传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种在全球家禽业中具有重要经济意义的病原体。IBDV在发育中的B淋巴细胞中特异性复制，导致法氏囊中抗体产生B细胞的前体遭到破坏，从而导致免疫抑制，导致疫苗接种失败，并易受其他感染和疾病的影响(25). 疫苗接种是控制鸡传染性法氏囊病的主要方法。尽管不同抗原类型的IBDV株已被纳入疫苗，但IBDV仍是家禽业的一个主要问题。母体抗体对保护幼雏鸡在生命的关键前几周至关重要，而母体抗体的存在会降低当前IBDV活疫苗的效力。IBDV活疫苗也会导致不同程度的法氏囊萎缩，并可能导致抗原变异病毒的出现(25). 1985年，从德尔马瓦半岛接种疫苗的鸡群中分离出第一株IBDV抗原变异株(40). 随后在美国和其他国家分离出其他变异菌株(17,35,41,42,46). 这些抗原变异株在血清学上与1985年以前最典型的所谓经典分离株不同(25,42,46). 这些变异株缺乏由中和单克隆抗体（MAbs）B69和R63定义的表位，这些抗体是用经典菌株制备的(40,41). 变异病毒感染鸡，即使是母体抗体水平相对较高的鸡，也会造成巨大的经济损失(17,35,42,46). 目前的疫苗显然无法控制IBDV感染，因此有必要开发不会导致变异病毒的替代IBDV疫苗策略。
IBDV是该属的一员禽流感病毒在家里病毒科，其基因组由两段双链RNA组成(25). 较小的片段B编码VP1，这是一种90000分子量的RNA依赖性RNA聚合酶。较大的段A包含两个部分重叠的开放阅读帧（ORF）。第一，较小的ORF编码非结构蛋白VP5；而第二个ORF编码一个前体多聚蛋白，随后被切割成VP2、VP4和VP3。VP2和VP3是IBDV的主要衣壳蛋白，分别占病毒蛋白的51%和40%(25). VP2蛋白已被确定为IBDV的主要宿主保护免疫原，并含有引起中和抗体的主要表位(三,4,16). 发现VP2被动抗体可保护鸡(12,25,44). 人们曾多次尝试将IBDV的结构蛋白表达为控制该病的亚单位疫苗。已经证明，在不同表达系统中表达的重组VP2蛋白对该病具有显著的保护作用(5,37,39,43,45). 然而，由于交付系统的限制，这些努力尚未转化为实际用途(11,21,34,48).
最近开发的负链RNA病毒（NSV）工程反向遗传学系统为表达外源基因提供了一种新方法(9,30). 由于其基因组的模块化性质，很容易将其他基因工程到NSV基因组中。许多含有额外外源基因的重组NSV已经被工程化(6,14,15,27,31,38,47). 研究还表明，NSV可以作为高效的疫苗载体，用于抵抗其他病原体(7,13,29,36). 早期研究表明，重组新城疫病毒（NDV）是一种NSV，可用于表达异源基因(19,22,29).
NDV是该属的一员腮腺炎病毒属在家里副粘病毒科(24,26). NDV基因组是由15186个核苷酸（nt）组成的非片段负链RNA，包含6个基因，序列为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′(10,23). 蛋白质的表达水平从病毒基因组的3′端到5′端依次减弱(24,32). NDV在全世界所有鸟类中引起一种重要的经济疾病(2). 根据病毒株和宿主种类的不同，新城疫可以是临床上不明显的，也可以是高毒性的(2). 目前，世界各地经常使用天然无毒NDV株作为活疫苗。
NDV的一些特性表明，表达另一种禽病原保护性抗原的重组NDV将是一种非常好的家禽多价疫苗。NDV活疫苗广泛用于商业鸡，其有效性和安全性已得到证实。NDV在许多细胞系和胚胎卵子中生长到非常高的滴度，并在体内引发强烈的体液和细胞免疫反应。NDV通过上呼吸道自然感染鸡，并诱导强分泌性免疫球蛋白A（IgA），这是免疫系统中预防粘膜感染的关键成分(2,18). 因此，我们探索了重组NDV作为家禽疫苗载体的潜力。
在本文中，我们描述了一种表达IBDV变异株GLS-5的宿主保护性免疫原VP2的重组NDV株LaSota。重组rLaSota/VP2生长到与亲本病毒相当的水平。VP2基因在胚胎卵中连续传代后仍保持稳定表达。用重组rLaSota/VP2疫苗接种可诱导对NDV和IBDV的强烈体液免疫反应，并在二次免疫后对这两种病毒提供完全保护。这些结果清楚地表明，有可能开发一种商业化的二价重组NDV/IBDV疫苗，对这两种经济上重要的疾病提供保护。
材料和方法
细胞和病毒。
