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EMBO J。2006年1月11日；25(1): 174–183.
2005年12月8日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7600905
预防性维修识别码：下午1356348
PMID：16341090

Nfs1相互作用蛋白Isd11在线粒体Fe/S簇生物发生中起着重要作用

亚历山大·亚当,1,* 卡斯滕·博恩霍夫（Carsten Bornhövd）,1 霍尔格·普罗基什,2 沃尔特·诺伊珀特,1和Kai地狱1,一
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补充资料

摘要

铁/硫（Fe/S）簇的形成、蛋白质移位和蛋白质折叠是酿酒酵母在一种系统化方法中，我们鉴定了线粒体基质的一种新的必需蛋白，该蛋白在酵母和人类中高度保守，我们称之为Isd11。Isd11的耗尽导致Fe/S蛋白乌头酸酶和Rieske蛋白的水平显著降低，乌头酸酸酶和琥珀酸脱氢酶的酶活性显著降低。在没有Isd11的情况下，铁并入Fe/S蛋白Leu1和包含线粒体铁氧还蛋白Yah1完整形式的Fe/S簇的形成受到抑制。这强烈表明Isd11是Fe/S蛋白质组装所必需的。我们发现Isd11与Nfs1形成稳定的复合物，Nfs1是用于Fe/S簇组装的线粒体机制的半胱氨酸脱硫酶。在没有Isd11的情况下，Nfs1容易聚合。我们认为Isd11与Nfs1在Fe/S蛋白生物生成的早期阶段共同作用。

关键词：半胱氨酸脱硫酶，铁/硫簇形成，铁/S蛋白，Isd11，线粒体

介绍

约6600个开放阅读框（ORF）的大规模缺失研究和单基因分析酿酒酵母基因组已经鉴定出其中约1020个（17%）对细胞活力至关重要。这种生物体的线粒体由酵母中约700–900种不同的蛋白质组成；然而，只描述了数量相对较少的必需线粒体蛋白质(重新加热等, 2003;西克曼等, 2003;普罗基什等, 2004;Reichert和Neupert，2004年). 后者主要参与线粒体的三个过程：蛋白质移位、蛋白质折叠/去折叠和铁/硫（Fe/S）蛋白质的生物生成。

易位机制的基本蛋白质在蛋白质进入和穿过线粒体膜的过程中起作用。这些蛋白质中的大多数是外膜（TOM和TOB/SAM复合物）和内膜、TIM23和TIM22转位酶的成分(Neupert和Brunner，2002年;Endo公司等, 2003;帕申等, 2003;科勒，2004年;重新加热等, 2004). 第二类必需的线粒体蛋白质由Hsp70和Hsp60伴侣系统的成分组成，它们调节线粒体基质中蛋白质的折叠和去折叠(程等, 1989;哈特尔，1996年;Voos和Rottgers，2002年). 第三组必需的线粒体蛋白质是Fe/S蛋白质生物生成所必需的(克雷格等, 1999;里尔和基斯帕，2000年). Fe/S簇作为辅因子存在于多种线粒体、细胞溶质和核蛋白中，对许多电子传递过程和酶反应至关重要(克雷格等, 1999;Lill和Muhlenhoff，2005年). 最近的研究表明，酵母中所有细胞Fe/S蛋白的成熟取决于一组高度保守的线粒体蛋白的功能，即铁/硫簇（ISC）组装机制(基斯帕语等, 1999;锂等, 2001;格伯等, 2004). 线粒体ISC组装机制的核心参与者是半胱氨酸脱硫酶Nfs1和蛋白质Isu1和Isu2(应变等, 1998;加兰德等, 1999;基斯帕语等, 1999;锂等, 1999;席尔克等, 1999;格伯等, 2004). 删除NFS1型以及双重删除ISU1号机组和智能开关2对酵母细胞是致命的(锂等, 1999;席尔克等, 1999). 与相关的细菌半胱氨酸脱硫酶NifS、IscS和SufS一样，Nfs1也是Fe/S蛋白质生物生成的硫供体(郑等, 1993;施瓦茨等, 2000;卢瓦索等, 2003;穆伦霍夫等, 2004). 它将硫输送到Isu蛋白，Isu蛋白作为形成Fe/S簇的支架(穆伦霍夫等, 2003). 该过程所需的其他成分包括一个电子传递系统，该系统由铁氧还蛋白还原酶Arh1和铁氧还毒素Yah1以及酵母frataxin同系物（Yfh1）组成，该同系物有助于将亚铁传递到支架蛋白(巴布科克等, 1997;兰格等, 2000;锂等, 2001;格伯等, 2003;Yoon和Cowan，2003年). 其他组分，如伴侣蛋白Ssq1、其必需的耳蜗酮Jac1和谷胱甘肽Grx5，似乎在含铁/硫簇蛋白的生物发生的后期发挥作用(应变等, 1998;基姆等, 2001;卢茨等, 2001;Voisine公司等, 2001;Craig和Marszalek，2002年;罗德里格斯-曼扎内奎等, 2002;杜特凯维奇等, 2003). 除了ISC组装机器的蛋白质外，细胞质Fe/S簇的生物生成还需要另外两种线粒体蛋白质，即ATP-结合盒转运蛋白Atm1和巯基氧化酶Erv1(Lill和Muhlenhoff，2005年). 尽管我们对ISC装配机械的了解有了相当大的增长，但对其分子机制和组件之间的相互作用仍知之甚少。

