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细胞科学杂志。作者手稿;PMC 2009年12月4日提供。
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尼姆斯:美国国家卫生研究院157516
PMID:12376553

基底膜胶原非胶原结构域的新功能作用

总结

胶原IV、XV和XVIII是各种基底膜的主要成分。除了胶原蛋白特异性三螺旋外,这些胶原蛋白的特征是存在几个非胶原蛋白结构域。现在很明显,这些无处不在的胶原分子参与了比基底膜的分子结构更微妙和复杂的功能,特别是在细胞外基质降解的情况下。基底膜胶原蛋白的降解发生在许多生理和病理过程中,如胚胎发育或肿瘤发生,并产生胶原蛋白碎片。这些碎片参与不同于其原始完整分子的功能调节。胶原IV、XV和XVIII的非胶原C末端片段NC1最近在文献中被强调,因为它们在减少血管生成和肿瘤发生方面的潜力,但很明显,它们的生物学功能并不局限于这些过程。可溶性NC1片段的蛋白水解释放刺激不同细胞类型的迁移、增殖、凋亡或存活,并抑制各种形态发生事件。

关键词:基底膜胶原、NC1片段、血管生成、形态发生

介绍

细胞外基质(ECM)是由多种蛋白质组成的复杂网状物,它的形成是多细胞生物出现的关键事件。ECM为电池提供机械支撑,也会影响电池行为。它在生理或病理过程中的重塑会产生新的信号,特别是在细胞和基底膜之间。骨髓是与上皮细胞或内皮细胞、肌纤维、脂肪细胞和外周神经密切相关的特殊ECM的薄层。IV、XV和XVIII型胶原蛋白,以及层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、纤维蛋白、肌营养不良蛋白多糖和其他糖蛋白是BM的主要成分(有关综述,请参阅埃里克森和库奇曼,2000年;Miosge,2001年;Schwarzbauer,1999年). 编码这些胶原蛋白的基因的大量突变与人类疾病有关(有关综述,请参阅Myllyharju和Kivirikko,2001年). 最近,这些胶原蛋白的非胶原蛋白C末端结构域(NC1)已成为众多研究的焦点,研究其在骨髓分子结构中的作用,以及不同于原始胶原蛋白的更精细和复杂的生物功能,例如血管生成或分支形态发生。

血管生成是一个复杂的侵入性过程,在成人中发生新生血管。由于其在肿瘤发生中的关键作用,在过去十年中,人们一直致力于开发和鉴定抗血管生成分子,以期产生潜在的药物治疗。对内源性血管生成抑制剂的研究导致了内皮抑素的发现,它是胶原XVIII的非胶原C末端片段(O'Reilly等人,1997年). 这些数据强调了胶原蛋白片段在调节细胞行为中的作用,并增加了人们对其潜在生物功能的兴趣。迄今为止,所描述的内源性血管生成抑制剂中有一半是大蛋白蛋白水解产生的隐秘片段,包括血管抑制素(纤溶酶原片段)或血管抑制物(钙网蛋白片段),其中六种来源于胶原蛋白(综述见曹,2001;马内罗斯和奥尔森,2001年). 除了血管生成,胶原蛋白片段还具有其他一些功能(表1).

