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神经科学杂志。2006年8月2日；26(31): 8057–8068.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.2261-06.2006
PMCID公司：项目经理C6673783
PMID：16885219

轴索营养不良和退行性变中自噬的诱导

王庆军,1,4 丁耀美,4 斯塔夫·科茨,5 Noboru水岛,6 伊莱娜·克里斯蒂,1 迈克尔·劳特,2 布莱恩·查特,1 云忠,三 纳撒尼尔·海因茨,三和岳振宇4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

自噬是细胞质内容物大量降解的一种高度调节的细胞机制。它与神经疾病相关的各种生理和病理条件有关。然而，神经元自噬的调节及其在神经元和轴突病理学中的作用尚不清楚。利用产生绿色荧光蛋白标记的自噬标记物微管相关蛋白轻链3（GFP–LC3）的转基因小鼠，我们为诱导轴突营养不良和Purkinje细胞变性自噬提供了分子证据卢彻小鼠，兴奋毒性神经退行性变模型。我们证明了卢彻突变触发Purkinje细胞的早期反应，涉及GFP–LC3标记的自噬体在轴突营养不良性肿胀中的积聚（CNS轴突病的标志）。在大脑中，LC3与微管相关蛋白1B（MAP1B）具有高亲和力。我们发现MAP1B与细胞溶质形式（LC3I）和脂质形式（LC32I）的LC3结合。此外，在细胞培养中，MAP1B的过度表达导致LC3II水平降低，GFP–LC3标记的自噬体数量减少；磷酸化MAP1B与GFP–LC3标记的自噬体相关。此外，在大脑中，磷酸化MAP1B在退化Purkinje细胞的轴索营养不良肿胀中积聚，并以增加的水平与LC3结合。因此，在正常和致病条件下，MAP1B–LC3相互作用可能参与神经元尤其是轴突中LC3相关自噬体的调节。我们认为自噬的诱导是轴突营养不良的早期应激反应，可能参与轴突结构的重塑。

关键词：自噬、神经变性、MAP1B、LC3、轴突营养不良性肿胀、，卢彻

介绍

中枢神经系统轴突病的一个特征是轴突营养不良，其特征是局部扩张（肿胀、静脉曲张）中断轴突的连续性，或功能失调或退化神经元中的终末球（收缩或变性球）。Ramon y Cajal（1928年）记录了一个早期观察到的轴索切除Purkinje细胞轴突的轴索营养不良。近一个世纪以来，在各种中枢神经系统疾病中都发现了这些异常的轴突形态，包括主要的人类神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症(Tu等人，1996年;Trapp等人，1998年;Galvin等人，2001年;Brendza等人，2003年). 这些轴突营养不良性肿胀是轴突的分区段，通常充满紊乱的神经丝、微管、细胞器和多片泡，其中一些被描述为自噬体(Lin等人，2003年;Ohara等人，2004年). 尽管对这些异常轴突结构进行了广泛的形态学观察，但轴突营养不良的分子机制仍不清楚。

自噬是一种由细胞外营养物质或营养因子调节的溶酶体依赖性降解途径。在哺乳动物中，自噬在营养缺乏、生长因子缺乏和微生物入侵期间的生存中起着关键作用(莱文和克林斯基，2004年). 最显著的自噬类型是大自噬（以下简称自噬），通过这种自噬，长寿命蛋白质和细胞器被隔离到自噬体中，随后被输送到溶酶体进行降解。最具特征的自噬标记LC3是酵母Atg8的哺乳动物同源物，最初被鉴定为微管相关蛋白（MAP）的轻链3。通过检测囊泡上是否存在LC3，可以将真正的自噬体与其他类型的囊泡区分开来(Kabeya等人，2000年). 先前使用产生绿色荧光蛋白标记LC3（GFP–LC3）的转基因小鼠分析自噬体内(水岛等人，2004年). 自噬活性增加反映在LC3I（胞质）向LC3II（脂溶性）的转化增强，同时GFP–LC3向自噬体募集，GFP–LD3点状物数量增加。尽管在营养饥饿期间，在许多小鼠组织中观察到这种反应，但中枢神经系统是一个例外：GFP–LC3标记的自噬体在没有营养饥饿或营养饥饿的情况下很少被检测到。这一观察结果表明中枢神经系统中存在不同类型的自噬调节(水岛等人，2004年).

我们已经在超微结构上显示了自噬体样空泡在退化的Purkinje细胞体和树突中的积聚卢彻小鼠，其中突变的谷氨酸受体δ2（GluRδ2Lc公司)被组成性激活并导致浦肯野细胞变性(Yue等人，2002年). 在这里，使用GFP–LC3转基因小鼠，我们表明卢彻诱导Purkinje细胞的自噬反应，包括神经变性前营养不良轴突中自噬体的积聚。我们还提供证据表明，MAP1B调节LC3相关自噬体，磷酸化MAP1B（MAP1B-P）与LC3标记的自噬小体相关，并且似乎在增强水平上与LC3相互作用卢彻浦肯野细胞。这些结果表明，在生理和病理条件下，轴突末端的自噬具有独特的调节作用。他们进一步暗示自噬在轴突变性中的特殊作用，可能是通过轴突末端的动态重组。

材料和方法

化学品和抗体。

M-270环氧染料、DMEM、胎牛血清、PBS、HBSS、胰蛋白酶-EDTA溶液、青霉素-链霉素溶液，200 M米 我-谷氨酰胺溶液、碳酸氢钠溶液、Leibovitz的L-15培养基、NuPAGE Bis-Tris凝胶、Western blot转移缓冲液、MES SDS运行缓冲液和抗氧化剂购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。改良胰蛋白酶、无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片、碱性磷酸酶和Fugene 6转染试剂购自罗氏诊断公司（印第安纳波利斯）。Immobilion-P聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自Millipore（Billerica，MA）。GelCode蓝色染色试剂、三氟乙酸（TFA）、三（2-羧乙基）膦盐酸盐和Micro-BCA蛋白质检测试剂盒购自皮尔斯（伊利诺伊州罗克福德）。LysoTracker Red DND-99和ProLong Gold防褪色试剂购自Invitrogen。Nembutal从雅培实验室（伊利诺伊州雅培公园）购买。雷帕霉素购自Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥）。其他化学品从西格玛（密苏里州圣路易斯）或菲舍尔（新罕布什尔州汉普顿）购买。

本研究中使用的抗体包括小鼠单克隆钙结合蛋白D-28K抗体（1:1000；Swant，Bellinzona，Swand）、小鼠单克隆神经特异性核蛋白（NeuN）抗体（1:200；Chemicon，Temecula，CA）、小鼠单克隆磷酸化-Tau抗体AT-8（1:250；Innogenetics，Gent，Belgium）、，小鼠单克隆磷酸化MAP1B抗体SMI-31（1:5000；Sternberger Monoclonals，Lutherville，MD），兔多克隆磷酸化MAP1B抗体PP172(Good等人，2004年)、豚鼠多克隆p62/SQSTM1抗体（1:1000；美国研究产品公司，马萨诸塞州贝尔蒙特）、小鼠单克隆c-myc抗体（1:100；圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁斯）、花青素3（Cy3）偶联抗鼠/兔IgG（1:500；弗吉尼亚州夏洛茨维尔Upstate）、兔IgC（1:6000；阿默沙姆生物科学公司，宾夕法尼亚州匹兹堡）、小鼠IgG；皮尔斯）。兔单克隆磷酸化-S6核糖体蛋白（Ser235/236）抗体（克隆91B2）和小鼠单克隆S6核糖体蛋白质抗体购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA）（1:200）。兔多克隆LC3抗体（1:4000）是吉森博士（日本冈崎国立基础生物学研究所）赠送的礼物(Kabeya等人，2000年). 兔多克隆抗beclin 1抗体购自Santa Cruz Biotechnology（1:600）。抗谷胱甘肽的多克隆GFP抗体S公司-转移酶标记GFP和亲和力纯化(Cristea等人，2005年). 兔多克隆MAP1B抗体NR（1:1000）是菲舍尔博士（宾夕法尼亚州费城哈内曼大学医学院）赠送的礼物(费舍尔和罗曼诺·克拉克，1990年;Ma等人，1999年). 抗-c-myc琼脂糖亲和凝胶购自Sigma。