在这里，我们描述了Isd11的鉴定，它是铁/硫蛋白生物生成所需的ISC组装机制的一个新的基本组成部分。Isd11与Nfs1形成稳定的络合物。我们认为，Isd11对于Nfs1实现其硫转移功能以形成Fe/S团簇至关重要。

结果

Isd11蛋白存在于整个真核生物界的生物体中

ORF YER048w-a的酿酒酵母据报道，它对生存能力至关重要，编码一种分子量为11kDa的线粒体蛋白，进一步称为Isd11（ISC生物生成脱硫酶相互作用蛋白）。同系物国际标准D11在所有被分析的真核生物物种的基因组中发现，如真菌(葡萄裂殖酵母,粗糙脉孢菌)和高等生物（例如。黑腹果蝇和智人) (图1A). 序列保守性并不局限于蛋白质的某些片段。Isd11可归入LYR家族（PF05347），其特征是存在三个氨基酸残基片段LYR/K(贝特曼等, 2004). 该家族成员还包括各种生物体呼吸链复合体I的亚单位。包括Isd11蛋白和复合物I的相关亚单位的枝序图如下所示补充数据(补充图S1). Isd11和复杂I亚基蛋白之间的可能进化关系有待进一步研究。

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Isd11是线粒体基质的一种蛋白质(A类)不同物种Isd11蛋白的序列比对。使用ClustalX（1.8）生成路线。至少四种对齐蛋白质中相同的氨基酸残基以黑色显示，类似残基以灰色显示：酿酒酵母(Sc公司),S.pombe公司(服务提供商),N.克拉萨(编号),智人(Hs公司)和D.黑腹果蝇(Dm公司). (B类)Isd11位于线粒体中。酵母细胞被亚分馏，等量的蛋白质被SDS–PAGE处理，并用Isd11、胞浆蛋白（Bmh2）、ER蛋白（Erp1）和线粒体蛋白（Mge1）抗体进行免疫修饰。(C类)Isd11位于线粒体基质中。分离的线粒体、通过渗透休克制备的线粒体和Triton溶解的线粒体用蛋白酶K（PK）或不用蛋白酶K处理。对线粒体进行碳酸盐萃取，分离上清液（S）和颗粒（P）组分。样品通过SDS-PAGE分析，并使用针对所示蛋白的抗体进行免疫修饰。(D类)Isd11附着在内膜上。将WT线粒体重新悬浮在含有不同浓度KCl的缓冲液中，并通过超声波打开。通过离心分离含有可溶性蛋白质的上清液级分（Sup）和膜级分。通过TCA沉淀法收集上清液部分中的蛋白质。将Laemmli缓冲液添加到这两个组分中，并进行SDS-PAGE和免疫修饰，以获得针对Isd11、线粒体脱硫酶Nfs1、内膜蛋白（ADP/ATP载体，Aac2）和基质蛋白（Mge1）的抗体。(E类)Isd11以膜电位依赖的方式导入分离的线粒体。含网织红细胞裂解物35在存在或不存在膜电位ΔΨ的情况下，将S标记的Isd11与线粒体孵育。导入后，如图所示，在等渗或低渗肿胀（Sw）条件下分离线粒体并用PK或不用PK处理。样品通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。50%输入，每条车道使用的裂解液量的50%。