表1

各种胶原蛋白片段的生物学功能

胶原碎片生物功能
第一列三聚体羧基
前肽
内皮细胞趋化性(Palmieri等人,2000年)
各种碎片真皮成纤维细胞和外周单核细胞的趋化作用
  (阿尔比尼和阿德尔曼烧烤餐厅,1985年;Malone等人,1991年)
第二列各种碎片抑制软骨细胞合成胶原和分泌MMP
  (Jennings等人,2001年)
C-前肽或
软骨钙质
软骨钙化(Alini等人,1992年;Van der Rest等人,1986年)
型胶原NC1和7S域抑制普通水螅(Sarras等人,1993年)
NC1域促进轴突生长(Lein等人,1991年)
α1 NC1,逮捕抗血管生成(科罗拉多等人,2000年)
α2 NC1,canstatin抗血管生成(Kamphaus等人,2000年;Petitclerc等人,2000年)
α3 NC1,tumstatin抗血管生成(Maeshima等人,2000年;Petitclerc等人,2000年)
α6 NC1抗血管生成(Petitclerc等人,2000年)
第VIII列NC1结构域伐他汀血管生成的(Xu等人,2001年)
第XIV列N-末端片段中性粒细胞趋化性(Nakagawa等人,1999年)
第十五列国家编目1抗血管生成(Sasaki等人,2000年)
Restin公司抗血管生成(Ramchandran等人,1999年;Sasaki等人,2000年)
第十八栏国家编目1诱导神经和非神经细胞迁移秀丽线虫(Ackley等人,2001年)
内皮抑素抗血管生成(O'Reilly等人,1997年)
抑制分枝形态发生(Karihaloo等人,2001年)

这里,我们重点关注胶原蛋白IV、XV和XVIII,因为它们最近在文献中得到了强调。在简要介绍了这些胶原蛋白后(有关综述,请参阅Olsen和Ninomiya,1999年;Sado等人,1998年),我们讨论了其NC1片段的生物学功能,不仅在血管生成中,而且在其他过程中。事实上,尽管这些片段已经成为肿瘤生物学的焦点,但很明显,它们与其他基本形态发生事件有关。

IV、XV和XVIII型胶原蛋白:基因、结构和生理功能

IV型胶原蛋白

IV型胶原调节细胞黏附和迁移,在脊椎动物和无脊椎动物中高度保守,无论是在结构上还是在BM结构中的功能作用上(Blumberg等人,1987年;Netzer等人,1998年;Sarras等人,1993年). 六种不同的多肽,α1到α6,由三组基因编码,形成IV型胶原异源三聚体(Filie等人,1995年;Momota等人,1998年;Soininen等人,1988年;Sugimoto等人,1994年).

每个α链由三个结构域组成,一个富含半胱氨酸的N末端7S结构域、一个中心三螺旋结构域和一个球状C末端非胶原NC1结构域(图1A). NC1结构域参与α链的组装以形成异三聚体,7S结构域参与四个异三聚物在蜘蛛状结构中的共价组装(Boutaud等人,2000年;Dolz等人,1988年;Tsilibary等人,1990年). 因此,IV型胶原形成一个复杂的分支网络,作为BM的支架(Yurcenco等人,1987年) (图1B). 虽然α1和α2链在许多组织中广泛表达并共定位,但在生理和病理过程中,α3、α4、α5和α6的表达存在时间和空间调节(Dehan等人,1997年;Fleischmajer等人,1997年;Miner and Sanes,1994年;Shen等人,1990年;Tanaka等人,1997年).

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(A) 人胶原蛋白IVα链的线性结构。六个不同的基因编码IV型胶原α链;每种多肽由三个不同的结构域组成:富含半胱氨酸的N末端7S结构域、具有多个小中断的中心三螺旋结构域(绿色方框)和球状C末端非胶原NC1结构域。NC1和中心三螺旋结构域的大小相等,而α3、α4、α5和α6的7S结构域比α1和α2短。根据序列同源性,这些不同的链可以分为两组,α1-类(α1,α3,α5)和α2-类(α2,α4,α6)。IV型胶原α链的组装。(B) 三聚体的组装首先依赖于NC1结构域的结合,然后三螺旋结构形式和7S结构域共价结合。四个三聚体通过其7S结构域在蜘蛛状结构中相互作用,而两个三聚物通过其NC1结构域从头到脚相互作用,形成一个片状结构。几个三聚体也可以沿着它们的三螺旋结构域排列在一起,使结构变厚(Timpl等人,1981年).