DF1（鸡胚成纤维细胞系）细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中生长。Vero和HEp-2细胞在Eagle的含有10%胎牛血清的最低必需培养基中生长。重组NDV株和野生型NDV株在9天龄的特异性无痘（SPF）鸡胚中生长。用于挑战性研究的高毒力NDV毒株Texas GB最初来自爱荷华州艾姆斯的国家兽医服务实验室。马里兰大学生物技术研究所的Vikram Vakharia善意地提供了野生型和细胞培养适应的IBDV变种GLS-5菌株。表达T7 RNA聚合酶的改良痘苗株安卡拉（National Institutes of Health Bernard Moss慷慨捐赠）在原代鸡胚成纤维细胞中生长。
重组病毒质粒的构建和回收。
包含VP2基因的cDNA片段（VP2 ORF大小，1356 nt；GenBank访问号，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M97346”，“term_id”：“331205”，“term_text”：“M97346“}}M97346号)通过逆转录（RT）-PCR获得细胞培养适应的GLS-5菌株。简言之，IBDV株GLS-5是在Vero细胞中生长的。通过70000×离心从澄清的上清液中纯化病毒克在26%蔗糖垫上放置2小时。将部分纯化的病毒颗粒重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并用十二烷基硫酸钠（SDS）（0.1%）和蛋白酶K（100μg/ml）处理2小时。根据制造商的说明，用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取IBDV基因组RNA。使用IBDV特异性引物通过RT-PCR扩增VP2基因。对扩增产物进行测序，以确认VP2基因的身份。
携带NDV疫苗株LaSota全长cDNA的质粒pLaSota的构建已在前面描述过(19). 为了便于将IBDV的VP2基因插入NDV抗原组最近3′-近端位点，使用XbaI和HindIII悬挑引物将pLaSota的AscI和SacII片段亚克隆到pGEM-7Z（+）（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。如别处所述，在NP基因ORF之前引入了一个带有FseI位点的18-nt插入物（5′-GGCCGCTCTGCAACT-3′）(19). 用FseI标记的正向引物5′-act PCR扩增IBDV VP2基因ggccggccATGACAAACCATGCAACCAACCAAC-3′和反向引物5′-actggccggccttctacccgt公司c（c）ttttt-ctaa型tgcctcaCCTTATGGCCGGATTTTG-3′（FseI位点以粗体显示；NDV基因的开始和结束序列以下划线显示；IBDV VP2基因的特异序列以大写形式显示），用FseI消化，并克隆到pGEM-7Z（+）亚克隆中。VP2基因后立即放置终止密码子（TGA）。在终止密码子后添加四个额外的核苷酸（GGCA，抗原组感觉），以维持“六规则”(8,32,33). 将亚克隆中产生的AscI和SacII片段切除并用于替换pLaSota中的相应部分。对AscI和SacII区域进行测序，以确认VP2基因的存在。
使用编码NDV株LaSota的NP、P和L蛋白的三种表达质粒和编码NDV加IBDV VP 2基因的第四种质粒的混合物，从克隆的cDNA中完全回收感染性LaSota病毒(19). 在扩增和表征之前，对上清液中回收的病毒进行斑块纯化。回收的重组病毒命名为rLaSota/VP2。
RT-PCR鉴定重组病毒。
重组病毒在10天龄SPF鸡胚中生长。如前所述纯化病毒(20,22). 使用TRIzol试剂（Invitrogen）从部分纯化的病毒中提取基因组RNA。使用ThermoScript逆转录酶（Invitrogen）和抗原敏感引物5′逆转录基因组RNA-35CGAAGGAGATTGAAGTCGCACG公司58-3′. 以上述反转录cDNA为模板进行了两组PCR。第一组PCR使用与RT相同的抗原基因组引物和NDV基因组中1959-1981位置的基因组寡核苷酸5′-TCTGCTGTTTACCTGGGCTGT-3′进行。第二次PCR是使用相同的抗原敏感引物和IBDV VP2基因特异性负义内部引物，即5′-TAGCCAACCTGCGTCTGCTAGA-3′，在IBDV基因组中1371到1393的位置进行的。PCR产物的等分样品在1%琼脂糖凝胶上进行分析。使用PCR纯化试剂盒（德国希尔顿QIAGEN）纯化PCR产物，并对其进行整体测序，以确认回收的病毒中是否存在IBDV的VP2基因。