Isd11是线粒体基质空间的膜相关蛋白

酵母细胞的亚细胞分馏证实了Isd11的线粒体位置，之前在全基因组筛查中使用GFP标记版本和线粒体蛋白质组的综合研究中对其进行了分析(嗯？等, 2003;普罗基什等, 2004) (图1B). 为了分析Isd11的亚线粒体位置，制备了线粒体。线粒体在低渗培养基中培养，使外膜破裂，从而获得线粒体。用蛋白酶K（PK）处理线粒体和有丝分裂体(图1C). 无论是在线粒体还是在有丝分裂体中，蛋白质都没有被降解。另一方面，在通过添加Triton X-100打开内膜时，蛋白质被添加的蛋白酶降解。当线粒体在pH 11.5下用碳酸钠处理时，Isd11在上清液中大量回收(图1C). 这表明Isd11不是一种完整的膜蛋白。然而，当线粒体在低浓度盐存在下超声处理后分离膜和可溶性物质时，Isd11存在于膜组分中(图1D). 总之，Isd11是与内膜相关的线粒体基质空间的蛋白质。这种拓扑结构与蛋白质的亲水性相一致，没有可识别的预测跨膜片段。

Isd11的N末端序列没有显示特征性的可切割N末端线粒体靶向序列。大多数Isd11同源物在起始蛋氨酸和保守LYR基序之间只有两个带正电荷的残基。因此，我们研究了在网织红细胞裂解液中合成的Isd11前蛋白导入分离的线粒体。Isd11以ΔΨ依赖的方式导入线粒体(图1E). 导入后，它和内源性蛋白一样，存在于有丝分裂体中的蛋白酶保护位置。前体形式的大小与输入蛋白质的大小无法区分。显然，前体中不存在可切割的前序列，但N末端序列足以将蛋白质导入线粒体基质。

Isd11下调导致细胞生长完全停止

为了研究Isd11的功能，我们构建了一株酵母菌株（GAL10-Isd11），其中该基因受镀锌10启动子，允许Isd11的调节表达。在含有半乳糖或葡萄糖的YP-agar平板上测试该菌株的生长。在葡萄糖存在的情况下，细胞停止生长(图2A). 在液体培养基中培养细胞时也进行了类似的观察。GAL10-ISD11细胞和野生型（WT）细胞在含有半乳糖的培养基中生长，然后转移到含有葡萄糖的培养基(图2B). 与WT细胞相比，Isd11缺失的细胞在转移到含葡萄糖培养基后15 h的生长速度显著减慢，并且在转移后25 h几乎停止生长(图2B). 这些结果证实了ISD11系统基因(贾维尔等, 2002).

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酵母细胞中Isd11的下调影响细胞生长，但不影响线粒体导入前蛋白的能力。(A类)携带国际标准D11受控制的基因镀锌10启动子和WT细胞在富含半乳糖（YP-Gal）或葡萄糖（YP-D）的培养基上培养2轮。(B类)GAL10-ISD11细胞和WT细胞首先在半乳糖上生长，然后在含有葡萄糖的培养基中培养指定时间。在时间零点，单元格编号设置为1。(C类)线粒体前体蛋白的进口不需要Isd11。TIM23复合途径（pSu9（1-69）DHFR）和TIM22复合途径（AAC）的所示放射性标记前体蛋白在不同时间段导入WT线粒体和Isd11（Isd11↓）缺失的线粒体。再次分离线粒体，进行PK或不进行PK治疗，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。线粒体PK处理后，对成熟形式的蛋白质进行量化。在最长时间点输入WT线粒体的蛋白质设置为100%（对照）。p、 前驱体形式；m、 成熟形式。

Isd11缺失的细胞线粒体前蛋白的输入不受影响

由于线粒体的大多数基本蛋白质在蛋白质移位中起作用，我们分析了线粒体前蛋白从Isd11缺失细胞（Isd11↓）和WT细胞（作为对照）导入分离线粒体的情况。鉴于Isd11的位置，使用TIM23易位途径的前蛋白，如F亚基9的前69个氨基酸残基的融合蛋白1F类o（o）-ATP酶来自N.克拉萨测试了小鼠DHFR（pSu9（1-69）DHFR）以及TIM22转座子底物，如ATP/ADP载体（AAC）。在缺乏Isd11的细胞中未观察到明显的导入缺陷(图2C). 因此，Isd11似乎在蛋白质向线粒体的转运中不起作用，细胞生长的停止不是由蛋白质输入机制的缺陷引起的。

Isd11是Fe/S蛋白质生物生成所必需的

半乳糖转化为葡萄糖后12 h，在GAL10-Isd11菌株的细胞线粒体中几乎检测不到Isd11(图3A). 在换班后18和24小时，Isd11不再被检测到。在从缺乏Isd11（Isd11↓）的细胞中分离出的线粒体中测定了12、18和24小时内各种蛋白质的稳态水平。乌头糖和Rieske FeS是两种含有Fe/S簇的蛋白质，在Isd11缺乏18小时后显示出强烈的降低水平，在Isd 11下调24小时后几乎无法检测到。相比之下，其他线粒体蛋白的水平，如外膜蛋白Tom40、内膜易位成分Tim23和基质蛋白Mge1没有改变。因此，Isd11的缺失似乎特别影响Fe/S蛋白质。