一些人类遗传病为研究IV型胶原的生理作用提供了新的视角第4a5列、第4a3列第4a4列参与阿尔波特综合征,其特征是肾小球BM缺陷和随后发生的肾小球肾炎(Mochizuki等人,1994年),而一些缺失跨越了第4a5列/第4a6列该集群与阿尔波特综合征和弥漫性平滑肌瘤病(一种良性平滑肌肿瘤)有关(Heidet等人,1997年;Zhou等人,1993年). α3链的C末端区域已被确定为一种与Goodpasse综合征有关的自身抗原,Goodpases综合征是一种以肾小球肾炎和肺出血为特征的免疫疾病(有关综述,请参阅Hudson等人,1993年;Kalluri,1999年). 已开发出常染色体Alport综合征小鼠模型,并对人类疾病进行了症状学检查(Cosgrove等人,1996年;Cosgrove等人,1998年;Lu等人,1999年;Miner and Sanes,1996年).

IV型胶原不同α链的存在及其有限的组织分布决定了BM的结构和功能特异性。此外,从最低的后生动物到脊椎动物,这种分子的高度保守性将IV型胶原确定为形态发生的关键调节因子,对不同细胞类型的粘附、迁移和存活的调节至关重要。

胶原类型XV和XVIII

XV和XVIII型胶原蛋白,分别鉴定为硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Halfter等人,1998年;Li等人,2000年),是定义多聚蛋白亚家族的密切相关的非纤维胶原(倍数三直升机x具有的域在里面中断)(Abe等人,1993年;Oh等人,1994年;Oh等人,1994年b;Rehn和Pihlajaniemi,1994年;Rehn等人,1994年). α1(XV)和α1(XXVIII)链组织为同源三聚体。每条链分为三个亚结构域,与IV型胶原一样,包括C末端NC1结构域(图2A). 编码胶原蛋白XV和XVIIIα1链的基因已被克隆,并分别定位于人类第9和21号染色体以及小鼠第4和10号染色体(Hagg等人,1997年a;Huebner等人,1992年;Oh等人,1994年).

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(A) 人类胶原蛋白XV和XVIIIα1链的线性结构。胶原XV和XVIII的α1链在结构上同源;他们定义了一个新的胶原蛋白亚家族,即multiplexin家族,该家族基于具有多个长中断的中心三螺旋结构域(绿色框)。其特征还包括一个长的非胶原N末端结构域包含血栓反应蛋白序列基序,在人类胶原XVIII中有两个剪接变体,以及一个长非胶原球状C末端结构域或NC1结构域。(B) 人类NC1(XVIII)和蛋白酶裂解位点的功能亚结构域。NC1结构域包含三个功能不同的亚结构域:这些结构域包括三聚体结合所必需的N末端非共价三聚化结构域,包含对不同蛋白酶敏感的多个位点的铰链结构域和覆盖20kDa片段的内皮抑素球状结构域,具有抗血管生成和抗分支形态发生活性。许多酶可以产生含有内皮抑素的片段。组织蛋白酶L和弹性蛋白酶是最有效的,但与导致内皮抑素积累的基质金属蛋白酶裂解相比,组织蛋白酶I和B降解分子[根据费雷拉斯发表的数据显示了裂解位点(费雷拉斯等人,2000年)].

胶原XV在心脏、骨骼肌和胎盘中高度表达,在肾上腺、肾脏和胰腺中中度表达(Kivirikko等人,1995年;Muragaki等人,1994年). 它的表达与血管、神经元、间充质和一些上皮BM有关,表明BM与下面的结缔组织基质之间可能存在粘附功能(Myers等人,1996年). 在胚胎的肾脏、心脏和肺发育过程中高度调节,胶原XV与胶原IV共定位,是连续或有窗毛细血管BM的组成部分,但血脑屏障和肝脾窦除外(Hagg等人,1997年b;Muona等人,2002年). 对于胶原蛋白XVIII,存在几种剪接变体:人类中有两种亚型(Saarela等人,1998年a)小鼠中有三只(Rehn和Pihlajaniemi,1995年). 有趣的是,这些变体具有特定的表达模式。短亚型在各种器官中表达,而长亚型在肝窦和肝细胞中表达更为特异(Musso等人,2001年;Rehn等人,1994年;Saarela等人,1998年a;Saarela等人,1998年b). 胶原XVIII的转录也发生在脂肪生成过程中(Inoue-Murayama等人,2000年)除Descemet膜外,在各种BM的发育中和出生后的眼睛中都观察到强烈的表达(Fukai等人,2002年).

