga小鼠（左）或Pu.1条件敲除细胞（右）。三个独立实验的结果表示为面板B至D中每个实验的平均值±平均值标准误差（误差条）。
ChIP实验表明Eos在Ctsk公司和Acp5公司破骨细胞祖细胞中的靶基因启动子仅在CSF-1存在下生长3天（图。). 相反，在同一人群同时使用CSF-1和RANKL治疗3至5天后，Eos水平迅速下降了7至10倍（图。). MITF和PU.1的含量Ctsk公司和Acp5公司在添加CSF-1/RANKL后，启动子基本保持不变，在使用这两种细胞因子治疗3-5天后增加了不到两倍。
接下来将讨论Eos是否与仅包含PU.1或MITF结合位点但不包含这两个因素的启动子结合。近端c-飞行管理系统启动子含有PU.1结合位点，但没有MITF结合位点(10)而Bcl2是一个既定的MITF目标，缺乏PU.1站点(28). 正如预测的那样，ChIP表明，在用CSF-1处理的细胞中，只有PU.1在近端细胞中富集-飞行管理系统启动子，但MITF或Eos均未检测到（图。). 同样，MITF在Bcl2启动子处富集，但未检测到PU.1或Eos（图。).
为了更直接地解决是否需要同时存在MITF和PU.1才能在目标启动子处富集Eos，用ChIP检测来自MITF蛋白和PU.1蛋白水平降低的遗传模型的原代细胞。纯合小鼠骨髓细胞衍生的低形态米特夫-vga9型产生10-20%的野生型MITF蛋白（参见补充材料中的图S2A）。对在CSF-1存在下培养3天的祖细胞进行的ChIP分析表明，在CSF-2存在的情况下，MITF、PU.1和Eos水平仅降低了3到5倍Acp5基因这些细胞中的启动子与对照细胞中的相比（图。). 小鼠的骨髓前体也获得了纯合子的PU.1条件等位基因，该等位基因也包含干扰素诱导的Mx1-cre公司转基因(12)（见材料和方法）。在含有PU中的CSF-1的情况下培养3天的骨髓祖细胞中，PU.1蛋白水平降低至对照组的10-20%飞行/飞行;Mx1型-cre公司+老鼠(（f）（对于floxed）用聚（dI-dC）处理（参见补充材料中的图S2B）。在这个遗传模型中，Eos水平在Acp5公司启动子减少了7倍（图。). 当Ctsk公司对启动子进行了研究（数据未显示）。这些结果与Eos需要MITF/PU.1复合物与靶基因选择性关联的假设一致。
在缺乏RANKL信号的情况下，Eos/MITF/PU.1复合物招募共抑制因子以靶向启动子。
据报道，Eos和其他Ikaros家族成员与多种共抑制剂相互作用，包括Sin3、Mi-2和CtBP(15-18，33). ChIP分析用于确定这些共抑制剂是否在Ctsk公司和Acp5基因骨髓祖细胞中的启动子（图。，顶部面板）。在这项分析中，将单独在CSF-1中生长3天的细胞与用CSF-1和RANKL额外生长3天的细胞进行比较，在这段时间内，OCL的可见分化首次显现，靶基因的强烈表达发生(25，26). 这些实验表明，共抑制剂CtBP、HDAC1和Sin3A均在Ctsk公司和Acp5公司仅用CSF-1生长的细胞中的启动子，但在CSF-1/RANKL治疗3天后，它们与这些靶启动子的关联水平显著降低。Mi-2蛋白也在Ctsk公司和Acp5公司启动子，但在CSF-1/RANKL刺激下与这些启动子的关联没有显著差异。
Eos、MITF和PU.1与共加压剂的关联Ctsk公司和Acp5公司破骨细胞前体中的启动子。（A） 辅抑制因子和辅活化因子与Ctsk公司和Acp5基因通过ChIP分析，在CSF-1和RANKL治疗3天后（第3天），破骨细胞前体中的启动子仅生长于CSF-1（第0天）和破骨细胞样细胞中。rel富集；相对富集。（B） ReChIP分析破骨细胞前体中同时存在Eos、MITF、PU.1和共抑制剂。三个独立实验的结果表示为平均值加上平均值的标准误差（误差条）。
此外，还研究了辅活化因子CBP/p300和BRG1的招募，因为这些辅活化因子以前曾被报道与MITF和PU相互作用。1(三，35，37，45). 该分析表明，在Ctsk公司和Acp5公司单用CSF-1生长的细胞中的启动子。然而，在用CSF-1和RANKL额外培养3天的细胞中，这两种辅因子在这些靶启动子处富集（图。，底部面板），同时在第3天这些靶基因的稳健表达（图。).