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Isd11的下调影响含FeS簇蛋白的水平和活性。(A类)将GAL10-ISD11细胞转移至含葡萄糖培养基后，在30°C下培养12、18和24小时。从这些细胞和WT细胞中分离出的线粒体（100μg）的蛋白质水平通过SDS-PAGE和针对所示蛋白质的抗体的免疫修饰进行分析。(B类)在从WT细胞和Isd11（Isd11↓）下调的细胞中分离出的线粒体中测量指定时间段内SDH和乌头糖（Aco）的活性。作为标准，测量了含有非FeS簇的蛋白质MDH。计算顺乌头酸酶和MDH或SDH和MDH的活性比值，并用WT细胞中比值的百分比表示。(C类)体内在没有Isd11的情况下，细胞质Leu1蛋白的Fe/S簇的组装受到抑制。GAL-Isd11细胞在含有葡萄糖的培养基中生长18 h，从而耗尽Isd11。这些细胞和WT细胞与55制备细胞裂解物，并用抗Leu1抗体进行免疫沉淀。合并55液体闪烁计数法测定Leu1中的铁。插图显示了这些细胞裂解物中存在的Leu1和Isd11的免疫染色。(D类)holoYah1的形成依赖于Isd11。这个35将Yah1的S标记前体蛋白导入WT和Isd11↓细胞分离的线粒体中，在25°C下保持10分钟。通过添加安定霉素停止输入反应，并在指定的时间段（“阶段”）内进一步培养。取等分样品，用PK处理去除非进口前体蛋白。样品通过天然凝胶电泳和放射自显影术进行分析。在指定的时间点，对apo-和holoYah1的量进行量化，并将它们的比率表示为两种形式总和（总计）的holoYah百分比。(E类)测定从WT和Isd11下调细胞分离的100μg线粒体的铁含量。

此外，我们测量了Isd11缺失细胞中乌头糖和琥珀酸脱氢酶（SDH）的酶活性。将活性与非Fe/S蛋白、苹果酸脱氢酶（MDH）的活性进行标准化，并与WT细胞中的相对活性进行比较。在缺乏Isd11的细胞中观察到顺乌头酸酶和SDH活性的强烈降低(图3B). 仅在12小时内下调Isd11，活动显著减少至约40-60%。此时，Fe/S蛋白质的内源性蛋白质水平没有显著改变，这表明Isd11的耗竭导致Fe/S酶活性形式的减少。这表明Isd11对功能性Fe/S蛋白的形成或稳定性至关重要。

我们学习了体内和在欧根奈罗在缺乏Isd11的细胞中，Fe/S簇并入到载脂蛋白中是否受到影响。首先，我们采用了里尔及其同事开发的一种检测方法，该方法可以确定放射性物质的摄取55亮氨酸生物合成途径的细胞质Fe/S蛋白Leu1的Fe/S簇中的铁(基斯帕语等, 1999). 细胞在无铁培养基中生长后，在含有放射性物质的最小培养基中培养55铁。制备细胞裂解物，并用针对Leu1的特异性抗体沉淀Leu1。液体闪烁计数法测定了Leu1的Fe/S簇合放射性。与WT电池相比55在缺乏Isd11的细胞中检测到加入Leu1的铁，尽管这些细胞中也存在类似水平的Leu1蛋白(图3C). 这表明缺乏Isd11的细胞缺乏Leu1的Fe/S簇，并表明Fe/S蛋白缺乏酶活性是由于缺乏簇。接下来，我们分析了在WT细胞和Isd11缺失细胞的线粒体中，Fe/S簇并入线粒体铁氧还蛋白Yah1的脱辅基。合成了Yah1蛋白在体外在以下人员在场的情况下35S-蛋氨酸与分离的线粒体孵育。通过添加缬霉素以耗尽膜电位来停止导入反应，并进一步孵育样品（“阶段”）。在指定的时间点取出等分样品，用PK消化非进口物质，并重新分离线粒体。通过在天然凝胶上分离这些形态并随后进行放射自显影，分析了脱辅基向含铁/硫簇合物的全辅基的转化(图3D，上部面板）。全形类以一个独特的带的形式迁移，并且比无形体的速度快，无形体在天然凝胶中的迁移范围更广(卢茨等, 2001). 在导入反应过程中，WT细胞线粒体中形成的holoYah1比Isd11缺失的线粒体中多(图3D). 导入后的两种形式的比率和指示的追逐次数通过使用荧光成像系统进行量化来确定。与WT线粒体相比，Isd11缺失的线粒体中，脱辅基向Yah1全形的转化受到强烈影响(图3D，下面板）。因此，在没有Isd11的情况下，Fe/S簇合物并入Yah1的脱辅基中受到抑制。总之，获得的结果体内和在欧根奈罗表明由于缺乏Fe/S簇的组装，在缺少Isd11的情况下，Fe/S蛋白质存在缺陷。结果表明，Isd11在含铁硫蛋白完整形式的铁硫簇生物形成的早期阶段是必需的。