重组病毒表达IBDV VP2蛋白。
免疫荧光法检测VP2蛋白在感染病毒株的DF1细胞中的表达。简单地说，六孔板上汇合的DF1细胞感染了感染倍数（MOI）为0.1的病毒。24或48小时后，用PBS清洗细胞，并在室温下用3%多聚甲醛在PBS中固定20分钟。将细胞清洗三次，并用含有0.05%吐温20（PBS-T）的PBS渗透30分钟。用PBS进一步清洗后，用1:700稀释的兔抗IBDV抗血清（Vikram Vakharia的礼物）培养细胞1小时。用PBS冲洗细胞并用异硫氰酸荧光素（FITC）培养细胞-结合山羊抗兔免疫球蛋白G抗体（Kirkegaard&Perry Laboratories[KPL]，Gaithersburg，Md.）45分钟。再次用PBS清洗细胞，并使用尼康Eclipse TE（日本东京尼康）荧光显微镜观察。
为了进一步证实重组病毒对VP2蛋白的表达，使用感染的细胞裂解物和纯化的重组病毒进行蛋白质印迹分析。细胞裂解物由感染重组病毒（MOI，3）的DF1细胞在感染后20小时制备。用PBS清洗细胞，刮取，通过低速离心收集，并用裂解缓冲液（6.25 mM Tris[pH6.8]，1%SDS，10%甘油，6 M尿素，0.01%溴酚蓝，0.01%酚红）在冰上裂解30分钟。在7000×克10 min，用于Western blot分析。从感染尿囊液中纯化重组病毒并进行Western blot分析。为了检查VP2蛋白是否并入病毒粒子中，将细胞裂解物和纯化病毒粒子的样品与Laemmli样品缓冲液（加州大力士市Bio-Rad）混合，并在电泳前煮沸3分钟。煮沸的样品在12%的凝胶上通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，Mass.）。用兔抗IBDV抗血清探测细胞膜，用PBS-T洗涤，然后用辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG抗体（KPL）孵育。蛋白质与3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（TMB）过氧化物酶底物（KPL）孵育后可见。
为了检查重组病毒表达的VP2蛋白是否保留构象抗原表位，使用商业试剂盒（加利福尼亚州圣地亚哥Synbiotics）进行抗原捕获酶联免疫吸附试验（AC-ELISA）。该试验利用一组针对IBDV中和表位的单克隆抗体来检测病毒感染细胞的细胞裂解液和上清液中表达的VP2的反应性。简单地说，将病毒感染的DF1细胞的细胞裂解液或上清液用抗原稀释缓冲液（合生元）稀释（1:50），并添加到MAb涂层板的微孔中。将平板在4至8°C下孵育过夜，然后用PBS-T洗涤三次。向平板中添加阳性的鸡抗IBDV抗血清。在室温下30分钟后，将平板清洗三次，并用过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgG孵育30分钟。在用PBS-T清洗三次之后，添加底物2,2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉磺酸）（ABTS）。使用停止溶液15分钟后停止颜色发展。根据制造商的说明（合生元），在405 nm的ELISA阅读器上读取光密度（OD）值，并根据OD读数与对照组相比推断每种单克隆抗体的反应性。
病毒在细胞培养物和SPF鸡胚中的生长。
通过在DF1细胞中的多步骤生长测定来评估重组病毒的生长。以0.01的MOI感染DF1细胞，并在37°C的DMEM中孵育，DMEM含有5%胎牛血清和1μg乙酰-胰蛋白酶/ml。每隔8小时采集上清液，并通过斑块试验滴定DF1细胞。比较重组病毒在SPF鸡胚卵中的生长情况，2×10三将每种病毒100μl体积的PFU接种到10天龄鸡胚的尿囊腔中。感染性尿囊液在接种后60 h采集，通过菌斑试验进行病毒滴定。
体内重组病毒的特性。
如前所述，测定平均死亡时间（MDT）以评估SPF鸡胚中重组病毒的致病性(1). 简单地说，新鲜感染性尿囊液在PBS中稀释，得到10倍的稀释倍数。每稀释一次，将100μl接种到五个9天龄SPF鸡胚的尿囊腔中。鸡蛋在37°C下孵育，连续7天每天检查三次。记录每个胚胎首次死亡的时间。杀死所有胚胎的最高稀释度被视为最低致死剂量。MDT计算为杀死胚胎的最小致死剂量的平均时间（小时）。
重组病毒在鸡体内的免疫原性和保护效果评估。