ReChIP分析用于确定MITF、PU.1、Eos和共抑制剂Sin3A、CtBP、HDAC1和Mi-2是否存在于同一细胞内的靶启动子。用Eos抗体进行第一轮免疫沉淀，然后分离免疫沉淀交联DNA蛋白复合物并将其与珠分离。使用针对Eos、MITF、PU.1、CtBP、HDAC1、Sin3A和Mi-2的抗体对该样品的等分样品进行再沉淀。使用这些抗体的ReChIP样品中存在的DNA量通过实时qPCR确定，并与Eos ReChIP样品中存在的DNA量进行比较（图。). 该分析表明，80%以上回收的Eos复合体在这两种情况下也含有MITF和PU.1Ctsk公司和Acp5基因发起人。此外，超过60%的Eos复合物在Ctsk公司发起人。在Acp5公司启动子，但HDAC1和Sin3A的水平在Acp5公司启动子略低，约40%的复合物（图。). Mi-2复合物的水平远低于其他共升压复合物，表明Mi-2可能与Eos/MITF/PU.1复合物没有强相关性。
Eos过表达或siRNA敲低破坏了MITF/PU.1靶基因调控。
为了进一步研究Eos作为MITF/PU.1靶基因负调控因子的作用，Eos通过逆转录病毒转导在破骨细胞祖细胞中过度表达。用于表达标记Eos的双顺反子逆转录病毒构建物（MSCV-FlagEos-IRES-GFP）也在IRES的控制下表达GFP，从而可以识别单个感染细胞。使用模拟转染、仅转染MSCV-GFP（载体控制）或转染标记Eos/GFP载体的包装细胞产生的病毒载体，在CSF-1生长2天后转染来自野生型小鼠的前体。感染后24小时转导GFP的效率在载体控制和MSCV-Flag-Eos中均为70-80%（数据未显示）。进行Western blotting以验证外源性Flag-Eos的表达（图。). 根据Western blotting和密度测定法，逆转录病毒转导导致Eos蛋白总产量适度增加两倍（图。).
BMM中Eos的过度表达破坏破骨细胞的分化。原代破骨细胞前体细胞要么是模拟感染的，要么是用空的MSCV-IRES-GFP（MSCV）和MSCV-Flag-Eos-IRES-GFP进行逆转录的。（A） 感染后1天用核提取物通过Western blotting分析外源性Eos的表达。（B） 代表Acp5公司CSF-1和RANKL治疗3天后感染BMM的（TRAP）染色（顶部面板）。Acp5公司-对每个孔（左条形图）和GFP阳性细胞（右条形图）中的阳性多核细胞（MNC，三个或更多核）进行计数。（C） 相对（rel）mRNA表达Acp5公司和Ctsk公司在指定的时间点（天[d]）通过qRT-PCR测量基因。面板B和面板C中的结果均来自三个独立的实验，并以平均值加标准平均值误差（误差条）的形式表示。使用两个样本进行统计分析吨测试（*，P（P）< 0.01). （D） 通过siRNA击倒Eos。（左）干扰siRNA-转染（对照[Con]）或Eos特异性siRNA转染（Eos）细胞中Eos蛋白水平的Western blot分析。MITF水平作为负荷控制进行测量。（右）水平Ctsk公司和Acp5公司通过qPCR测定Eos敲除细胞与对照细胞的mRNA。
病毒转导后24小时，用CSF-1和RANKL对细胞进行额外3天的处理。对照病毒感染的骨髓前体能够分化为多核（包含三个或更多核）、TRAP/Acp5公司-破骨细胞阳性。相反，多核TRAP/Acp5公司-在感染编码Eos的逆转录病毒的细胞中很少检测到阳性细胞（图。). 感染对照逆转录病毒的破骨细胞前体形成的OCL数量与模拟感染的细胞大致相同，而感染Eos病毒的细胞产生的OCL数量减少了约三倍，这一减少具有统计学意义（图。，左条形图，P（P）< 0.01). 当仅考虑GFP阳性OCL时，对照组细胞与Eos感染细胞相比减少了六倍（图。，右条形图，P（P）< 0.01).