鉴于Fe/S簇的形成与铁代谢之间的联系，我们测定了Isd11缺失的线粒体中的铁含量(图3E). 与WT细胞线粒体相比，缺铁24小时后，铁含量增加了约30倍。以前在许多Fe/S蛋白组装途径缺陷的突变细胞中观察到这种线粒体铁积累(巴布科克等, 1997;Foury和Cazzalini，1997年;奈特等, 1998;加兰德等, 1999;基斯帕语等, 1999;锂等, 1999,2001;席尔克等, 1999;兰格等, 2000;基姆等, 2001). 这类突变体在细胞铁稳态方面表现出进一步的缺陷，如细胞质铁水平降低和细胞铁摄取增加(锂等, 1999,2001). 我们的结果表明，Isd11是Fe/S簇生物发生所必需的，它可能在细胞铁稳态中发挥作用。

Isd11与Nfs1形成复合体

为了解决Fe/S蛋白Isd11在生物生成中的哪一步是必需的，我们构建了一株表达Isd11的菌株，该菌株带有C末端七甾烷基标签，并进行了下拉实验。从该菌株和WT菌株分离的线粒体用十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶解，所得提取物用NiNTA琼脂糖珠培养。结合物通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行洗脱和分析。从与含有his-tagged Isd11的提取物孵育的珠子中以特定方式共稀释了大量分子量约为45和14kDa的两种蛋白质(图4A). 与其他一些蛋白质相比，WT菌株的洗脱液中没有这些蛋白质。质谱鉴定45kDa蛋白为ISC机械的线粒体脱硫酶Nfs1，14kDa蛋白质为Isd11。

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Isd11存在于带有Nfs1的复合体中。(A类)Nfs1与His-tagged Isd11的共分离。用DDM溶解WT细胞或表达Isd11的细胞的分离线粒体，并用NiNTA珠培养。结合物通过SDS-PAGE和考马斯染色进行洗脱和分析。通过质谱鉴定Nfs1和Isd11。(B类)Nfs1与Isd11的铜提纯。野生型菌株和携带三重HA标记的Isd11的菌株的线粒体用洋地黄苷溶解。澄清旋转后，将上清液与与蛋白A-Sepharose珠结合的HA标签抗体孵育。收集珠子，清洗并用Laemmli缓冲液洗脱结合蛋白。样品通过SDS-PAGE分析，并用Nfs1和Isd11抗体进行免疫修饰。总的来说，装载了10%的总量和上清液。f、 Nfs1的片段。(C类)Isd11和Nfs1的共免疫沉淀。用DDM溶解WT线粒体。使用针对Nfs1或Isd11的抗体，按照（B）中的方法进行联合免疫沉淀并进行分析。(D类)Isd11和Nfs1在凝胶过滤柱上共分馏。线粒体膜在250 mM KCl存在下通过超声波打开。旋转澄清后，将上清液置于Superose-12凝胶过滤柱中。通过SDS-PAGE和抗Isd11和Nfs1抗体的免疫修饰分析组分。

为了检查Isd11是否与Nfs1形成特定复合物，我们从染色体拷贝中产生了一株表达Isd11的菌株，该菌株带有C末端三重HA-tag。从该菌株和WT中分离出线粒体，并用洋地黄素溶解。线粒体提取物与HA肽抗体共同免疫沉淀。这些抗体耗尽了HA标记的Isd11的线粒体提取物，但没有耗尽WT Isd11(图4B). Nfs1与HA标记的Isd11一起从细胞提取物中共沉淀，在沉淀的上清液部分中未检测到。这种相互作用显然是特异性的，因为Nfs1不是使用HA肽抗体从WT细胞的线粒体提取物中沉淀出来的。在这些实验中，Nfs1的部分片段呈现为稍小的片段。该片段是通过线粒体制剂中存在的蛋白酶活性用洗涤剂分解线粒体后发生的蛋白水解事件生成的。当线粒体裂解物被处理更长的时间时，这种降解是明显的，并且可以通过添加多种蛋白酶抑制剂的混合物来部分控制。以前曾观察到这种现象(格伯等, 2003). 当WT细胞线粒体提取物与Isd11和Nfs1抗体共同免疫沉淀时，Isd11与Nfs1和反之亦然(图4C). 在共沉淀的非结合部分中未检测到Nfs1和Isd11（数据未显示）。因此，Nfs1似乎与Isd11处于稳定的复合体中。