我们在美国农业部批准的生物安全3级动物设施中评估了rLaSota/VP2对鸡的免疫原性和保护效力。将一日龄SPF白来亨鸡（SPAFAS，Norwich，Conn.）随机分为12个治疗组，每组10只，2组，每组5只，如表所示第1组至第7组鸡用于初级免疫和激发，而第8组至第14组鸡则用于二级免疫和激发。所有鸡都被安置在单独的家禽隔离室中，可以随意获得饲料和水。在2日龄时，通过眼部途径接种rLaSota/VP2（1×10）450%胚胎致死剂量50]每只鸟）或制造商推荐剂量的商业NDV LaSota疫苗和商业IBDV活疫苗。每组鸡在免疫后3周放血，使用市售ELISA试剂盒（Synbiotics）评估NDV或IBDV抗体。使用同源病毒的恒定病毒稀释血清技术，通过微量滴定病毒中和（VN）试验评估血液样本中的病毒中和抗体滴度。VN滴度表示为能够中和100平均50%组织培养感染剂量（TCID）的最后一次血清稀释的倒数50). 计算各组的几何平均滴度。第1组至第7组的鸟类被1×10的强NDV毒株Texas GB攻击4ELD公司50每只鸟肌肉注射或毒力IBDV GLS-5菌株1×10三胚胎感染剂量50)如表所示，23日龄时每只鸟的眼睛第8组至第14组的鸡在23天龄时接种商业NDV或IBDV疫苗或重组rLaSota/VP2。二次接种后两周，所有鸡均进行放血，通过ELISA对NDV或IBDV抗体进行免疫学评估，然后按照上述方法进行攻击。
表1。
| 出口。组 | 鸡的数量 | 接种年龄（天）
| 疫苗一 | 挑战年龄（天） | 挑战病毒b条 |
|---|
| 主要 | 次要 |
|---|
| 1 | 10 | 2 | - | 商业NDV疫苗 | 23 | 德克萨斯州GB |
| 2 | 10 | 2 | - | 市售IBDV疫苗 | 23 | GLS-5型 |
| 三 | 10 | 2 | - | 拉索塔/VP2 | 23 | 德克萨斯州GB |
| 4 | 10 | 2 | - | 拉索塔/VP2 | 23 | GLS-5型 |
| 5 | 10 | -c（c） | - | 无 | 23 | 德克萨斯州GB |
| 6 | 10 | - | - | 无 | 23 | GLS-5型 |
| 7 | 5 | - | - | 无 | - | 无 |
| 8 | 10 | 2 | 23 | 商业NDV疫苗 | 47 | 德克萨斯州GB |
| 9 | 10 | 2 | 23 | 商用IBDV疫苗 | 47 | GLS-5型 |
| 10 | 10 | 2 | 23 | 拉索塔/VP2 | 47 | 德克萨斯州GB |
| 11 | 10 | 2 | 23 | 拉索塔/VP2 | 47 | GLS-5型 |
| 12 | 10 | - | 23 | 无 | 47 | 德克萨斯州GB |
| 13 | 10 | - | 23 | 无 | 47 | GLS-5型 |
| 14 | 5 | - | - | 无 | - | 无 |
对感染IBDV的鸟类进行了72小时后的临床症状和死亡率检查。挑战三天后，鸡被安乐死并称重。对所有鸡的法氏囊样品进行称重，以比较法氏囊体重比（BBWR）。检查法氏囊的大体病变。获得的囊被分成两部分。一部分用AC-ELISA检测病毒抗原，另一部分用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用苏木精和伊红染色进行组织病理学检查。IBDV攻击保护指标基于以下标准：（i）无发病率或死亡率，（ii）囊内无组织学损伤，（iii）囊内未检测到IBDV抗原，（iv）BBWR的个体值在相应对照组平均值的2个标准偏差单位内，表明法氏囊完整。为了评估重组rLaSota/VP2的VP2蛋白表达是否干扰NDV的保护性免疫，每天观察感染NDV毒株Texas GB的鸟类10天的死亡率和嗜神经性新城疫的临床症状。如果鸟类没有中枢神经系统症状并幸存下来，则认为它们受到了保护。
结果
回收表达IBDV VP2蛋白的重组NDV。
我们之前已经构建了pLaSota，它编码NDV菌株LaSota的完整15816nt抗原组，以及含有氯霉素乙酰转移酶基因作为额外转录单元的pLaSota/CAT(19). 这里，我们使用相同的方法构建质粒pLaSota/VP2，将IBDV VP2基因插入NP基因ORF上游的NDV抗原组（图。). 从纯化病毒中提取的IBDV基因组RNA经过RT-PCR扩增VP2基因片段，如前所述(19). 在VP2基因ORF后插入一个终止密码子和四个额外的核苷酸，以保持6的规则(8,32). 由此产生的质粒命名为pLaSota/VP2，包含一个额外的转录单位，编码16596 nt的抗原组（图。). 重组rLaSota/VP2病毒通过我们建立的反向遗传学程序从该cDNA中完全回收(19).