胶原蛋白XV和XVIII的生理作用尚不清楚。缺乏胶原蛋白XV的小鼠对运动引起的肌肉损伤和骨骼肌进行性退化(毛细血管塌陷和内皮细胞退化)表现出更高的敏感性。因此,胶原XV可能参与下层BM上肌纤维和内皮细胞的存活和稳定(Eklund等人,2001年). 对于胶原XVIII,一种影响短亚型的突变最近与Knobloch综合征有关,Knoblochsyndrome是一种常染色体隐性疾病,以高度近视、玻璃体视网膜变性伴视网膜脱离、黄斑异常和枕叶缺损为特征(Sertie等人,2000年). 有趣的是,缺乏胶原蛋白XVIII的小鼠也会出现同样的眼部异常(Fukai等人,2002年). 因此,胶原蛋白XV和XVIII调节特殊BM的关键功能。

IV、XV和XVIII胶原C末端NC1片段的结构、定位和受体

已从无脊椎动物和脊椎动物骨髓中分离出胶原蛋白IV、XV和XVIII的NC1结构域,并鉴定为血清中的循环片段。胶原XV和XVIII在其NC1结构域中具有相似的结构,它们被组织成三个不同的亚结构域(图2B) (Sasaki等人,1998年; Sazaki等人,2000年)。内皮抑素是NC1(XVIII)的C末端亚结构域,是第一个具有抗血管生成特性的内源性胶原片段(O'Reilly等人,1997年). 基于其与胶原XVIII的高度序列相似性,NC1(XV)的C末端亚结构域被命名为restin(Ramchandran等人,1999年)或内皮抑素样§(Sasaki等人,2000年),也被鉴定为内源性血管生成抑制剂。

对于IV型胶原,来自α1、α2和α3链的NC1结构域也被鉴定为血管生成抑制剂,分别命名为arresten、canstatin和tumstatin(科罗拉多等人,2000年;Kamphaus等人,2000年;Maeshima等人,2000b). 这些NC1结构域与异三聚体的自结合有关(Boutaud等人,2000年;Timpl和Brown,1996年;Tsilibary等人,1990年). 最近IV型胶原NC1结构域的晶体结构表明,NC1单体折叠成一种新的三级结构,包括β链和两个同源亚结构域N和C。三聚体是通过独特的三维结构域交换组装的(Sundaramoorthy等人,2002年),并且两个三聚体可以通过未表征的共价交联进行头对头稳定(Than等人,2002年).

内皮抑素的晶体结构显示出具有锌结合位点的紧密折叠和11个精氨酸残基的广泛碱性斑块,这解释了内皮抑素对肝素的高亲和力。内皮抑素结构域的整体结构与C型凝集素碳水化合物再认识结构域有关,这些结构域以二聚体的形式存在于晶体中(Ding等人,1998年;Hohenester等人,1998年;Hohenester等人,2000年). 类内皮抑素的结构与内皮抑素非常相似(60%序列一致),但缺乏锌和肝素结合位点(Sasaki等人,2000年).

内皮抑素和内皮抑素样片段与胶原XV和XVIII在许多器官的BM中共定位,但肝窦除外,肝窦存在内皮抑素类但不存在胶原类型XV染色(Miosge等人,1999年;Sasaki等人,2000年;Tomono等人,2002年).