支持这些结果，qRT-PCR表明Ctsk公司和Acp5公司与对照细胞相比，表达Flag-Eos的细胞的mRNA减少了六到八倍（图。). 相反，Eos过表达并不影响两个已知PU.1靶点的表达，即c-飞行管理系统和等级（参见补充材料中的图S3A顶面板），分别为CSF-1和RANKL受体(10，19). 此外，作为MITF靶点的Bcl2表达不受Eos过度表达细胞的影响（参见补充材料中的图S3A，右下面板）。的表达式降钙素受体(CTR公司)与对照组相比，另一个破骨细胞分化的标记基因Eos在过度表达的细胞中没有受到影响（参见补充材料中的图S3A，左下面板）。
在一种补充方法中，siRNA被用于敲低初级破骨细胞祖细胞中Eos的表达。当用两种Eos siRNAs的组合转染仅在CSF-1存在下生长的野生型、骨髓源性前体细胞时（参见材料和方法），转染72小时后Eos mRNA水平（参见补充材料中的图S3B）和蛋白质水平均显著降低（图S3B。). 这导致Acp5公司和Ctsk公司两者的mRNA表达Acp5公司和Ctsk公司基因与干扰siRNA-转染细胞的比较（图。). Eos siRNA处理不会影响Bcl2的表达（参见补充材料中的图S3B）。在RAW264.7细胞培养模型中，单个Eos siRNAs与MITF表达载体的共转染导致靶基因基础水平的表达增加了四倍，尽管单个siRNAs的Eos蛋白水平仅降低了约50%（参见补充材料中的图S3C）。
讨论
MITF和PU.1都是破骨细胞中已知的转录激活剂，但本文的结果表明，它们也可以作为阻遏物复合物的成分，在缺乏破骨细胞分化所需的适当细胞外信号的情况下抑制靶基因表达。这些因子与锌指蛋白Eos的相互作用似乎对靶基因招募辅抑制因子至关重要，因为Eos直接与这些辅抑制因子相互作用的能力已被充分记录(17，33). Eos本身与Acp5公司体外靶序列以及通过不同锌指结构域与MITF和PU.1的相互作用可能为靶基因阻遏提供额外的特异性。这些结果提供了一种机制，用于抑制具有分化为单核细胞/巨噬细胞、抗原呈递树突状细胞或破骨细胞潜能的髓样前体中破骨细胞靶基因（图。).
的示意模型Acp5公司和Ctsk公司破骨细胞分化过程中转录因子及其辅助因子的基因调控。（A） 在仅存在CSF-1的情况下，MITF、PU.1和Eos复合物与共抑制剂结合，从而抑制Acp5公司或Ctsk公司表达式。（B） CSF-1和RANKL的联合刺激触发Eos和辅升压复合物的分离以及辅活化剂的招募。（C） 持续的CSF-1和RANKL治疗随后导致了Acp5公司和Ctsk公司表达式。
我们的结果表明，CSF-1/RANKL信号通过两种机制激活破骨细胞靶基因的表达。第一种机制是在mRNA和蛋白质水平下调Eos表达，导致辅抑制因子与靶基因分离（图。). 第二种机制是通过Erk和p38有丝分裂原激活的蛋白激酶途径直接磷酸化和激活MITF，导致辅活化因子的补充，如CBP/p300和BRG1(8，25，44). Eos过度表达和敲除研究表明，在靶基因被完全激活之前，负调控的释放必须伴随辅激活物的招募。我们的结果并不排除MITF和PU.1以及辅加压素CtBP或Sin3之间的直接信号依赖性相互作用可能参与这一调控的可能性，但Eos与这些辅加压素的良好相互作用提供了一个与本文结果一致的简单解释。CSF-1/RANKL信号是否直接针对Eos的翻译后修饰，影响其稳定性或活性，尚待确定。例如，据报道，Ikaros的SUMO修饰会影响淋巴发育过程中与辅升压因子的相互作用(5)，Eos也可以由SUMO修改（R.Hu和M.C.Ostrowski，未发表的观察结果）。
对于血统决定因素，如PU.1，抑制祖细胞中潜在靶基因的机制对于维持基因表达模式的适当控制至关重要。在髓细胞承诺的早期阶段，PU.1实现这一功能的一个机制是直接调节转录因子的表达，如Erg1和Erg2，这些转录因子反过来可以抑制中性粒细胞特异性基因，同时激活巨噬细胞特异性基因(20). 同时，锌指因子Gfi-1通过抑制这些PU.1靶基因的表达来对抗巨噬细胞分化(20). 我们的工作提供了一种额外的机制，通过这种机制，PU.1活性在更稳定的髓系前体中受到调节。在这种情况下，锌指因子Eos直接调节目标启动子的PU.1活性。一个重要的区别是，Eos的作用对MITF/PU.1复合物是特异性的，因为巨噬细胞和破骨细胞中的其他PU.1靶基因，例如-飞行管理系统和等级Eos过度表达时未受影响。
根据目前的证据，Eos在髓系细胞中是否以类似于Gfi-1的方式发挥血统决定因子的作用，或在淋巴细胞中是否起Ikaros的作用，似乎不太可能。例如CTR公司该基因是破骨细胞分化的另一个决定性标志物，在过表达Eos的细胞中仍然上调。因此，Eos并不调节整个破骨细胞基因表达程序，而是选择性地调节MITF/PU.1复合物和分化破骨细胞充分活性所需的基因子集的活性。同时，靶基因启动子中MITF和PU.1的存在使靶前体能够灵活地对骨微环境作出快速反应，从而对CSF-1/RANKL信号转导的基因表达进行重新编程。这一模型解释了破骨细胞祖细胞中MITF/PU.1活性是如何调节的，可能普遍适用于其他类型的细胞，其中承诺的祖细胞可以产生密切相关的细胞类型。
致谢
这项工作得到了NIH/NIAMS拨款R01-AR-0447129（M.C.O.）的支持。
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