表达IBDV VP2蛋白的重组NDV的构建。（A） 用一对FseI标记的引物通过RT-PCR扩增IBDV的VP2基因，用FseI消化，并导入NP基因非编码区的FseI位点。在VP2基因后立即放置一个终止密码子（TGA），然后再添加四个核苷酸（GGCA）以保持六的规则。VP2基因两侧有NDV基因末端（GE）、基因间序列和基因启动（GS）信号。（B） 用AscI和SacII切除含有VP2基因的片段，并用于替换pLaSota中的相应片段。产生的pLaSota/VP2编码16596 nt的抗原RNA，是6的倍数。
重组病毒的RT-PCR分析。
为了确认在回收的rLaSota/VP2基因组中是否存在IBDV VP2基因，从纯化的病毒中提取病毒RNA并进行RT-PCR分析。RT是用一个抗原敏感引物进行的，该引物退火到NDV基因组位置35到58的先导序列。按照材料和方法中的详细说明，使用相同的抗原基因组引物以及其他两个阴性引物进行两组PCR。正如预期的那样，rLaSota产生了1.9 kb的PCR产物，这将代表没有外源基因的片段。相反，rLaSota/VP2产生了一个单一的、更长的PCR产物，对应于包含插入VP2转录单位的预测的3.3-kb片段。对提取的病毒RNA进行PCR而不进行RT时，没有PCR产物（数据未显示）。当使用VP2基因内部引物进行PCR时，只有rLaSota/VP2产生预测大小为0.5kb的PCR产物，并且没有观察到rLaSota病毒的产物（数据未显示）。对RT-PCR产物进行测序，以确认IBDV VP2基因的身份。
为了测定重组rLaSota/VP2病毒中VP2基因的稳定性，将回收的病毒在9日龄SPF鸡胚中传代12次，并用RT-PCR检测每代病毒中是否存在VP2基因。我们的结果表明，在发育的鸡胚中，即使经过12代，VP2基因的序列一致性仍得以保持和稳定。
重组病毒表达IBDV VP2蛋白。
为了通过rLaSota/VP2检测VP2蛋白的表达，DF1细胞以0.1的MOI感染第12代的rLaSota/VP2。在感染后24或48小时，将细胞固定并与针对IBDV的兔抗血清孵育，然后用FITC-结合的山羊抗兔IgG进行免疫染色。结果表明，VP2蛋白在感染后24小时广泛表达（图。)感染后48小时进一步增加（数据未显示）。与rLaSota/VP2相比，细胞培养适应的IBDV株GLS-5在感染后24小时显示出低水平的荧光（图。)，表明IBDV的复制周期较慢。然而，感染后48小时，rLaSota/VP2-和IBDV GLS-5感染细胞中VP2抗原的荧光强度和细胞分布相似（数据未显示）。感染DF1细胞裂解物的Western blot分析进一步证实了rLaSota/VP2病毒表达VP2蛋白（数据未显示）。我们还能够通过ELISA证明rLaSota/VP2感染细胞上清液中的VP2蛋白。纯化rLaSota/VP2病毒的Western blotting显示没有检测到VP2蛋白的量（数据未显示）。总之，这些结果表明重组rLaSota/VP2稳定地表达VP2蛋白，并且VP2蛋白可能没有结合到病毒粒子中。
IBDV VP2蛋白表达的免疫荧光分析。融合的DF1细胞在第12代（C）以0.1的MOI感染rLaSota（A）、细胞培养适应的GLS-5（B）或rLaSota/VP2。将感染细胞固定、渗透，并用兔抗IBDV抗血清进行检测，然后用FITC-结合的山羊抗兔IgG抗体进行孵育。在Eclipse TE（尼康）荧光显微镜下观察细胞。放大倍数，×400。数据显示在感染后24小时。
rLaSota/VP2的MAb反应性曲线。
为了评估rLaSota/VP2病毒表达的VP2蛋白是否包含中和表位，AC-ELISA用一组特征良好的表位特异性单克隆抗体分析了感染细胞的细胞裂解液和上清液。使用与VP2蛋白上的表位相对应的五个病毒中和单克隆抗体（8、10、57、R63和B69）来分析表达蛋白的抗原性(40,41). 如果样品的OD值等于或大于0.6，则视为阳性。MAb 57对应于变异GLS-5菌株VP2蛋白中的一个独特的中和表位；而单克隆抗体8和10定义了IBDV经典株和变异株GLS-5中的中和表位(40,41,42). 表达的VP2蛋白与MAbs 57和10都发生反应，变异的GLS-5菌株也发生了反应（表). 然而，rLaSota/VP2感染细胞的细胞裂解液和上清液没有与MAb 8结合，这表明该表位的存在可能取决于其他病毒相关蛋白的存在。MAbs R63和B69定义的表位仅存在于经典菌株中，但在GLS-5菌株中不存在(41,42). 重组VP2蛋白未与R63和B69结合（表). 这些结果表明，rLaSota/VP2表达的VP2蛋白对GLS-5菌株具有特异性，并保留了中和表位。由于这些中和表位是构象依赖性的，因此表达的VP2应该形成用于免疫识别的构象正确的结构。虽然没有直接测量重组蛋白的数量，但免疫染色和AC-ELISA的结果表明VP2蛋白的表达水平较高。