小鼠菌株、细胞培养和转染。

如前所述生成GFP–LC3转基因小鼠（C57BL/6J）(水岛等人，2004年).鲁彻小鼠（B6CBA/A-Grid2Lc公司)购自The Jackson Laboratory（ME巴尔港）。鲁彻产生GFP–LC3（GFP–LC 3）的小鼠/卢彻)是通过基因杂交获得的卢彻和GFP–LC3转基因小鼠。这个卢彻根据出生后第10天（P10）及以上的小鼠共济失调的表型确定基因型。GFP–LC3/卢彻荧光显微镜下小脑深核区（DCN）出现GFP–LC3标记的轴突营养不良性肿胀，从而确定P10以下（P6以上）的小鼠。GFP–LC3转基因小鼠通过检测新鲜切割的尾巴的绿色荧光进行鉴定（Olympus CK40；Olympus Optical，Tokyo，Japan），并通过PCR进行确认，如前所述(水岛等人，2004年).

人类胚胎肾293T（HEK 293T），野生型，附件5−/−、和附件7−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）保存在含有10%胎牛血清的DMEM中。通过标准磷酸钙沉淀程序转染HEK 293T细胞。用于表达MAP1B的质粒，包括PUHD15和MAP1B–myc（用于转染的比例为1:6），由Propst博士（奥地利维也纳大学）提供(Togel等人，1998年). 对照质粒为PUHD15和FLAG–GluRδ2（以1:6的比例用于转染）。按照制造商的协议，使用Fugene 6试剂将GFP–LC3质粒或表达质粒GFP–LC 3和LacZ–myc（1:6）或GFP–LCD 3、PUHD15和MAP1B–myc的组合转染MEF细胞。在200–300 n的条件下添加使用时的巴菲尔霉素A1和雷帕霉素米最终浓度为18–24小时。

荧光显微镜用组织和细胞制剂。

小鼠被安置在两个研究所（洛克菲勒大学和西奈山医学院）的特定无病设施中，并按照国家卫生研究院的指南进行护理。所有实验方案均由内部机构动物护理和使用委员会批准。分别用50 mg/ml的戊巴比妥、0.05和0.1 cc的P7和成人麻醉动物。使用蠕动泵（马萨诸塞州沃本Rainin Instruments），在PBS中使用4%多聚甲醛进行灌注，pH值为7.4。将灌流的脑组织在4°C的4%多聚甲醛中再次固定24小时，并嵌入5%低熔点琼脂糖凝胶中。使用组织切片和浴制冷系统（Vibratome，St.Louis，MO）制备60μm的矢状脑片，并将其保存在4°C的PBS中。用含有0.05%Triton X-100和10%山羊血清的PBS封闭脑片，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。将切片清洗并在室温下用Cy3-共轭抗兔或抗鼠IgG孵育45分钟，广泛清洗，用ProLong Gold防褪色试剂固定，并使用蔡司（德国哥廷根）共焦显微镜进行检查。

对于GFP–LC3和LysoTracker的实时成像，P12–P14 GFP–LC的小脑矢状切片（250μm）/卢彻使用组织切碎器（Mickle Laboratory Engineering，Gomhall，UK）制备小鼠，并在Leibovitz的L-15培养基中培养50 n米培养箱中的LysoTracker（37°C和5%CO2)在收集图像之前保持10分钟。

为了在MEF细胞中定位成像蛋白，培养的细胞生长在聚-d日-赖氨酸涂层培养载玻片（BD Biosciences，San Jose，CA）。转染后36至48小时，用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，并用0.1%Triton X-100在含有5%山羊血清的PBS中处理30分钟。细胞在4°C的一级抗体中培养过夜，然后相应地培养二级抗体。

荧光显微镜和数据分析。

脑组织切片的所有图像均在倒置蔡司LSM 510 Meta系统上采集，氩激光提供488 nm的激发，氦氖激光提供543 nm的激发。为了对DCN区轴突营养不良性肿胀进行统计分析，使用60×水物镜获得共焦图像。计算每个视野中轴突营养不良肿胀的数量。用于P7、P10、P14、P18和P28小鼠量化的图像数量分别为13、14、16、7和5。

细胞培养的所有图像都是在垂直蔡司LSM 510系统上采集的，该系统使用氩氪激光器提供488和568 nm激发线。使用40×水物镜采集图像（其他参数：1024×1024像素，3.2μs像素停留时间，12位数据深度，两次扫描的平均值，变焦1.2）。所有图像的红色通道设置保持不变，因此可以使用红色通道信号强度来比较MEF细胞中MAP1B–myc和LacZ–myc的表达水平。图像在MetaMorph软件（英国白金汉郡Universal Imaging Corporation）中进行处理，并测量每个细胞胞浆区域的平均红通道信号强度。共有83、73、183和218个细胞分别用于转染GFP–LC3和LacZ–myc的细胞（未经雷帕霉素处理）和转染GFP-LC3和MAP1B–myc但未经雷巴霉素处理的细胞。对每个细胞的GFP–LC3标记的泪点数量进行计数。将细胞分为两组进行统计分析：（1）200以下的红通道强度和（2）200-2000之间的红通道密度。根据初步分析，选择200的截止点为最佳值。由于LacZ–myc或MAP1B–myc过度表达导致的潜在伪影，红色通道强度高于2000的细胞图像被丢弃。使用正态分布Student’st吨测试，或F类适当时进行测试。

电子显微镜。

GFP–LC3/卢彻小鼠（P10）经心灌注4%多聚甲醛。通过振动切片制备的小脑片在PBS中储存过夜。对于形态，切片用2.5%戊二醛进一步固定在0.1米二羧酸缓冲液，pH 7.4，并在同一缓冲液中用1%四氧化锇进行后固定。用0.5%醋酸铀酰水溶液处理后，用分级酒精脱水，用环氧丙烷处理，并将样品包埋在Durcupan（瑞士布赫斯市Fluka）。树脂在60°C的烘箱中聚合2–3天。在Reichert-Jung Ultra cut E超微切片机上用杜邦（Billerica，MA）金刚石刀切割银切片。切片收集在200目铜网格上，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。对于免疫电镜，小脑切片固定在0.1%戊二醛中米二甲氨基甲酸缓冲液，pH 7.4，在冰上放置30分钟。用0.05淬火切片米氯化铵在同一缓冲液中。然后，将其在分级酒精中脱水，嵌入LR White（硬级）树脂中（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州华盛顿堡），并在50°C的烘箱中聚合过夜。在200目Formvar–碳涂层镍网格上收集淡金色超薄切片。用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS封闭有切片的网格，用兔抗GFP（1:1000）孵育，用山羊抗兔IgG偶联的10nm金胶体进行探测。切片与醋酸铀酰进行轻微对比。在这两个实验中，使用80 kV操作的Jeol（Peabody，MA）100CX电子显微镜对栅极进行检查。显影并扫描负片。图像在Adobe Photoshop（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）中进行处理。为了量化免疫电镜结果，从18幅图像中汇总了与自噬体相关的金颗粒数量和其余胞浆中的金颗粒数。自噬体的面积和细胞溶质的其他部分也从相同的图像中求和。