我们通过凝胶过滤进一步分析了Isd11和Nfs1的表观天然分子量。将WT细胞的线粒体重新悬浮在含有250 mM KCl的缓冲液中，并通过超声波打开线粒体膜。旋转澄清后，上清液在Superose-12柱上进行凝胶过滤。Nfs1和Isd11在与大约180–200 kDa的分子质量相对应的相同分数中从色谱柱中洗脱(图4D). 少量Nfs1以单体形式存在，这可能表明Nfs1•Isd11复合物不稳定，或存在少量的Nfs1池，可用于与其他蛋白质的相互作用。总之，结果表明大多数Isd11和Nfs1形成高分子量络合物。我们能够证明这一点35放射性标记半胱氨酸的S在完整的线粒体中并入Nfs1，Nfs1与Isd11复杂（K Hell，未发表数据）。这表明，作为硫转移反应的一个步骤，Nfs1和Isd11的络合物在过硫化物形成中很活跃体内.

在没有Isd11的情况下，Nfs1具有脱硫酶活性，但容易聚集

我们分析了Nfs1在存在和不存在其复杂伙伴Isd11时的特性。在没有Isd11的情况下，通过免疫修饰测定的Nfs1内源性水平与WT细胞线粒体中的水平相比略有降低(图5A). 为了测试Nfs1的稳定性，将WT细胞和缺乏Isd11的细胞的线粒体在冰上和37°C下孵育。将其溶解在Triton X-100中，通过离心将不溶性物质从可溶性物质中分离出来。通过SDS-PAGE和免疫修饰分析组分。随着Isd11的线粒体耗尽，但WT线粒体没有，Nfs1主要出现在37°C处理后含有不溶性物质的部分中。相反，在冰上处理不会影响Nfs1的溶解度。Tim16等其他蛋白质即使在37°C下处理后仍保持可溶(图5B). 因此，在没有Isd11的情况下，Nfs1容易形成不溶性的高低聚物聚集体。此外，在线粒体裂解后，Nfs1对缺乏Isd11的内源性蛋白酶的蛋白水解降解更为敏感（数据未显示）。值得注意的是，在低盐高达100 mM的情况下，线粒体超声处理后，WT线粒体的膜部分中存在Nfs1和Isd11（参见图1D). 相反，当Isd11缺失细胞的线粒体被超声打开时，膜部分中发现的Nfs1较少（数据未显示）。因此，在没有Isd11的情况下，Nfs1的膜结合似乎不稳定，这可能会增加Nfs1聚集的趋势。

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Isd11缺失线粒体中的Nfs1具有脱硫酶活性，但容易聚集。(A类)通过SDS-PAGE和免疫修饰分析从Isd11缺失18 h的细胞（Isd11↓）和WT细胞分离的线粒体（25、50、100μg）中Nfs1的蛋白水平。(B类)Nfs1在缺乏Isd11的细胞中聚集。将从WT和Isd11缺失细胞中分离的线粒体在0或37°C下培养20分钟。用0.5%Triton X-100溶解线粒体，并通过离心法造粒聚集材料。用TCA沉淀总组分和上清液组分（Sup）。样品通过SDS-PAGE和免疫修饰进行分析。(C类)在没有Isd11的情况下，Nfs1具有脱硫酶活性。将WT和Isd11↓细胞的线粒体（100μg）用0.2%的DDM裂解，然后在含有5mM DTT和4mM半胱氨酸的缓冲液中在30°C下孵育30分钟。将产生的硫化物转化为亚甲基蓝，在667nm处测量其吸收。通过在不含半胱氨酸的情况下培养线粒体提取物来测定背景活性并减去。脱硫酶活性表示为WT线粒体中的活性百分比。

Nfs1是一种脱硫酶，可从半胱氨酸中提取硫，从而在线粒体中形成Fe/S簇(Lill和Muhlenhoff，2005年). 我们测试了Isd11缺失细胞和WT细胞线粒体提取物中的脱硫酶活性。为此，我们采用了线粒体提取物的分析方法，该方法通过测定半胱氨酸产生的硫化物来测量脱硫酶的活性在体外(穆伦霍夫等, 2004). 在没有Isd11的情况下，硫化物的生成与WT提取物类似(图5C). 因此，在没有Isd11的情况下，Nfs1的脱硫酶活性似乎正常，甚至略有增强。