表2。
用AC-ELISA对rLaSota/VP2表达的VP2蛋白与IBDV中和单克隆抗体的抗原性鉴定一
| MAbs公司b条 | IBDV的抗原反应性c（c）
|
|---|
| 经典的d日 | GLS-5型 | 拉索塔/VP2 | 拉索塔 |
|---|
| 8 | + | + | − | − |
| 10 | + | + | + | − |
| 57 | − | + | + | − |
| 63兰特 | + | − | − | − |
| B69型 | + | − | − | − |
重组病毒的生长特性。
为了确定VP2蛋白对重组rLaSota/VP2生长的影响，我们分析了DF1细胞在多步生长条件下的动力学和最终病毒产量。用rLaSota/VP2或rLaSota病毒以0.01的MOI感染DF1细胞的三硅酸盐单层，并以8小时的间隔收集样品，以通过斑块测定评估病毒滴度。结果表明，rLaSota和rLaSota/VP2的复制动力学和数量非常相似，尽管rLaSo塔/VP2复制略有延迟（图。). 两种重组病毒在感染后64小时DF1细胞和SPF鸡胚中的最终病毒产量相当。此外，rLaSota/VP2和亲代rLaSota之间的斑块大小和形态没有显著差异（数据未显示）。
细胞培养中rLaSota和rLaSota/VP2的多级生长曲线。25厘米DF1细胞单层2烧瓶以0.01的MOI感染病毒，并在37°C的DMEM中培养，DMEM补充5%胎牛血清和1μg乙酰-胰蛋白酶/ml。每隔8小时采集上清液进行病毒滴定。数值来自两个独立的实验，每个实验一式三份。条形图显示标准偏差。
鸡胚中的MDT。
用MDT法测定了10日龄SPF鸡胚中亲本病毒rLaSota和重组rLaSota/VP2的毒力。MDT是国际公认的NDV毒株致病性评估方法之一。NDV株系根据MDT分为三类：快速型（小于60小时）、中胚层型（60至90小时）和透镜型（大于90小时）(1,2). rLaSota和rLaSota/VP2的MDT值分别为98和106小时。这些结果表明，rLaSota/VP2病毒杀死胚胎的时间稍长，插入IBDV VP2基因后，重组病毒的致病性没有增加。
免疫原性和对强毒力IBDV攻击的保护作用。
为了确定重组rLaSota/VP2的免疫原性和保护效力，用商业IBDV或商业NDV疫苗或rLaSota/VP2对2日龄鸡群进行了疫苗接种（表). 接种疫苗三周后，用市售ELISA试剂盒（Synbiotics）通过ELISA分析血液样本（激发前）是否存在NDV或IBDV抗体，并通过VN测试分析中和抗体。我们的结果表明，ELISA和VN测试的抗体滴度高度相关（表). 在接种rLaSota/VP2和商用IBDV疫苗的鸡中，针对IBDV的ELISA滴度和VN滴度处于较高水平（表). 在用rLaSota/VP2和商业NDV疫苗免疫的禽类中，抗NDV的ELISA滴度和VN滴度是可比较的。未接种疫苗的对照组的血样中未检测到NDV或IBDV抗体（表). 数据表明，rLaSota/VP2表达的VP2蛋白在鸡体内诱导了很好的抗体反应，并且VP2蛋白的表达不会干扰NDV抗体的诱导。
表3。
| 组 | 疫苗一 | 抗体滴度b条
|
|---|
针对NDV
| 针对IBDV
|
|---|
初级疫苗接种
| 二次接种
| 初级疫苗接种
| 二次疫苗接种
|
|---|
| 酶联免疫吸附试验c（c） | 越南d日 | 酶联免疫吸附试验 | 越南 | 酶联免疫吸附试验 | 越南 | 酶联免疫吸附试验 | 越南 |
|---|
| 1 | 商业NDV疫苗 | 4,720 | 336 | 6,960 | 683 | <10 | ≤2 | <10 | ≤2 |
| 2 | 商用IBDV疫苗 | <10 | ≤2 | <10 | ≤2 | 7,870 | 687 | 8,610 | 1,056 |
| 三 | 拉索塔/VP2 | 5,103 | 294 | 7,030 | 629 | 6,580 | 576 | 7,120 | 982 |
| 4 | 无 | <10 | ≤2 | <10 | ≤2 | <10 | ≤2 | <10 | ≤2 |