细胞和组织提取物制备和Western blot。

以下所述的所有操作均在4°C下进行。转染后48小时，用PBS冲洗细胞并在PBS中收获。细胞在台式离心机上以3000 rpm转速短暂旋转5分钟，并在200μl提取缓冲液（20 m）中溶解米HEPES，pH 7.4，1 m米氯化镁2，0.25米米氯化钙2，0.1%Triton®声波风廓线仪X-100，120米米NaCl、200μg/ml PMSF、4μg/ml胃蛋白酶抑制素、无EDTA蛋白酶抑制剂混合物和DNase I），使用18G1针15次，27G针60次。通过在3000 rpm下离心5分钟来排除不溶性部分。用萃取缓冲液将上清液的体积增加到350μl。

在含有0.32的缓冲液中，用电机驱动均质器以2.5的速度均质12次，获得小鼠大脑提取物米蔗糖，1米米氯化钠三，20米米HEPES，pH 7.4，1 m米氯化镁2，0.25米米氯化钙2、无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒、200μg/ml PMSF、4μg/ml胃蛋白酶抑制素和DNase I。对于每克湿重的组织，使用4 ml均质缓冲液。组织提取物在1400×克持续10分钟，将颗粒再次均质六次，然后离心。将两种上清液合并并以710×克保持10min，并保留产生的上清液。在某些情况下，在13200×克持续20分钟。按照制造商的协议，使用微型BCA蛋白质分析试剂盒测量样品的蛋白质浓度。将等量的蛋白质加载到每个凝胶通道中。凝胶上的蛋白质使用微型转斑点电泳转移细胞（Bio-Rad，Hercules，CA）转移到PVDF膜上，并使用含有1×转移缓冲液、1:1000（v/v）抗氧化剂、20%甲醇和0.025%十二烷基硫酸钠的改良转移缓冲液，在30 v下过夜。用5%无脂奶粉在TBST（TBS with Tween 20）中封闭印迹1h，并在相应的一级抗体和HRP结合二级抗体中孵育1h和40 min。使用化学发光试剂Plus试剂盒（PerkinElmer，Boston，MA）检测蛋白质。

亲和力纯化。

如前所述，使用制造商优化版本的协议，将M-270环氧树脂Dyanbeads与亲和纯化的多克隆抗GFP抗体偶联(Cristea等人，2005年). 用等体积的2×拉出缓冲液稀释细胞或组织提取物，并在4°C下与抗体包被的Dynabeads孵育2.5 h（每1 mg脑蛋白中约0.4 mg抗GFP偶联Dynabheads）。1×拉出缓冲器包含20 m米HEPES，pH 7.4，0.5 m米氯化镁2，0.5米米氯化钙2、蛋白酶抑制剂鸡尾酒、100μg/ml PMSF、2μg/ml胃蛋白酶抑制素、0.1%Triton X-100和120 m米氯化钠。用1×拔出缓冲液洗涤五次镝头，并用350μl含有0.5 m的洗脱缓冲液洗脱米EDTA和0.5米NH3·H2在室温下，将管子置于旋转轮上20分钟。洗脱液在液氮中冷冻并在Speedvac（马萨诸塞州沃尔瑟姆热电公司）中干燥。样品在凝胶加载缓冲液中溶解，并在65°C下加热10分钟，然后运行SDS-PAGE。凝胶被考马斯蓝（Pierce）胶体染色。

质谱分析。

将整个凝胶层切成约30个2 mm宽的切片。每个凝胶块用50 m的混合物去污米碳酸氢铵和乙腈以1:1的比例在4°C下保持4小时，缓冲液在2小时发生变化。用乙腈脱水凝胶片，还原10 m米100 m内的三（2-羧乙基）膦盐酸盐米在37°C下碳酸氢铵30分钟，半胱氨酸残基与50 m烷基化米100米碘乙酰胺米碳酸氢铵在室温、黑暗中放置1 h。然后将每个凝胶片中的蛋白质在37°C下进行胰蛋白酶消化（50–100 ng）至少3 h。反应被7%甲酸和0.1%TFA阻止。使用装在凝胶加载尖端上的Poros 50反相珠（Applied Biosystems，Foster City，CA）在4°C下提取所得肽过夜，用0.1%TFA洗涤，并用H中的半饱和2，5-二羟基苯甲酸洗脱2O/MeOH/乙酸（35:60:5 v/v/v）直接放在光盘基质辅助激光解吸/电离（MALDI）样品探针上(Krutchinsky等人，2000年). 使用室内构建的MALDI四极杆-四极杆飞行时间质谱仪（Centaur原型；加拿大安大略省康科德Sciex）获得每个凝胶片中蛋白质的胰蛋白酶质谱(Krutchinsky等人，2000年). 然后将相同的MALDI样品探针加载到室内构建的MALDI-离子阱质谱仪中（LCQ DECA XP；热电公司）(Krutchinsky等人，2001年)以收集串联质谱（MS/MS）光谱。使用标准肽校准MS和MS/MS光谱。使用计算机搜索引擎Xproteo，使用准确质量的胰蛋白酶肽及其产物离子来识别每个凝胶片中的蛋白质(http://www.xproteo.com网站)搜索最新的国家生物技术信息中心非冗余蛋白质数据库。假设驱动的质谱方法(Kalkum等人，2003年)在一些分析中使用了。

结果

GFP–LC3在大鼠Purkinje细胞轴突营养不良性肿胀中的积累卢彻表达GFP–LC3的小鼠

在组成型CAG启动子的控制下，转基因GFP–LC3在转基因小鼠脑中产生了与内源性LC3几乎相等数量的GFP–LC蛋白(水岛等人，2004年). 在包括小脑浦肯野细胞在内的许多脑区的CNS神经元中检测到GFP–LC3的直接荧光(图1A类)（补充图1A类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 为了监测神经退行性疾病条件下的自噬活性，我们卢彻通过基因杂交产生GFP–LC3的小鼠卢彻和GFP–LC3转基因菌株（称为GFP–LC 3/卢彻下文）。在P10，在DCN区域和GFP–LC3的Purkinje细胞轴突束中观察到整体绿色荧光显著增强，其特征是存在大量绿色“病灶”/卢彻小鼠与GFP–LC3转基因小鼠的比较(图1A1类,A2级). 当在高倍镜下检查时，这些绿色荧光病灶似乎呈“灯泡”或“鱼雷”形状，要么直接附着在小脑深部核的躯体上，要么靠近小脑深核的躯体(图1A3号,A4（A4）). 抗钙结合蛋白抗体免疫染色显示，这些病灶主要为钙结合蛋白阳性，表明它们是浦肯野细胞轴突(图1B类). 这些肿胀的浦肯野细胞轴突也被磷酸化Tau（AT8）抗体标记(图1C类)表明它们确实营养不良并且正在退化。我们的研究结果表明卢彻突变触发了自噬标记GFP–LC3在退化Purkinje细胞的轴索营养不良肿胀中的积聚，这些特征可能与自噬活性改变有关。