这些片段的受体是什么?许多整合素已被确定为NC1片段的主要细胞受体(表2). 内皮抑素与K的两个细胞表面结合位点d日已经描述了18 pM和200 pM的值。低亲和力受体对应于球蛋白聚糖,而高亲和力受体尚未确定。这些受体对内皮细胞没有特异性;它们也存在于上皮细胞上(Karumanchi等人,2001年). 最近有研究表明,内皮抑素与VEGF-R2结合,后者是一种参与内皮细胞增殖的受体。除了整合素外,还描述了胶原蛋白、血小板糖蛋白VI和各种细胞类型的盘状结构域受体(DDR)的另外两种受体(综述见沃格尔,1999年). 但这些相互作用是否通过IV、XV和XVIII胶原的NC1结构域发生尚不清楚。此外,一些ECM蛋白与这些片段相互作用(表2).

表2

特定受体和其他蛋白质与胶原蛋白IV、XV和XVIII NC1片段的相互作用

蛋白质相互作用NC1片段
受体
整合素类
    α1β1和α2β1所有NC1(IV)片段
    Α5β1, αv(v)β5和αv(v)β内皮抑素(Rehn等人,2001年)
    α6β1和αv(v)βα3NC1(IV)或肿瘤抑制素(Maeshima等人,2000b)
    αβ1和αv(v)β坎他汀(Kamphaus等人,2000年)
Glypican公司3内皮抑素(Karumanchi等人,2001年)
血管内皮生长因子-R2内皮抑素(Kim等人,2002年)
ECM蛋白
纤维蛋白1、纤维蛋白2、,
鸟巢成因2
内皮抑素和类内皮抑素(Sasaki等人,2000年)
Perlecan,层粘连蛋白1NC1(十五)和NC1(十八)(Sasaki等人,2000年)
基质金属蛋白酶-2内皮抑素(Kim等人,2000年;Lee等人,2002年)
细胞内蛋白质
原肌球蛋白内皮抑素(麦克唐纳等人,2001年)

综上所述,这些数据表明,NC1片段可能不仅参与血管生成的调节,还参与其他形态发生过程。

产生NC1片段的蛋白质水解途径

对于IV型胶原,尽管在血清中检测到不同的片段,但NC1片段生成过程中涉及的蛋白水解途径尚不清楚。对于胶原XV和XVIII,已经从组织匀浆中提取了几种不同的NC1片段,并且已经从人类血液滤液中分离出循环形式,这表明这些片段作为生理切割产物存在(John等人,1999年;Sasaki等人,1998年;Standker等人,1997年). 内皮抑素最初是从小鼠血管内皮瘤细胞系(EOMA)的条件培养基中纯化而成的20kDa片段,与肝素结合(O'Reilly等人,1997年). 对同一细胞系的体外研究表明,NC1铰链结构域包含基质金属蛋白酶(MMPs)和组织蛋白酶L的裂解位点。MMPs产生含有内皮抑素结构域的30kDa片段,而组织蛋白酶I直接且特异性地释放20kDa内皮抑素域(Felbor等人,2000年). 其他体外研究证实了这些结果,并表明在MMPs首次处理NC1后,内皮抑素的生成也由弹性蛋白酶介导(费雷拉斯等人,2000年;Lin等人,2001年;Wen等人,1999年). 在角膜上皮细胞中,MMP-7生成28 kDa NC1(胶原XVIII)片段(Lin等人,2001年). 因此,多种不同的蛋白水解途径可能参与不同组织中内皮抑素的生成。尽管我们有一些体外加工的线索,但生理途径仍需要更广泛的研究(图2B).

NC1片段的生物学功能和形态发生

胶原蛋白IV、XV和XVIII广泛存在于血管和上皮BM中,在不同门之间保存良好。有趣的是,NC1结构域的生物功能似乎在整个进化过程中都是保守的。在原始无脊椎动物中普通水螅,添加NC1(IV)改变形态发生,阻止细胞聚集发育(Sarras等人,1993年;Zhang等人,1994年). 在体外,NC1(IV)促进大鼠胚胎交感神经元的轴突而非树突生长(Lein等人,1991年)和六聚体NC1支持鸡神经嵴细胞的附着和迁移。相比之下,完整的IV型胶原二聚体不(Perris等人,1993年). 这些结果表明,NC1结构域支持的生物功能是构象依赖性的;IV型胶原的蛋白水解消化可能导致细胞和骨髓间新信号的隐秘位点的出现。

