Doa1是一个拥有新型泛素结合域的Cdc48适配器

基因中断、截断和点突变。

野生型MHY501和DBY469及突变型DBY1247(cdc48-1型)酵母菌株用于所有删除和截断(31,41). 染色体拷贝的缺失和截断DOA1公司使用Longtine等人描述的质粒和技术创建(2,27). 简言之，合成的PCR引物与感兴趣的基因具有5′末端同源性，与所需的Longtine载体具有3′同源性。PCR产物用氯化锂法转化，转化子用选择性琼脂平板分离并用PCR验证。DOA1公司使用QuikChange定点突变试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳），通过基于PCR-的定点突变创建点突变。使用基因特异性引物扩增野生型Doa1和F417D/F434D点突变，以及色氨酸选择标记，以转化为doa1Δ酵母。这创造了在内源性Doa1启动子下表达野生型标记Doa1或点突变型标记Doal1的酵母菌株。所有使用的引物序列可根据要求提供。

质粒构建。

所有克隆程序均采用标准分子生物学技术。HisFlag-Doa1的细菌表达载体^Cterm公司和HisFlag-Doa1^{普林斯顿大学图书馆}通过PCR扩增DOA1公司以酵母基因组DNA为模板，分别编码氨基酸288至715和453至715的基因序列。分别用NdeI和HindIII消化这些PCR产物，并连接到pRSET-B的NdeI与HindIII位点（Invitrogen，Carlsbad，CA）。连接到NdeI位点将删除pRSET-B载体编码的表位标签。六组氨酸和Flag表位标签编码在正向引物内。HisFlag-Doa1的细菌表达载体^WD40型通过PCR扩增DOA1公司使用酵母基因组DNA作为模板编码氨基酸1至298的基因序列。该PCR产物用NheI和XhoI消化，并连接到pRSET-B的NheI与XhoI位点。Flag表位标签编码在正向引物中。连接到NheI位点后，将PCR产物直接插入pRSET-B编码的六组氨酸标签后CDC48型以酵母基因组DNA为模板进行基因序列测定。该PCR产物用NdeI和SacI消化，并连接到pRSET-B（Invitrogen，Carlsbad，CA）的NdeI和SacI位点。连接到NdeI位点将删除pRSET-B载体编码的表位标签。六组氨酸表位标签编码在正向引物中。通过两步连接构建血凝素（HA）标记的Doa1-PLAA嵌合体的酵母表达载体。首先，WD40结构域（氨基酸1到298）编码序列DOA1从酵母基因组DNA中扩增基因，用EcoRI和SacI消化，并连接到pYEPGAP的EcoRI和Sac I位点以生成pYEPAAP-DOA1^WD40型其次，从pBS-PLAA中扩增人类PLAA基因的C末端结构域（氨基酸311到795）编码序列，用SacI和XhoI消化，并连接到pYEPGAP-DOA1的SacI位点和Xho1位点^WD40型N末端HA表位编码在正向引物中。pBS-PLAA和pYEPGAP载体如前所述(4,6). 通过PCR扩增HA-taged Doa1的酵母表达载体DOA1公司以酵母基因组DNA为模板进行基因序列测定。该PCR产物用SacI和XhoI消化，并连接到pYEPGAP的SacI位点和XhoI位点。HA表位标签编码在正向引物中。