总之，结果表明Isd11稳定Nfs1，但不需要Nfs1的脱硫酶活性。所提供的数据论证了Isd11在Nfs1脱硫酶反应后的一个步骤中Nfs1水平上的功能。

讨论

我们在这里描述了线粒体基质中一种新蛋白Isd11的鉴定和特性。Isd11分子量约为11kDa，在几乎所有真核生物中高度保守。我们表明，Isd11在铁硫簇的形成中发挥着重要作用，因此对酵母细胞的生存能力至关重要。在缺乏Isd11的细胞中，观察到蛋白质水平和Fe/S蛋白质活性降低，线粒体中铁积累。Fe/S蛋白酶活性的丧失是由于其缺乏Fe/S簇合物。我们证明，在缺乏Isd11的线粒体中，Fe/S簇与线粒体铁氧还蛋白Yah1的apoform的结合显著减少。Isd11的耗尽不仅影响线粒体，也影响细胞质Fe/S蛋白，如Leu1蛋白所示。这是其他参与Fe/S蛋白质组装的线粒体蛋白质的一个众所周知的特征，例如Nfs1、Yah1、Isu1和Isu2(基斯帕语等, 1999;兰格等, 2000;格伯等, 2004).

我们的实验提供了关于Isd11在Fe/S簇合蛋白生物生成中的功能的信息。Isd11是这个过程的早期步骤所必需的。它与半胱氨酸脱硫酶Nfs1紧密结合。在没有Isd11的情况下，Nfs1表现出在WT线粒体中未观察到的聚集趋势。因此，Isd11似乎可以稳定线粒体中的Nfs1。Nfs1从半胱氨酸中提取硫，并将其转移到Isu1/Isu2复合物中以形成Fe/S簇。我们观察到Nfs1能够从半胱氨酸中产生硫化物在体外因此在没有Isd11的情况下仍然具有脱硫酶活性。这与之前一份报告的结果一致，该报告证明了重组Nfs1蛋白的这种活性(穆伦霍夫等, 2004). 然而，体内在Nfs1介导的硫转移过程中，Isd11在Fe/S簇合物形成过程中的作用得到了支持，这是因为在没有Isd11的情况下抑制了Fe/S团合物的形成，并且在Isd11下调的早期点Fe/S蛋白的活性强烈降低。我们确实在完整的线粒体中观察到，作为硫转移反应的一步，Nfs1•Isd11复合物形成过硫化物中间体体内（K Hell，未发布数据）。Isd11可能介导Nfs1与其他蛋白质的组装/相互作用。候选蛋白可能是Isu蛋白，因为Nfs1部分与Isu1相互作用，正如Nfs1作为Isu1/2复合物的硫供体的功能所预期的那样(格伯等, 2003). Nfs1•Isd11复合物的另一个潜在的相互作用伙伴是Yah1，它被认为将电子转移到Nfs1以减少硫，因此可能与Nfs1发生瞬态相互作用。

线粒体中Fe/S簇形成的某些步骤可能发生在内膜的基质侧，因为Isd11和Nfs1大量附着在内膜上。据报道，铁氧还蛋白还原酶Arh1与内膜有关(曼泽拉等, 1998). 因此，Fe/S团簇的形成途径的至少一部分可能位于内膜的基质侧。这种膜定位也可能在调节线粒体和细胞的铁稳态中发挥作用。

ISC组装机制的大多数线粒体蛋白在细菌中都有同源物。这些同源物由操纵子编码，操纵子指定氮氧化（NIF）机制、铁硫簇（ISC）组装机制、硫动员（SUF）机制和CSD系统(郑等, 1998;高桥和德本，2002年;Frazzon和Dean，2003年;外出等, 2004;卢瓦索等, 2005). 在这些操纵子中没有发现Isd11的明显同源物，并且我们在各种NCBI BLAST搜索中无法根据所有可用的细菌序列确定Isd11细菌的同源物(McGinnis和Madden，2004年). 细菌中已报道了与半胱氨酸脱硫酶相互作用的Isu同系物以外的蛋白质。在SUF和CSD系统中，半胱氨酸脱硫酶的活性分别受到蛋白质SufE和CsdE的刺激，这两种蛋白质被认为是硫的受体(卢瓦索等, 2003,2005;外出等, 2003). 由于Isd11缺乏半胱氨酸残基，线粒体系统不太可能以类似的方式发挥作用。虽然不能完全排除功能同源物的存在，但线粒体Nfs1的细菌同源物在没有Isd11同源物的情况下起作用。在拟南芥，部分叶绿体Nfs1在一个600 kDa的大复合体中被发现，表明与其他蛋白质相互作用(叶等, 2005). 其中一些似乎刺激了叶绿体NifS-like半胱氨酸脱硫酶的活性(叶等, 2005).