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GFP–LC3的DCN中Purkinje细胞肿胀轴突中GFP–LC 3的积累/卢彻老鼠。A类，代表性的共焦图像显示了GFP–LC3在GFP–LC3的DCN（封闭区域）中重新分布到绿色病灶/卢彻老鼠(A2级,A4（A4）). 以GFP–LC3转基因小鼠为对照(A1类,A3号). 单克隆抗NeuN抗体（1:200）免疫染色显示为红色。比例尺：A1类,A2级，100微米；A3号,A4（A4），20微米。B类GFP–LC3的DCN中GFP–LC 3绿色荧光与单克隆抗钙结合蛋白抗体（1:1000）的红色免疫荧光染色重叠/卢彻老鼠。比例尺，20μm。C类GFP–LC3的DCN中肿胀的Purkinje细胞轴突中GFP–LC 3（绿色）和磷酸化的Tau（红色；用单克隆抗磷酸化Tau抗体AT-8染色，1:250）/卢彻老鼠。比例尺，20μm。在两者中B类和C类，星号代表小脑核。

轴索营养不良性肿胀中自噬体的诱导积聚卢彻浦肯野细胞与自噬的诱导有关

我们进行了几项实验，以确定GFP–LC3在退化Purkinje细胞的轴索营养不良肿胀中的积累是否与自噬诱导有关。首先，高倍共焦图像显示GFP–LC3轴索营养不良性肿胀内有大量GFP–LC3点/鲁彻浦肯野细胞(图2A类). 这些GFP–LC3点的直径为0.2–0.6μm，在典型的自噬体范围内(水岛等人，2002年). 接下来，通过电镜超微结构分析，我们确定了轴突营养不良性肿胀中自噬体的双膜结构特征(图2B类，箭头）。许多液泡显示出高电子密度，代表晚期降解形式或“自溶体”(图2B类，箭头）。成簇线粒体（其中一些萎缩）(图2B类，三角形）在这些自噬体附近发现。相反，在对照组小鼠中未观察到轴索营养不良肿胀(图2B类，插图）。第三，为了检测GFP–LC3在肿胀轴突自噬体的定位，我们使用抗GFP抗体进行了免疫电镜实验。发现抗体包被的金颗粒优先标记自噬体(图2C1类和放大的图像指挥与控制–C5级). 从18个免疫电镜图像定量分析了轴突营养不良性肿胀中金颗粒的分布。与自噬体相关的金颗粒的密度（总数309）是剩余胞质溶胶（总数163）的2.8倍。这些结果表明，GFP–LC3在轴突营养不良性肿胀中优先被招募为自噬体。第四，为了检测自噬降解，我们在LysoTracker标记溶酶体或酸性囊泡的情况下，使用小脑切片培养对营养不良轴突中的自噬体进行了实时成像。在用LysoTracker短暂孵育后，我们在许多含有GFP–LC3点的轴突肿胀中观察到红色荧光“点”。此外，在同一液泡中观察到LysoTracker和GFP–LC3的共定位(图2D类，底部）。这些数据表明，在轴突营养不良性肿胀中卢彻浦肯野细胞，一些GFP–LC3修饰的自噬体已经吸收了LysoTracker，进一步证实了这些自噬体的降解性质。作为对照，野生型Purkinje细胞的正常轴突末端含有低水平的GFP–LC3，LysoTracker标记较差。此外，未观察到GFP–LC3点(图2D类，顶部）。为了测试自噬诱导的已知信号事件是否参与其中，我们还检测了哺乳动物雷帕霉素（mTor）激酶活性的靶点(Ravikumar等人，2004年;Tanida等人，2005年)在卢彻小脑。结果表明：卢彻导致mTor激酶途径部分失活，如底物S6激酶和随后的S6核糖体蛋白磷酸化降低所示（补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)与自噬诱导一致。总之，这些结果表明自噬在卢彻Purkinje细胞，涉及轴突营养不良性肿胀中自噬体的积累。

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GFP–LC3中退化浦肯野细胞轴突营养不良肿胀中自噬的诱导/卢彻老鼠。A类典型的共焦图像显示退化Purkinje细胞（P12）轴突营养不良肿胀内的GFP–LC3点。比例尺，5μm。B类，典型的电子显微镜图像显示退化Purkinje细胞（P10）的轴突营养不良肿胀。轴突营养不良性肿胀中积聚了大量自噬体（箭头所示）、自溶体（箭头）和萎缩线粒体（三角形）。此外，位于轴突营养不良性肿胀上的两个突触被标记为红色星号。比例尺，1μm。插图显示了野生型小鼠DCN的代表性图像。两个轴突被标记为：1，有髓；2，轴突末端有两个突触（红色星号）。比例尺，0.15μm。请注意，控制轴突的大小明显小于轴突营养不良肿胀的大小。C类轴索营养不良性肿胀的典型免疫电镜图像(C1类)退化的浦肯野细胞（P10）和四个自噬体/自溶体的放大图像(C2–C5)从18幅免疫电镜图像中筛选出的金颗粒显示，包被多克隆抗GFP抗体（1:5000）的金颗粒主要与自噬体有关。比例尺：C1类，1μm；C2–C5，0.2微米。D类GFP–LC3荧光（绿色）和LysoTracker染色（红色）对培养小脑切片中退化Purkinje细胞的轴索营养不良性肿胀进行实时成像，结果显示GFP–LC 3和LysoTracker（底部行）部分共定位。野生型控制（顶行）显示GFP–LC3水平较低，没有LysoTracker标记。未观察到GFP–LC3斑点。比例尺，5μm。

GFP–LC3积聚的轴突营养不良性肿胀是Purkinje细胞对卢彻-诱导性神经变性

为了了解GFP–LC3相关的轴突营养不良和自噬在轴突或神经元变性中的作用，我们研究了GFP–LC标记的轴突不营养性肿胀的发生与Purkinje细胞丢失之间的时间关系。通过GFP荧光监测，最早检测到的异常与卢彻突变是DCN（Purkinje细胞体远端）中GFP–LC3标记的Purkinje细胞轴突营养不良肿胀(图3A类，底部），然后沿着小脑白质中的轴突束（靠近Purkinje细胞体）(图3A类，顶部）。这些GFP标记的轴突营养不良性肿胀早在GFP–LC3中的P7就被检测到/卢彻小脑中没有可检测到的浦肯野细胞死亡。GFP–LC3标记的DCN轴突营养不良性肿胀密度在随后的3d内迅速增加，并在P10和P14之间达到并保持最大值(图3A类,B类). 然后在P14后显著降低，到第四周DCN中降至峰值密度的20%(图3B类). 然而，大多数Purkinje细胞在卢彻通过GFP荧光或抗钙结合蛋白免疫染色测定P10和P14之间的小鼠（数据未显示）。这些观察结果与之前对卢彻小脑，显示轴突肿胀是浦肯野细胞退化的早期迹象(Dumesnil-Bousez和Sotelo，1992年). 此外，GFP–LC3点状物也见于卢彻Purkinje细胞（补充图1B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料)但其频率远低于轴突营养不良性肿胀，这表明轴突终末在Purkinje细胞变性期间极易发生自噬反应。我们的研究表明，伴随自噬活动改变的轴突营养不良肿胀是神经退行性变期间的早期应激反应。