泛素和Cdc48结合实验。

如前所述，合成了对照、单泛素和29键四泛素类似物-脑葡萄糖树脂(38). 为了通过全细胞酵母裂解物中Doa1截短物分析泛素结合，300μg酵母全细胞裂解物（150 mM NaCl，50 mM Tris，pH 7.4，1 mM二硫苏糖醇，完整蛋白酶抑制剂，0.05%Triton X-100）与100μl泛素树脂（8 mg/ml泛素）或对照树脂在4°C下孵育3 h，洗涤（三次）用裂解缓冲液，在1.5×十二烷基硫酸钠（SDS）负载缓冲液中煮沸洗脱。为了通过纯化、重组Doa1分析泛素结合，将1μg Doa1与泛素或对照树脂在4°C下孵育3 h，并如上所述进行洗涤和洗脱。为了使用纯化的重组蛋白分析Doa1和Cdc48的直接相互作用，将0.5μg His-Cdc48与1μg HisFlag-Doa1、1μg牛血清白蛋白（BSA）或ATP（5 mM ATP与20 mM MgCl预孵育₂)在4℃下培养10分钟，然后在4℃与Flag树脂（如上所述）培养30分钟。HisFlag-Doa1载体如前所述(14). 为了分析Doa1对Cdc48单泛素Sepharose的补充作用，将0.5μg Cdc48与1μg Doa1、1μg BSA或ATP（5 mM ATP与20 mM MgCl₂)在4℃下培养10分钟，然后在4℃与泛素树脂（如上）培养30分钟。

泛素水平和药物敏感性的测定。

酵母培养物生长到晚期对数阶段（600 nm[OD下的光密度₆₀₀]1.5）在30°C的最低合成葡萄糖（SD）培养基中。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）之前，样品通过光密度归一化并在SDS加载缓冲液中煮沸。通过使用Ponceau S蛋白染色和/或使用PGK抗体对所得硝化纤维膜进行染色，验证了负载相等。将硝化纤维素膜在蒸馏去离子水中煮沸10分钟，然后进行封闭。对于药物敏感性分析，酵母培养物培养至OD₆₀₀在含有或不含有卡纳凡尼（0.6μg/ml）或茴香霉素（20μg/ml。用于测定泛素过度表达对药物敏感性的影响的酵母泛素表达载体如前所述(11)。

泛素结合是Doa1函数所必需的。

删除DOA1或其功能的破坏已知会导致酵母中单和多泛素的耗竭（图。​（图2A）2安培)(20). 删除DOA1公司也会引起对几种压力的敏感性，包括蛋白质的错误折叠和翻译抑制，如分别用卡纳凡尼和茴香霉素处理酵母所示（图。​（图2B，2B型,doa1Δ正向量与DOA1公司加向量）。泛素的过度表达恢复了野生型生长，表明这些表型是由泛素缺乏引起的（图。​（图2B，2B型,doa1Δ正向量与doa1Δ加上UBI）。为了确定Doa1的泛素结合对其功能是否必要，产生了替代染色体的酵母菌株DOA1公司表达Flag-Doa1或Flag-Doa1的基因发生改变的基因（F417D，F434D）。表达Flag-Doa1（F417D，F434D）的酵母具有泛素缺失（图。​（图2C，2摄氏度车道2与车道1）和部分药物敏感性（图。​（图2D，二维与表达Flag-DOA1的酵母相比，Flag-DOA1-FD与Flag-DOO1）表型，证实泛素结合域至少在一定程度上是DOA1功能所必需的。

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图2。

Doa1与泛素结合是维持泛素稳态功能所必需的。（A） 来自野生型和doa1Δ使用泛素抗体对生长在SD培养基上的酵母菌株进行单泛素和高分子量泛素结合物的免疫化学分析。（B） 野生型系列稀释液(DOA1公司)和doa1Δ用空载体或泛素表达载体（UBI）转化酵母，测定泛素过度表达对卡那凡尼和茴香霉素敏感性的影响。在规定的葡萄糖培养基（对照）上生长显示出相等的负荷。（C） 对生长在SD培养基上的表达Flag-tagged野生型Doa1（Flag-Doa1）或Doma1（F417D，F434D）（Flag-Doa1-FD）的全细胞裂解物进行泛素免疫化学分析，以确定PFU域突变对体内Doa1功能的影响（通过单泛素水平测量）。（D） Flag-Doa1-的连续稀释，doa1Δ-和Flag-Doa1-FD表达酵母菌株用于通过卡那凡尼和茴香霉素敏感性测定PFU突变对体内Doa1功能的影响。在规定的葡萄糖培养基（对照）上的生长显示出相等的负荷。