上述结果表明，Isd11在Nfs1介导的Fe/S蛋白生物生成过程中发挥作用。未来的研究必须阐明Nfs1•Isd11低聚物的结构，以阐明为什么Isd11在该过程中是绝对必要的。

材料和方法

酵母菌株与细胞生长

使用WT菌株YPH499(西科尔斯基和希特，1989年). GAL10-ISD11菌株是根据公布的程序，用含有GAL10启动子的盒替换ISD11编码区上游100 bp的序列产生的(拉方丹和托勒维，1996年). 为了产生具有C-末端七组氨酸标签或三重HA标签的表达Isd11的菌株，根据已发表的方法，通过同源重组将编码标签的核苷酸插入到野生型菌株YPH499的染色体上，在Isd11的编码序列之后(Knop（打结）等, 1999). 为了去除Isd11，在30°C下生长的GAL10-Isd11培养物在指定的时间段内从含有0.5%半乳糖的乳酸培养基转移到含有0.5%葡萄糖的乳酸培养液。对照组WT细胞以相同的方式处理。如前所述分离线粒体(达姆等, 1982).

Isd11–Nfs1复合物的纯化

将来自WT酵母和含有His-tagged Isd11的酵母细胞的线粒体（10 mg）溶解在含有20 mM Tris/HCl、pH 7.4、80 mM KCl、0.5%DDM、20 mM咪唑和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的缓冲液A中，在4°C下保持30 min。澄清旋转速度为10万克将上清液与50μl Ni-NTA琼脂糖珠在4°C下孵育60分钟。然后，在用含有300 mM咪唑的Laemmli缓冲液洗脱之前，用1 ml缓冲液A将珠子清洗三次。样品采用SDS-PAGE分析，考马斯蓝染色。从凝胶中切下蛋白质带并用质谱分析。

凝胶过滤

将WT中的线粒体（1 mg）重新悬浮在含有20 mM Tris/HCl、pH 7.4、250 mM KCl和1 mM PMSF的缓冲液中，并通过超声波打开。澄清后旋转（100 000克，20分钟），将上清液装载在用流动缓冲液（20mM Tris/HCl，pH 7.4，250mM KCl）平衡的Superose-12柱（25ml柱体积，Pharmacia）上。收集500μl体积的馏分，并用三氯乙酸（TCA）沉淀。然后通过SDS-PAGE和免疫修饰对样品进行分析。以下标记蛋白用于校准：牛甲状腺球蛋白（669kDa）、马脾脱铁蛋白（443kDa，酿酒酵母乙醇脱氢酶（150kDa）、牛血清白蛋白（66kDa。

其他方法

以下程序基本上按照出版的方法应用：亚细胞和亚线粒体分离(罗利等, 1994)，线粒体的制备(达姆等, 1982)，将前蛋白导入分离的线粒体(莫克拉尼亚克等, 2003)抗体的亲和纯化(哈洛和莱恩，1988年)MDH活性的测量(恩格拉德和西格尔，1969年)、SDH(罗宾逊等, 1991)，乌头糖(Fansler和Lowenstein，1969年)，脱硫酶活性(穆伦霍夫等, 2004),体内Leu1的标记55铁(基斯帕语等, 1999),在体外铁硫簇合物并入apoYah1的测定(卢茨等, 2001)以及线粒体铁水平的测定(史密斯等, 1984). 线粒体在含有1%DDM或1%洋地黄素的缓冲液（20 mM Tris/HCl，pH 7.4，80 mM KCl，1 mM PMSF）中溶解后进行共免疫沉淀。在聚集试验中，用0.5%Triton X-100在50 mM HEPES、pH 7.4、150 mM KCl和1 mM PMSF（含蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中溶解线粒体。在30 000℃下离心10分钟，分离颗粒和上清液部分克.

补充材料

补充信息

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致谢

我们非常感谢Alexandra Stiegler、Ulrike Gärtner和Marica Malesic提供的出色技术援助。我们感谢罗兰·里尔博士、乌尔里希·穆伦霍夫博士和尤根·乌尔济卡博士的建议，感谢安德烈亚斯·雷切尔博士批判性地阅读了手稿，感谢约翰内斯·赫尔曼博士和托马斯·卢茨博士的讨论和针对Nfs1的抗体。这项工作得到了德国联邦科学院、SFB 594（B3，B13）、德国以色列基金会、德国以色列项目合作DIP F.5.1、德国化学工业基金会和德国国家基因组网络（01GR0411）的资助。

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