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GFP–LC3标记的轴突营养不良性肿胀的形成作为退化Purkinje细胞的早期反应卢彻老鼠。A类，代表性的共聚焦图像显示了GFP–LC3标记的轴突营养不良肿胀在小脑白质轴突束（上排）和GFP–LC3退化浦肯野细胞的DCN（下排）中的发展/卢彻不同出生日龄的小鼠。比例尺，20μm。B类，中图像的量化A类显示GFP–LC3退化Purkinje细胞的DCN中轴突营养不良性肿胀的密度/卢彻小鼠（正常化为P14）在P10和P14之间处于峰值水平。P7、P10、P14、P18和P28年龄时用于量化的图像数量分别为13、14、16、7和5。错误栏指示SE。

GFP–LC3在脑内与微管相关蛋白MAP1B高亲和力结合

为了深入了解大脑中的自噬调节，特别是LC3相关自噬体的调节，我们鉴定并表征了GFP–LC3转基因小鼠大脑中的LC3结合蛋白。抗GFP抗体的免疫亲和纯化产生了一条强的考马斯蓝染色带，经质谱分析鉴定为MAP1B(图4A类). 该MAP1B蛋白带随着洗涤强度的增加而持续存在，而其他蛋白带则减少(图4A类，1-6车道）。这一结果表明MAP1B是LC3的主要高亲和力相互作用蛋白。我们还能够在SDS-PAGE上鉴定出约35 kDa和约75 kDa的E2样蛋白Atg3（后者可能是GFP–LC3和Atg3的共轭形式）(图4A类，车道7）（补充图3B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料)但只有在非常温和的条件下，并且含有相对大量的大脑提取物。GFP–LC3与Atg3的这种结合与在自噬过程中作为酵母Atg8同源物的保守LC3功能一致(Ichimura等人，2000年). 大脑中发现的其他LC3相互作用蛋白包括MAP1A和微管蛋白(图4A类).

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在表达GFP–LC3的转基因小鼠脑中鉴定MAP1B作为主要LC3结合蛋白。A类考马斯蓝染色SDS-PAGE显示了通过免疫亲和纯化从野生型（WT）或GFP–LC3转基因（TG）小鼠脑提取物（P30）中分离的蛋白质，并通过质谱分析进行了鉴定。即使在非常严格的洗涤条件下，分离物中也存在MAP1B。从1号车道到6号车道，清洗严格程度增加如下：1号车道和2号车道，200 m米氯化钠和0.15%吐温20；车道3和4，200 m米氯化钠和0.15%Triton X-100；车道5和6，400 m米氯化钠和0.3%Triton X-100。第7巷，使用GFP–LC3转基因小鼠（P10）在低洗涤强度（120 m）下对全脑进行大规模纯化米氯化钠和0.1%Triton X-100）。有关免疫亲和纯化和质谱分析的详细信息，请参见方法和材料以及补充图3（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).B类，使用用MAP1B–myc（泳道3，4）或对照FLAG–GluRδ2（泳道1，2）质粒转染的HEK 293T细胞的共免疫沉淀（CoIP）实验显示MAP1B–myc与LC3I和LC3II的特异性相互作用。此外，MAP1B过度表达降低LC3II水平。转染细胞要么饥饿（2、4道），要么在正常培养基条件下培养（1、3道）。使用抗myc抗体进行免疫沉淀。在联合免疫沉淀前（INPUT，1-4通道）和后（αmyc-Co-IP，5-8通道），使用抗LC3抗体通过Western blot检测内源性LC3I和LC3II。控制质粒显示在通道1、2、5和6中；MAP1B–myc质粒显示在通道3、4、7和8中。

MAP1B与LC3I和LC3II结合

与其他组织相比，MAP1B在大脑中高度丰富(Gonzalez-Billault等人，2004年). 因此，它与LC3的相互作用表明MAP1B对自噬的脑特异性调节。为了进一步测试MAP1B和LC3的相互作用，我们通过用表达C末端myc标记全长MAP1B（MAP1B–myc）的质粒转染HEK 293T细胞来过度表达MAP1B。与未转染（数据未显示）或转染对照质粒的HEK 293T细胞相比(图4B类，通道1），过度表达MAP1B–myc的细胞似乎产生较少的LC3II和较多的LC3I(图4B类，车道3）。LC3II水平的降低在一项显示LC3相关自噬体数量减少的试验中得到验证(图5). 此外，营养饥饿增强了转染MAP1B–myc的细胞中LC3II的水平(图4B类，通道4）或对照质粒(图4B类，车道2）。使用抗myc抗体结合的Sepharose珠免疫沉淀法检测内源性LC3与外源性MAP1B–myc的结合，然后使用抗LC3抗体检测LC3。LC3I和LC3II均被抗myc抗体免疫沉淀，表明MAP1B–myc与细胞溶质LC3I及脂质化LC3II结合(图4B类，车道7、8）。使用MEF细胞的类似实验也显示LC3I和LC3II与MAP1B结合（数据未显示）。

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MAP1B–myc的过度表达降低了GFP–LC3点的数量，但对整体自噬活性影响不大。A类，用GFP–LC3转染的MEF细胞的代表性共聚焦图像仅显示弥漫性胞浆和细胞核GFP–LC3定位以及胞浆GFP–LC3点状。比例尺，10μm。B类，共转染GFP–LC3和MAP1B–myc的MEF细胞的典型共焦图像显示GFP–LC 3（绿色）和MAP1B-myc（红色）的弥漫性细胞溶质共定位（顶行）。与GFP–LC3和LacZ–myc共同转染的对照细胞显示出广泛的核GFP–LC 3定位和细胞溶质GFP–LCD 3点（底行）。细胞固定并用抗myc抗体染色（小鼠，1:1000）。比例尺，10μm。C类与转染LacZ–myc的细胞相比，使用GFP–LC3 puncta对MEF细胞分数进行量化显示，使用MAP1B–myc时，使用GFP-LC3 putta的细胞数量大大减少（～20%）。D类MEF细胞中每细胞GFP–LC3点平均数量的量化显示，与转染LacZ–myc（>10）的细胞相比，MAP1B–myc存在时每细胞GFP-LC3点的平均数量（<5）大大减少。对于两者C类和D类，转染MEF细胞在200 n时用雷帕霉素（Rap）处理米如图所示，在某些情况下持续18小时。共有83、73、183和218个细胞分别用于转染GFP–LC3和LacZ–myc的细胞（未经雷帕霉素处理）和转染GFP-LC3和MAP1B–myc但未经雷巴霉素处理的细胞。低或高LacZ–myc或MAP1B–myc表达水平的细胞分别进行量化，详见材料和方法。只有在低MAP1B–myc表达水平下，雷帕霉素才能显著增加每个细胞GFP–LC3点的平均数量，而雷帕霉素的自噬激活不受LacZ–myc的表达水平影响。具有统计显著性的比较(第页<0.05）标记为*，无显著比较(第页≥0.05）标记为**。E类，MAP1B的过表达没有导致S6核糖体蛋白磷酸化的消除（用于自噬诱导的测定）或p62/SQSTM1的积累（用于抑制自噬降解的测定）。用MAP1B–myc（2、4、6道）或对照质粒FLAG–GluRδ2（1、3、5道）转染HEK 293T细胞48 h。细胞在正常条件下培养（1、2道）或用巴非霉素A1处理（200 n）米; 使用MAP1B、磷酸-S6、总S6、p62/SQSTM1或LC3抗体制备细胞裂解液用于免疫印迹分析。每条通道都装载了40μg蛋白质。