免疫后3周，免疫鸡和未接种疫苗的对照鸡被IBDV强毒株GLS-5攻击。未接种疫苗的鸡对这种挑战完全敏感，表现出死亡率（10%）或临床症状（100%）。相反，接种rLaSota/VP2或商用IBDV活疫苗的鸡没有观察到任何临床症状或死亡率。在接种rLaSota/VP2或商用IBDV活疫苗的鸡中，如BBWR所示，激发后分别有20%和10%的鸡出现法氏囊萎缩。通过Kruskal-Wallis试验将BBWR的组平均值分配给相似的组，表明商用IBDV疫苗和rLaSota/VP2都能提供显著的抗挑战保护（表，初级疫苗接种）。AC-ELISA分析显示出与BBWR相似的保护模式，20%和10%的法氏囊样本显示存在IBDV抗原（表，初级疫苗接种）。代表性样本的组织病理学检查显示，接种商业IBDV活疫苗或rLaSota/VP2并用GLS-5病毒攻击的鸡没有或只有轻微的法氏囊病变，而未接种疫苗的攻击鸡表现出严重的法氏囊病变（图。). 总的来说，根据这些标准，初次接种rLaSota/VP2和商用IBDV活疫苗分别对初次接种后的强毒株GLS-5的挑战提供了80%和90%的保护。在接种商业NDV活疫苗或rLaSota/VP2疫苗的鸡中，每组每10只鸡中有1只死于NDV毒株Texas GB的致命攻击。其他所有禽类均正常健康，表明NDV活疫苗和rLaSota/VP2在初次接种后均达到90%的保护水平。
激发3天后法氏囊的组织病理学。鸡接种PBS（A和B）、商用IBDV疫苗（C）或rLaSota/VP2（D），并用IBDV强毒株GLS-5（B、C、D）进行攻击。面板A显示了一个无挑战的控件。激发72小时后，取下囊并用中性缓冲福尔马林固定。组织用石蜡包埋，切片，用苏木精和伊红染色以进行显微镜检查。放大倍数，×40。（A） 正常鸡的囊：大而活跃的滤泡，滤泡间组织很少。（B） 未接种疫苗的攻击鸡的囊：严重的多灶髓质空泡化和淋巴细胞耗竭（箭头），以及严重的滤泡变性（箭头）。（C） 接种商用IBDV疫苗的鸡的法氏囊受到挑战：一些轻微的多灶髓质空泡化和淋巴细胞耗竭（箭头所示）。（D） 接种rLaSota/VP2并激发的鸡囊：未观察到组织学损伤。
表4。
| 接种疫苗 | 初级疫苗接种
| 二次接种
|
|---|
BBWR公司b条
| 急性呼吸系统综合征c（c）（受保护数量/总数） | 整体保护（%） | BBWR公司
| AC-ELISA（受保护数量/总数） | 整体保护（%） |
|---|
| 平均值±标准偏差 | 受保护数量/总数 | 平均值±标准偏差 | 受保护数量/总数 |
|---|
| 商用IBDV疫苗 | 5.04±0.77（A） | 9/10 | 9/10 | 90 | 4.71±0.44（A） | 10/10 | 10/10 | 100 |
| 拉索塔/VP2 | 5.12±0.78（A） | 2010年8月 | 2010年8月 | 80 | 4.91±0.51（A） | 10/10 | 10/10 | 100 |
| 未接种疫苗，有挑战性 | 2.99±0.57（B） | 0/10 | 0/10 | 0 | 2.89±0.58（B） | 0/10 | 0/10 | 0/10 |
| 未接种疫苗，无挑战性 | 5.31±0.79（A） | 5/5 | 5/5 | 100 | 5.26±0.62（A） | 5/5 | 5/5 | 100 |
在23天大的时候，使用商业活NDV或IBDV疫苗进行二次免疫，与一次免疫相比，分别诱导了更高水平的NDV和IBDV抗体（表). 再次接种rLaSota/VP2可增强对NDV和IBDV的抗体反应，这反映在较高的抗体滴度上（表). 二次免疫两周后，用上述IBDV毒株GLS-5或NDV毒株Texas GB对鸡进行攻击。如抗原检测、BBWR和组织病理学所示，商业活IBDV疫苗和重组rLaSota/VP2都对IBDV强毒株GLS-5的攻击具有完全的保护作用；而未接种疫苗的对照鸡则完全易感（表). 接种rLaSota/VP2和商业NDV疫苗的鸡在二次免疫后，也能抵抗强毒株NDV Texas GB的攻击（表). 总的来说，结果表明，IBDV和NDV攻击的保护水平与疫苗诱导的抗体滴度密切相关，rLaSota/VP2表达IBDV VP2蛋白不会干扰NDV免疫。
表5。
| 疫苗 | 初级疫苗接种
| 二次接种
|
|---|
| 死亡人数/总数 | 保护（%） | 死亡人数/总数 | 保护（%） |
|---|
| 商业NDV疫苗 | 1/10 | 90 | 0/10 | 100 |
| 拉索塔/VP2 | 1/10 | 90 | 0/10 | 100 |
| 无 | 10/10 | 0 | 10/10 | 0 |
讨论
利用生物技术制造重组病毒载体疫苗为未来带来了许多希望。在家禽业中，迄今为止，禽痘病毒、火鸡疱疹病毒、马立克氏病病毒、腺病毒和逆转录病毒家族成员被广泛用作表达载体(11,21,48). 这些重组病毒已证明对多种禽类疾病具有保护作用。然而，它们的实际用途仍需评估，尤其是在安全性、交付途径、疗效和生产成本等因素方面(11,21,48).