一种与XV-XVIII型胶原蛋白同源的胶原蛋白已在秀丽隐杆线虫。该基因NC1编码区缺失(电缆1)导致神经和非神经细胞的轴突导向和迁移缺陷。NC1的异位表达可以挽救这种表型,但内皮抑素不能(Ackley等人,2001年). 这些功能差异可以用NC1是三聚体来解释,而内皮抑素是单体。在类似的数据中,NC1(XVIII)抑制基质胶中内皮管的形成,并刺激内皮细胞和非内皮细胞的细胞运动。单体内皮抑素本身没有作用,但可以阻断NC1诱导的迁移。内皮抑素的人工低聚刺激细胞运动(Kuo等人,2001年)表明蛋白水解过程可能调节内源性NC1功能。NC1(XV)和内皮抑素样结构域没有观察到这些作用。这种缺乏活性可能并不奇怪,因为这些分子可能具有不同的活性光谱,这取决于运动信号的身份。

最近,小鼠内皮抑素被证明可以抑制HGF诱导的肾上皮细胞和输尿管芽的迁移和分支形态发生。这些过程取决于glypican3的存在。输尿管芽表达内皮抑素,添加中和性抗内皮抑素抗体可促进输尿管芽的生长和分支(Karihaloo等人,2001年).

因此,高水平的内皮抑素或类内皮抑素分子可能干扰不同的途径,下调形态发生过程。它们可能充当主导负配体,与与其天然分子相同的受体相互作用,从而抑制增殖和迁移,也可能与不同受体相互作用并诱导凋亡。它们也可能在与原始胶原三聚体相互作用并破坏它们时产生机械效应,导致BMs和细胞之间的锚定丢失。因此,NC1的差分退化构成了一个负反馈回路。

NC1片段在血管生成和肿瘤发生中的生物学功能

肿瘤抑制素和其他IV型胶原NC1片段

IV型胶原NC1片段的生物学功能最近在哺乳动物中得到了广泛研究。一种合成肽,包含α3链NC1结构域的183-205残基,并含有α3特有的SNS三联体,可特异性抑制多形核白细胞的活化(Monboisse等人,1994年). 该肽与CD47/α结合v(v)β整合素复合物,促进黏附和趋化,抑制多种人类肿瘤细胞系的增殖(Han等人,1997年;Shahan等人,1999a;Shahan等人,1999b;Shahan等人,2000年). 事实上,α3NC1和β3整合素之间的直接相互作用,独立于CD47,刺激黏着斑激酶(FAK)和PI 3-激酶磷酸化(Pasco等人,2000a). 此外,黑色素瘤和纤维肉瘤细胞对天然胶原IV或185–205α3NC1肽的迁移抑制与MT1-MMP和β3整合素亚基的表达降低以及活化膜结合MMP-2水平的降低相关(Pasco等人,2000b). MMP-2参与肿瘤的进展和转移,其激活依赖于MT1-MMP/TIMP-2复合物(Itoh等人,1998年;Kinoshita等人,1998年). 在体外,α3NC1片段降低支气管肿瘤细胞系中MT1-MMP的表达,185-205α3NCl肽通过[α1(IV)]抑制其侵袭2α2(IV)胶原蛋白(Martinella-Cutse等人,2001年). 总之,这些数据表明,IV型胶原抑制增殖、调节细胞粘附和运动的能力存在于NC1结构域。α3(IV)链与侵袭性癌细胞有特定的相互作用,与有利于迁移的α1和α2链相比,α3限制了侵袭性表型。因此,在肿瘤进展和转移的背景下,α3(IV)胶原链或α3NC1片段的存在可能对侵袭过程产生负面调节。有趣的是,在正常肺泡BM中表达α1、α2、α3、α4和α5(IV)胶原链的肺中,支气管肺泡癌的发生与α3、γ4和γ5链表达的缺失以及α1和α2链表达的增加相关(Nakano等人,2001年). 异三聚体[α1(IV)]2α2对不同癌细胞系的侵袭是允许的,并介导前MMP-2活化(Maquoi等人,2000年). 相比之下,α1NC1或α2NC1单体与TIMP-1有一些结构相似性体外抑制MMP-2和MMP-3对小合成肽底物的活性(Netzer等人,1998年). 因此,肿瘤发生过程中不同胶原链或NC1片段的存在可能是获得侵袭性表型的关键调控机制。