MAP1B的过度表达降低了GFP–LC3标记的自噬体的数量

上述结果表明，大量MAP1B的存在降低了转染细胞中LC3II的水平。为了检测由于MAP1B过度表达导致的LC3II降低是否与LC3定位的改变相关，我们将MEF细胞与MAP1B–myc和GFP–LC3的表达质粒共转染。在对照实验中，在单独转染GFP–LC3的MEF细胞的细胞核和胞浆中都发现了GFP–LC3；其中一些细胞表现出GFP–LC3的胞浆荧光斑点，表明自噬体形成(图5A类). 在与GFP–LC3质粒和对照质粒LacZ–myc共转染的MEF细胞中观察到类似的GFP–LC3分布(图5B类，底部）。然而，在与MAP1B–myc和GFP–LC3共转染的MEF细胞中，GFP–LC 3被排除在细胞核之外，MAP1B-myc与GFP–LCD 3在胞浆中共定位，主要以扩散方式(图5B类，顶部）。这些结果证实了免疫亲和纯化实验显示的MAP1B–LC3相互作用(图4). 在少量共转染的MEF细胞中，我们观察到GFP–LC3点不含MAP1B–myc（数据未显示）。此外，即使在雷帕霉素（一种有效的自噬诱导剂）的存在下，也观察到GFP–LC3的主要扩散分布（数据未显示）。我们量化了MAP1B–myc对MEF细胞中GFP–LC3标记的自噬体形成的影响。在所有表达水平上，MAP1B–myc，而不是LacZ–myc都降低了含有GFP–LC3点的MEF细胞的比例(图5C类)以及每个细胞的平均穿孔数(图5D类). 只有当MAP1B–myc低水平表达时，雷帕霉素才显著增加每个细胞GFP–LC3点的平均数量(图5D类). 总之，这些结果表明，过度表达的MAP1B与GFP-LC3的特异性结合减少了GFP-LC3-标记的自噬体的数量。

通过S6磷酸化和p62/SQSTM1水平检测，MAP1B的过度表达对自噬活性几乎没有影响

MAP1B在GFP–LC3相关自噬体中的抑制作用增加了MAP1B影响整体自噬活性的可能性。因此，我们检测了过度表达MAP1B–myc的HEK 293T细胞的自噬诱导和自噬降解效率。为了检测自噬诱导，我们监测了S6核糖体蛋白的磷酸化水平(Ravikumar等人，2004年;Tanida等人，2005年). 正如预期的那样，自噬诱导剂雷帕霉素在不改变S6总水平的情况下消除了S6磷酸化(图5E类，车道1、5）。相反，与对照质粒转染的细胞相比，转染MAP1B的细胞产生的磷酸化S6和总S6数量相似(图5E类（第1、2条通道），证明MAP1B的过度表达对参与自噬诱导的mTor激酶途径的失活几乎没有影响。

最近的一项研究表明，LC3-结合蛋白p62/SQSTM1及其相关的细胞结构被自噬降解。用巴非霉素A1（自噬抑制剂）抑制自噬导致HeLa细胞中p62/SQSTM1的积累(Bjorkoy等人，2005年). 我们自己的研究表明，p62/SQSTM1的蛋白水平在自噬损伤期间显著增加，如巴非霉素A1处理的HEK 293T细胞所示(图5E类，车道3、4）和MEF单元(图6A类)，靶向缺失Atg7的MEF细胞(附件7−/−) (小松等人，2005年) (图6B类)，靶向删除Atg5的MEF细胞(附件5−/−)（数据未显示），小鼠大脑自噬缺陷（数据未展示）。这些结果表明，自噬抑制与p62/SQSTM1水平升高之间存在普遍相关性，这使得我们可以使用该蛋白来检测自噬缺陷。用MAP1B转染的细胞(图5E类，通道2）在没有MAP1B过度表达的情况下，不会在细胞上产生p62/SQSTM1水平的增加(图5E类，车道1）。相反，巴非霉素A1处理增加了p62/SQSTM1的水平(图5E类和雷帕霉素降低了p62/SQSTM1的水平(图5E类，泳道5）。在巴非霉素A1处理转染细胞期间，LC3II也积累(图5E类，车道3）。因此，如p62/SQSTM1所分析，MAP1B的过度表达似乎对自噬活性的抑制作用不大。

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内源性磷酸化MAP1B与GFP–LC3标记的自噬体在野生型MEF细胞中共定位，并且在自噬受损时不会积累。A类与p62/SQSTM1和LC3II相比，在使用巴非霉素A1（100 n）治疗期间，内源性MAP1B（-P）水平没有显著改变米; Baf，车道2）或雷帕霉素（200 n米; 与未经处理的细胞（Ctl，通道1）相比，野生型MEF细胞中的Rap（通道3）持续18小时。将含有约40μg蛋白质的细胞提取物加载到每条通道上，用MAP1B、MAP1B-P、p62/SQSTM1和LC3进行免疫印迹分析。B类，内源性MAP1B（-P）水平在附件7+/−（车道1）和附件7−/−（通道2）MEF细胞与p62/SQSTM1和LC3II细胞相似，通过免疫印迹分析检测。肌动蛋白被用作负荷控制。C类Western blot分析MEF细胞内内源性MAP1B或MAP1B-P，未转染（1、3道）或转染GFP–LC3质粒（2、4道）。免疫印迹显示野生型MEF细胞（1区）中内源性MAP1B或MAP1B-P水平较低但可检测到。MAP1B-P与GFP–LC3结合，如使用抗GFP抗体进行免疫沉淀所示，然后检测MAP1B-P（第4条车道）。CoIP，免疫共沉淀。D类，转染GFP–LC3并用抗MAP1B抗体PP172免疫染色的野生型MEF细胞的典型共焦图像显示GFP–LC 3和内源性MAP1B-P的共定位。比例尺，20μm。

这些结果表明，MAP1B的过度表达对自噬活性几乎没有影响，这是通过其在自噬诱导期间对S6磷酸化的影响以及p62/SQSTM1的自噬降解来评估的。

内源性磷酸化MAP1B与GFP–LC3标记的自噬体在野生型MEF细胞中共定位，并且在自噬受损时不会积累

最近的研究表明，MAP1B在神经发育和病理条件下通过调节微管动力学，在轴突生长和变性/再生中发挥重要作用(Gordon-Weeks和Fischer，2000年;Gonzalez-Billault等人，2004年). MAP1B的磷酸化在这些功能的调节中至关重要。为了研究MAP1B-P和LC3之间的可能关系，我们首先测试LC3是否与MAP1B-P相互作用。我们注意到野生型MEF细胞表达适度水平的内源性MAP1B，如使用抗MAP1B抗体的免疫印迹所示(图6C类，车道1）。抗MAP1B-P抗体SMI-31检测到低水平但可检测到的MAP1B-P(Gordon-Weeks和Fischer，2000年)和PP172(Good等人，2004年) (图6C类，车道1）。然后我们用GFP–LC3质粒转染野生型MEF细胞，并用抗GFP抗体共免疫沉淀MAP1B。我们发现，抗MAP1B-P抗体（PP172）检测到的MAP1B-P与GFP-LC3蛋白一起被下调(图6C类进一步，在转染GFP–LC3质粒的野生型MEF细胞中，我们发现GFP–LC 3点与内源性MAP1B-P部分共定位，如使用任一抗体PP172的免疫荧光染色所示(图6D类)或SMI-31（未显示数据）。这一结果表明MAP1B-P通过与LC3的相互作用与自噬体相关。