人类PLAA结合泛素，是Doa1的功能同源物。

最近，DOA1公司被证明是对其中一个同源物的缺失的补充，LUB1（卢布1），英寸S.pombe公司(33). 我们感兴趣的是确定PLAA家族在人类中是否具有功能保守性。为此，我们试图在酿酒酵母然而，与Doa1相比，全长人类蛋白的表达非常低，其表达导致轻微的生长缺陷（数据未显示）。由于这些表型可能是由于PLAA的一个结构域的缺陷结合或错误折叠造成的，我们设计了一种HA-标记的嵌合蛋白，该嵌合蛋白由Doa1的WD40结构域与人类PLAA的C末端融合而成，包括假定的PFU和PUL结构域（图。​（图3A，3A级，原理图）。HA-Doa1-PLAA嵌合体表达于doa1Δ酵母的水平与用相同载体表达的HA-Doa1相当（图。​（图3A，3A级，Western blot），不会导致任何明显的生长缺陷（数据未显示）。与HA-Doa1一样，HA-Doa1-PLAA嵌合体与单泛素和29键四泛素类似物结合（图。​（图3B，第3页表明PFU结构域是一个保守的泛素结合结构域（注意Doa1的WD40结构域在这些条件下不与泛素结合）[图。​[图1A，1安培，Doa1（1-282）]。为了支持这一发现，我们观察到，在全细胞提取物中，小鼠PLAA也与单泛素结合（未发表的结果）。此外，HA-Doa1-PLAA嵌合体在doa1Δ酵母导致泛素缺失表型的互补（图。​（图3C，3C公司第4车道与第2车道）和药物敏感性表型（图。​（图3D，三维,doa1Δ加上HA-chimera与doa1Δ加向量）。

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图3。

人类PLAA C末端结构域的功能是保守的。（A） 上图：描绘酵母Doa1 WD40结构域和人类PLAA C末端结构域嵌合体的示意图。底部：酵母全细胞裂解物中HA-Doa1和HA-Doa1-PLAA嵌合体的相对大小和表达水平。使用HA表位抗体对这两种蛋白质进行免疫化学检测。（B） 将表达HA标记的Doa1-PLAA的酵母菌株的全细胞裂解液与单泛素、29-联四泛素类似物或对照-乙脑进行培养。使用HA表位抗体免疫化学检测负载、结合和未结合Doa1-PLAA。B、 绑定；U、 未绑定。（C） 野生型亲本（WT）和doa1Δ使用泛素抗体对用空载体、HA-DOA1或HA-DOA1-PLAA（嵌合体）转化的细胞株进行单泛素和高分子量泛素结合物的免疫化学分析。（D） 野生型亲本的系列稀释液(DOA1公司+向量）和doa1Δ用空载体转换细胞系(doa1Δ+矢量），HA-DOA1(doa1Δ+HA-DOA1）或HA-DOA1-PLAA(doa1Δ+HA-chimera）用于证明HA-Doa1-PLAA补体doa1Δ对卡那凡尼和茴香霉素的敏感性。在规定的葡萄糖培养基（对照）上生长显示出相等的负荷。

Doa1直接与Cdc48相互作用，并招募Cdc48加入泛素。

几个小组已经证明，Doa1和Cdc48通过使用酵母双杂交分析或亲和色谱等间接分析相互作用(8,13,14,33,40). 我们通过Ni证实了酵母中这些蛋白质之间的相互作用²⁺表达HisFlag-Doa1的酵母全细胞提取物的亲和树脂层析，然后对产生的切除蛋白带进行MALDI质谱分析（图。​（图4A，4A级，车道3）。鉴于Cdc48的各种细胞功能似乎是通过其与其他泛素结合蛋白（例如Shp1和Ufd1/Npl4）的直接相互作用来介导的，我们研究了Doa1和Cdc48之间是否存在直接的物理相互作用。为此，重组HisFlag-Doa1和His-Cdc48分别在大肠杆菌并使用镍进行净化²⁺亲和树脂色谱法（数据未显示）。重组HisFlag-Doa1与抗Flag抗体的免疫沉淀以不依赖于ATP存在的方式共同沉淀重组His-Cdc48（图。​（图4B，4B类，泳道4和6相对于泳道2），表明Doa1不是简单地充当Cdc48的底物。这种相互作用似乎是特定的，因为BSA不竞争这种相互作用（图。​（图4B，4B类，车道8与车道4或6）。负责与Cdc48相互作用的域似乎位于Doa1的C末端域，因为His-Cdc48与HisFlag-Doa1共免疫沉淀^Cterm公司但不是HisFlag-Doa1^WD40型（图。​（图4C，4摄氏度，车道8与车道6和2）。我们进一步将这种结合作用定位于Doa1的C末端之前预测的球状结构域，称为PUL结构域（参见讨论）（图。​（图4C，4摄氏度，车道10与车道4和2）(19)。