NDV为传递其他禽类病原体的保护性抗原提供了有效的载体系统，例如IBDV或传染性支气管炎病毒。拉索塔毒株等NDV活疫苗在世界各地的家禽业中广泛使用，其安全性和有效性已得到证明。LaSota免疫不仅可以诱导持久的体液和细胞免疫，还可以诱导强大的粘膜免疫。NDV在许多细胞系和胚胎卵子中生长到非常高的滴度，这使得疫苗的生产成本低廉且容易。与其他病毒载体不同，NDV有一个只编码少数蛋白质的简单基因组。对于产生特异性免疫反应，只表达有限数量的蛋白质将是有利的。
IBDV是一种对全球家禽业具有重要经济意义的病原体。目前，鸡常规接种IBDV疫苗(25). 然而，传染性法氏囊病在国际上仍具有相当大的社会经济重要性，因为由于新的抗原变体或毒力增强的菌株的出现，该病几乎在每个国家都存在(25). 由于病毒RNA聚合酶的易出错性质，以及通过循环菌株之间或疫苗与循环现场菌株之间的重组，点突变的积累可能会产生变异株和高度毒力菌株(25,42). 另一个可能导致产生抗原变异病毒的因素是广泛使用IBDV减毒活疫苗(25). 在一段时间内，这些IBDV减毒活疫苗可能会恢复毒性并改变抗原性(17,41,42). 此外，IBDV活疫苗无法突破雏鸡体内高水平的母体抗体(25). 因此，有必要制定替代性IBDV免疫策略，以阻止变异株和/或高度毒力株的发展，但仍有能力在存在母体抗体的情况下诱导对控制疾病至关重要的局部和全身免疫。
VP2蛋白是IBDV的主要宿主保护性免疫原，分离株之间的大多数变异出现在病毒基因组的这一部分(4,12,16,40). 由于病毒的主要中和表位是构象表位，因此以天然构象传递VP2蛋白对正确的抗原处理和呈递至关重要(三,25). 此外，在开发家禽疫苗时，必须考虑到许多因素。由于一只鸟的价格相对较低，最重要的因素之一是疫苗的成本。在此进行的研究导致了NDV和IBDV双价候选疫苗的开发，并提供了一种廉价的方法。这种新型候选疫苗具有以下特点。IBDV VP2蛋白表达稳定、正确，保留了宿主保护的构象表位。表达的VP2蛋白未并入重组病毒，重组病毒具有与亲本rLaSota病毒相似的复制动力学。
总的来说，重组rLaSota/VP2与现有的IBDV疫苗相比具有一些优势。首先，重组NDV/VP2对家禽业来说是非常经济的，因为目前的IBDV疫苗接种成本将为家禽生产者消除。第二，重组病毒可以突破，不会被母体对IBDV的免疫所中和；因此，即使在母体抗体存在的情况下，它也可以用于疫苗接种，以加强对鸡生命最初几周的保护。第三，重组rLaSota/VP2疫苗不会产生新的IBDV变种，因为不会使用活的IBDVD进行疫苗接种。最后，据报道，NDV的V蛋白与病毒的发病机制有关，并作为干扰素拮抗剂发挥作用(20,28). 研究还表明，消除NDV中的V蛋白表达可使病毒减毒但仍具有高度的免疫原性，减毒NDV疫苗株将通过自动化以均匀剂量在卵子中接种，以保护有或无母源抗体的鸡(28). 因此，重组病毒可以很容易地定制用于卵子中。因此，本文描述的用于保护NDV和IBDV的重组病毒将对家禽业非常有益。
我们的结果表明，对于一种变种传染性法氏囊病，使用NDV重组疫苗可以保护SPF鸡免受大量同源病毒株的攻击。商业鸡对许多不同田间毒株的成功免疫可能更为复杂。然而，我们可以设计策略来改进重组疫苗。由于VP3亚基上也存在额外的（尽管很小的）中和表位(25)有理由认为，将编码IBDV多聚蛋白的基因插入NDV基因组可以增强重组病毒的免疫原性。此外，多聚蛋白的正确表达可能导致形成病毒样颗粒，这将具有更强的免疫原性并提供更好的保护(45). 目前，在家禽业中，同时使用经典型和变异型IBDV活疫苗株以获得最大的交叉保护。我们可以制造两种重组病毒，每种病毒分别表达经典株或变异株的VP2蛋白，并将其用作疫苗接种的组合产品。或者，我们可以同时表达来自同一NDV基因组的两个VP2蛋白，作为两个独立的转录单位。如果出现了一种新的变异血清型，而目前的疫苗无法为其提供足够的保护，我们可以方便地使用该系统来更新疫苗的抗原特异性，以最好地控制目前流行的现场菌株。NDV生长在细胞质中，没有DNA阶段，重组频率极低(24)将使表达IBDV VP2蛋白的重组NDV的使用更具吸引力。
本研究表明，重组NDV是一种优良的IBDV疫苗载体。使用基于NDV的疫苗可以减少传播IBDV菌株的数量，这可能对家禽业非常有益。此外，我们的结果表明，NDV可以用作其他禽类病原体的疫苗载体。此外，NDV优先在鸟类细胞中复制，但在大多数哺乳动物细胞中复制不足；因此，NDV可以作为一种很有前景的人类病原体疫苗载体。掌握了基本知识后，重组NDV还可以用于癌症治疗和基因治疗。