由于自噬体注定要进行溶酶体降解，因此驻留在自噬体上的蛋白质的一个可能后果是通过自噬降解，如先前p62/SQSTM1降解所示(Bjorkoy等人，2005年). 为了测试自噬受损时MAP1B和/或MAP1B-P[MAP1B（-P）]水平是否增加，我们用自噬抑制剂巴非霉素A1处理野生型MEF细胞，并通过免疫印迹分析检测内源性MAP1B及MAP1B-P水平。与抑制自噬一致，巴非霉素A1处理野生型MEF细胞显著增加p62/SQSTM1和LC3II水平，而内源性MAP1B（-P）与未处理细胞相比没有积累(图6A类，车道1、2）。此外，雷帕霉素治疗通过自噬诱导导致p62/SQSTM1水平降低(图6A类，车道1、3）。相反，雷帕霉素治疗后MAP1B（-P）水平没有显著变化(图6A类，车道1、3）。HEK 293T细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。我们还展示了附件7−/−MEF细胞，其中必需的自噬基因Atg7被删除(小松等人，2005年)与相比，未改变MAP1B或MAP1B-P的水平附件7+/−对照组，如使用抗MAP1B抗体和抗MAP1B-P抗体（SMI-31）的免疫印迹分析所示(图6B类). 正如预期，附件7−/−MEF细胞仅表达LC3I，自噬缺陷导致p62/SQSTM1水平显著升高。同样，MAP1B（-P）蛋白在新生儿大脑中的产生量相等附件5−/−老鼠和它们的窝友附件5+/+（补充图4，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 结果表明，与p62/SQSTM1不同，MAP1B（-P）在自噬损伤过程中没有积累，表明MAP1B。

磷酸化MAP1B在轴突营养不良性肿胀中积聚，GFP-LC3中与LC3结合的MAP1B-P数量增加/卢彻小脑

如前一个实验所示，MAP1B-P和LC3在自噬体上的关联促使我们研究MAP1B-P在轴突营养不良性肿胀中的表达鲁彻浦肯野细胞。GFP–LC3小脑切片的免疫荧光染色/卢彻使用抗MAP1B-P抗体（PP172）的小鼠表明，在退化Purkinje细胞的轴索营养不良性肿胀中，MAP1B-P积累并与GFP-LC3共存(图7A类，底部）。相反，GFP–LC3转基因小鼠小脑切片在背景以上未显示MAP1B-P的明确染色(图7A类，顶部）。我们还检测了p62/SQSTM1在卢彻使用抗p62/SQSTM1抗体对Purkinje细胞进行免疫染色。结果显示小脑核胞体中有明显的染色，但Purkinje细胞轴突肿胀中未检测到p62/SQSTM1染色（补充图5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 相反，p62/SQSTM1在缺乏自噬的Purkinje细胞的轴突末端积聚（数据未显示）。考虑到p62/SQSTM1积累和自噬缺陷之间的联系，这些结果表明自噬在卢彻浦肯野细胞，并进一步暗示在轴突营养不良肿胀中积累的MAP1B-P卢彻浦肯野细胞不能归因于自噬的一般性失败。

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GFP–LC3轴突营养不良性肿胀中与GFP–LC3结合的MAP1B-P数量增加/卢彻浦肯野细胞。A类，GFP–LC3小脑切片的典型共焦图像/卢彻用抗MAP1B-P抗体（PP172）免疫染色的小鼠（P10）在退化Purkinje细胞的轴索营养不良肿胀中显示GFP–LC3（绿色）和MAP1B-P（红色）的部分共定位。比例尺，20μm。B类、野生型（WT）、GFP–LC3转基因（TG）和GFP–LC 3小脑组织提取物（INPUT）的Western blot分析/卢彻小鼠（TG+LC）及其抗GFP免疫沉淀剂（αGFP-CoIP）显示，GFP-LC3中MAP1B-P与GFP–LC3的结合增加，但MAP1B与GFP-LC3的连接没有增加/卢彻小脑与GFP–LC3转基因小脑的比较。阴性对照显示抗GFP免疫沉淀中缺乏内源性LC3、beclin 1或calbindin。

为了调查卢彻GFP–LC3与MAP1B-P结合的突变体内，我们使用抗GFP抗体从GFP–LC3转基因或GFP–LC 3转基因的小脑匀浆中共免疫沉淀MAP1B-P/卢彻老鼠。用于共免疫沉淀的输入中MAP1B（-P）的总量相似(图7B类，INPUT），而更多的MAP1B-P绑定到GFP–LC3中的GFP–LC3/鲁彻与GFP–LC3转基因小鼠相比(图7B类，αGFP CoIP）。GFP–LC3–MAP1B-P结合似乎是特异性的，因为钙结合蛋白、内源性LC3和另一种自噬蛋白beclin 1通过相同的免疫纯化程序与GFP–LC 3无关。免疫纯化样品中缺乏内源性LC3也表明GFP–LC3没有与内源性LC3.形成异寡聚体。这些结果表明卢彻突变促进轴突营养不良性肿胀中MAP1B-P的局部积聚和与LC3结合的MAP1B-P水平的增加卢彻浦肯野细胞。与此相一致，最近的证据表明MAP1B-P通常积聚在生长轴突的远端和受损轴突的损伤部位(Gordon-Weeks和Fischer，2000年;Gonzalez-Billault等人，2004年); 因此，我们推测LC3–MAP1B-P相互作用可能提供了一种机制，可以将自噬体靶向轴突末端，以响应退化信号。

讨论

不同中枢神经系统疾病的轴索营养不良的一个共同特征是细胞器紊乱的积累，包括形成大量来源不明的液泡(Yagishita，1978年). 然而，局部轴突肿胀中异常结构的机制尚不清楚。在这里，我们使用一个产生GFP–LC3的转基因小鼠系，在分子水平上表明自噬是在营养不良的轴突中诱导的卢彻Purkinje细胞（兴奋毒性的遗传模型）。自噬的诱导涉及自噬体在轴突营养不良性肿胀中的积聚鲁彻浦肯野细胞。我们进一步表明，GFP–LC3 puncta监测到的累积自噬体最初在营养不良的轴突中广泛检测到，后来在卢彻浦肯野细胞体和萎缩树突。我们证明，轴突营养不良性肿胀（自噬体在其中积聚）的发生是一种卢彻-诱导Purkinje细胞变性前的早期反应。在患有神经系统疾病的人脑中，也观察到早期出现营养不良轴突/神经突，其中含有累积的自噬体样结构(Sikorska等人，2004年;尼克松等人，2005年)在人类神经系统疾病的动物模型中(Jeffrey等人，1992年;Li等人，2001年;Lin等人，2003年). 基于我们目前的研究和这些先前的观察，我们认为，在特定疾病机制的下游，特别是在轴突中，存在一个共同的途径，在神经元死亡之前诱导自噬。