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图4。

Cdc48通过与Doa1的C末端PUL结构域直接相互作用被招募为泛素。（A） 野生型亲本（WT）或doa1Δ对表达HisFlag-Doa1的酵母进行Ni处理²⁺琼脂糖亲和层析。洗脱后的蛋白质通过SDS-PAGE分离，通过Sypro-Ruby染色进行可视化，并通过质谱进行鉴定。箭头表示两种最显著的蛋白质，Doa1和Cdc48。（B） 使用针对Flag表位的抗体来联合免疫沉淀纯化物、重组His-Cdc48（在有或无纯化、重组HisFlag-Doa1、BSA和/或ATP的情况下）。使用His抗体免疫化学检测负载、结合和未结合的Cdc48和Doa1₆表位。（C） 使用针对Flag表位的抗体联合免疫沉淀纯化、重组His-Cdc48（存在或不存在纯化的重组His-Flag标记全长Doa1（HisFlag-Doa1）、WD40结构域（HisFlag-Doa2））^WD40型)，C端域（HisFlag-Doa1^Cterm公司)，或PUL域（HisFlag-Doa1^{普林斯顿大学图书馆}). 该示意图描述了PUL域在Doa1内的位置。使用His抗体免疫化学检测负载、结合和未结合的Cdc48和Doa1₆表位。星号表示对Flag抗体重链和轻链的弱交叉反应。（D） 纯化的重组His-Cdc48和HisFlag-Doa1分别或联合培养，有或无ATP，并分析其与单泛素-Sepharose的结合。使用His抗体免疫化学检测负载、结合和未结合的Cdc48和Doa1₆表位。五十、 载荷；B、 绑定；U、 未绑定。

接下来，我们开始确定Doa1和Cdc48之间的直接相互作用是否足以招募Cdc48成为泛素。研究表明，Cdc48本身可以与泛素相互作用；然而，特异性泛素结合辅因子的存在增强了这种相互作用(37,39,48,49). 在我们的实验条件下，我们没有观察到Cdc48单独与泛素-葡聚糖结合（图。​（图4D，4D（四维），车道2）。然而，当Doa1被添加到Cdc48中时，Cdc48与Doa1一起存在于泛素结合部分，这表明Doa1将Cdc48招募为泛素（图。​（图4D，4D（四维），车道6与车道2）。与Doa1-Cdc48相互作用一样，Doa1介导的Cdc48向泛素的募集与ATP的存在无关（图。​（图4D，4D（四维），车道6与车道8）。

我们感谢威尔金森实验室的成员批判性阅读手稿，感谢Michel Ghislain（鲁汶天主教大学）对HisFlag-Doa1构建物的批判性解读，感谢Arun Seth（多伦多大学）对人类PLAA克隆物的批改，感谢David Botstein（斯坦福大学医学院）对DBY469和DBY1247酵母细胞系的批改，Mark Hochstrasser（耶鲁大学）负责MHY501酵母细胞系，Dan Finley（哈佛大学）负责泛素表达载体，Judith Fridovich-Keil（埃默里大学医学院）负责pYEPGAP载体，Mark Longtine（俄克拉荷马州立大学）负责基因破坏载体。

这项工作得到了美国心脏协会博士后奖学金和NIH拨款R01-GM30308的支持。