尽管激活的自噬通常与自噬体数量的增加有关，但最近的证据表明，还有其他可能导致细胞内自噬小体的积聚。例如，涉及自噬体与溶酶体融合或抑制溶酶体降解的自噬小体成熟受损可能导致自噬体数目的增加(Yamamoto等人，1998年;拉维库马尔等人，2005年;Tanida等人，2005年). 在卢彻小脑，我们观察到mTor激酶途径中的磷酸化降低，这与自噬诱导一致(莱文和克林斯基，2004年;Ravikumar等人，2004年). 此外，我们发现一些GFP–LC3点与LysoTracker标记的小泡共定位，这表明自噬体与溶酶体的融合在轴突肿胀中至少没有完全被阻断。最近，结合泛素和LC3的p62/SQSTM1被证明选择性地招募到自噬体并通过自噬降解(Bjorkoy等人，2005年). 我们发现，药物或基因抑制自噬可导致细胞培养中p62/SQSTM1水平显著增加(图5E类,​,66A类,B类)以及自噬缺陷的浦肯野细胞轴突（数据未显示），而在卢彻浦肯野细胞轴突终末（补充图5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 值得注意的是，轴突运输受损与小鼠中枢神经系统自噬清除亨廷顿蛋白聚集体的失败有关。然而，将自噬体的积累与缺陷轴突运输联系起来的直接证据尚未得到证实体内(拉维库马尔等人，2005年). 通过染色卢彻小脑淀粉样前体蛋白（APP），通常因轴突运输受损而积聚在轴突中(Hirokawa和Takemura，2005年)，我们在浦肯野细胞轴突中没有发现APP水平的显著变化（数据未显示）。综上所述，上述证据表明诱导，而不是某些后期自噬的完全阻断，在一定程度上解释了自噬小体在营养不良轴突肿胀中的积聚卢彻浦肯野细胞。然而，我们的结果不能完全排除其他因素可能导致自噬体在观察到的营养不良性轴突肿胀中积聚的可能性。

哺乳动物中枢神经系统自噬的调节一直是个谜。尽管在原代神经元培养中观察到自噬体的积累(Xue等人，1999年)、器官型脑片培养(Borsello等人，2003年)和疾病条件下的哺乳动物中枢神经系统(Jeffrey等人，1992年;Li等人，2001年;Yue等人，2002年)在生理条件下，哺乳动物中枢神经系统中存在自噬体的形态学证据尚未得到证实（至少其大小与轴突肿胀中发现的大小相当卢彻浦肯野细胞）。巧合的是，尽管GFP–LC3转基因小鼠的神经细胞培养物（未显示数据）以及肝脏和肌肉等许多其他组织中经常发现GFP–LC3点，但在出生后阶段，我们并未在其CNS神经元中检测到GFP–LC点(水岛等人，2004年)，提示中枢神经系统中自噬体的特异性调节。该观察为中枢神经系统神经元上调自噬提供了额外证据，涉及从头开始在诸如退化信号等压力下，自噬体的合成和增大。

为了深入了解中枢神经系统自噬的特异性调节机制，我们确定MAP1B是大脑提取物中LC3的主要高亲和力结合伙伴，并描述了它们的功能关系体内和在体外在MEF细胞中，与神经元细胞相比，其产生的MAP1B的量非常低，我们观察到GFP–LC3定位于自噬体（如GFP–LC 3点所示）；然而，这些细胞中MAP1B的过度表达显著减少了GFP–LC3点的数量。这种抑制是MAP1B剂量依赖性的。与这些观察结果一致，我们发现MAP1B的过度表达也导致自噬体标记LC3II水平的降低。然而，MAP1B的过度表达并未引起磷酸化S6和p62/SQSTM1水平的可检测变化。因此，尽管MAP1B对LC3相关自噬体具有抑制作用，但MAP1B过度表达似乎对自噬活性的这些测量值影响不大。这些结果表明，LC3相关自噬体的存在，在一定条件下（可能在基础水平），可以与整体自噬活动分离。例如，CNS神经元中未检测到GFP–LC3点与正常情况下缺乏自噬活性没有直接关系：自噬显然是正常脑功能所必需的，因为自噬缺陷会导致浦肯野细胞退化（M.Komatsu，Q.J.Wang，G.R.Holstein，J.Iwata，E。Kominami、B.T.Chait、K.Tanaka和Z.Yue，未发表的观察结果），但未观察到GFP–LC3点。另外，LC3相关自噬体的抑制可能触发溶酶体降解的代偿途径。尽管如此，由于与其他组织相比，MAP1B（和成人中的MAP1A）在大脑中高度丰富，观察到的MAP1B对LC3相关自噬体的抑制作用可能解释了在生理条件下，GFP–LC3转基因小鼠的LC3II的内源性水平相对较低，并且CNS中几乎没有GFP–LC3点。

大量证据表明，MAP1B磷酸化是一种发育调控，磷酸化MAP1B在分化神经元以及成年中枢神经系统损伤后表现出神经元可塑性或再生的区域中高水平产生(Gordon-Weeks和Fischer，2000年;Gonzalez-Billault等人，2004年). MAP1B-P也显示在空间上局限于生长的轴突或生长锥的远端(Trivedi等人，2005年). 最近的研究还表明，MAP1B-P通过保持微管处于动态状态对微管稳定性产生重大影响(Trivedi等人，2005年). 我们发现MAP1B-P在轴突营养不良性肿胀中积聚卢彻浦肯野细胞在DCN中，时空一致，存在大量自噬体。此外，与LC3结合的MAP1B-P的量在卢彻小脑与野生型比较。这些结果直接将MAP1B-P水平的增加与轴突营养不良性肿胀中自噬体的积累联系起来。此外，我们的结果表明，自噬受损不会导致MAP1B或MAP1B-P的积累。因此，根据自噬功能依赖于微管的证据(Kovacs等人，1982年;Aplin等人，1992年;Kochl等人，2006年)微管相关蛋白MAP1B-P通常定位于轴突末端的远端(Trivedi等人，2005年)我们假设，与LC3相互作用的MAP1B-P数量增加可能反映了MAP1B-P在招募LC3相关自噬体并将其靶向轴突末端方面的积极作用，而不是自噬小体-溶酶体融合和溶酶体降解受损的结果。

最后，我们的研究表明，MAP1B-P与MAP1B的行为不同，MAP1B-P与自噬体相关，可能通过与LC3结合。虽然可以想象MAP1B的磷酸化导致MAP1B结构的改变，有利于与LC3自噬体结合，但这种结构改变的生化基础，以及在轴索营养不良和变性中诱导自噬小体形成的信号，仍有待确定。

总之，我们的研究结果提供了在兴奋性毒性神经退行性变过程中诱导自噬（涉及自噬体在轴突末端的积累）的分子证据。自噬体的早期积累卢彻Purkinje细胞轴突末端表明轴突末端对各种应激或退化信号的自噬反应具有高度的可接近性。我们最近的研究表明，Purkinje细胞中轴突终末对消除自噬的选择性脆弱性支持了这一观点（Komatsu、Wang、Holstein、Iwata、Kominami、Chait、Tonaka和Yue，未发表的观察结果）。然而，还有几个重要问题有待回答。例如，营养不良轴突中积累的自噬体起源于何处尚不清楚。自噬体可以在轴突中局部生成，也可以在细胞体中生成并运输到轴突末端。自噬体在退化的轴突末端积聚的生物学意义是什么？一个与保守自噬功能相一致的假设是，自噬的诱导包括自噬小体的积累，是重塑局部轴突结构以促进再生的适应性反应(马修斯和莱斯曼，1972年).

脚注

这项工作得到了国立卫生研究院RNS055683A（Z.Y.）、RR00862（B.T.C.）、CA89810和RR022220（B.T.C.M.P.R.）的支持，以及GM062427号（M.P.R）和霍华德·休斯医学研究所（N.H.）。我们感谢X.Li、W.Lee和K.Yao在细胞培养方面的帮助，R.Williams在制作GFP抗体方面的帮助以及生物成像资源中心的A.North、H.Shio和D.Elreda在显微镜方面的帮助。我们感谢田中博士和小松先生为我们提供的Atg7−/−MEF细胞。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会