血管BM合成IV型胶原是血管生成的先决条件(Maragoudakis等人,1993年;Haralabopoulos等人,1994年). 此外,α1和α2 NC1诱导内皮细胞的粘附和扩散(Koliakos等人,1989年;Tsilibary等人,1990年). 根据这些观察结果和之前描述的数据,一些研究小组将注意力集中在NC1片段的潜在抗血管生成特性上。Kalluri的小组确定了α1、α2和α3 NC1的抗血管生成活性,分别命名为arresten、canstatin和tumstatin(科罗拉多等人,2000年;Kamphaus等人,2000年;Maeshima等人,2000b). 在体外,这些分子抑制内皮细胞增殖和迁移。肿瘤抑制素似乎是最有效的。正如185-205α3NC1肽所观察到的那样,所有NC1片段均未抑制癌细胞株的增殖,这表明这种作用依赖于NC1结构域的部分降解。Arresten、canstatin和tumstatin分子抑制血管生成:在体外,它们通过植入Matrigel的小鼠主动脉内皮细胞阻断管状结构的形成;在体内,它们阻止Matrigel塞中毛细血管的募集,并抑制小鼠异种移植模型中大小肿瘤的生长。布鲁克斯小组产生了类似的NC1片段,并在绒毛尿囊膜(CAM)分析中描述了α2、α3和α6 NC1的抗血管生成作用(Petitclerc等人,2000年). 然而,这些NC1片段在体外均未抑制癌细胞系或内皮细胞的增殖。

与arresten的结果相反,α1NC1片段没有观察到抑制作用。尽管在这两种情况下都使用了相同的哺乳动物表达系统来产生片段,但这些差异可能归因于使用了不同的内皮细胞类型和不同的肿瘤发生模型(小鼠的异种移植与绒毛尿囊膜上的肿瘤发展)。

参与这些功能的细胞表面受体是什么?很明显,整合素是NC1的关键靶点(表2). 肿瘤抑制素结合αv(v)β整合素以RGD非依赖性的方式,通过两个不同的位点相互作用,一个由肿瘤抑制素残基54–132组成的位点参与抗血管生成作用,而另一个由残基185–203组成的部位参与癌细胞系的抗增殖活性(Maeshima等人,2000a;Maeshima等人,2001b;Shahan等人,1999b). 内皮细胞(HUVEC或C-PAE)与tumstatin的粘附似乎也通过α6β1整合素结合(Maeshima等人,2000年b). 虽然众所周知,中心三螺旋结构域以及IV型胶原的NC1结构域通过α1β1和α2β1整合素(Eble等人,1993年;Setty等人,1998年)这些新结果表明,NC1结构域支持参与血管生成调节的新型整合素介导的细胞相互作用。有趣的是,IV型胶原蛋白也含有隐秘的整合素结合位点。在血管生成过程中,这些位点暴露并诱导整合素识别的转换,α1β1结合与α的增益v(v)β绑定(Xu等人,2001年)这可能是由于MMPs(如MMP-2)使IV型胶原变性并伴随降解所致(Eble等人,1996年).

就肿瘤抑制素而言,由α3NC1片段残基45–132组成的肽足以通过增加内皮细胞的凋亡来抑制体内外血管生成,其活性是内皮抑制素的十倍。由于该片段参与了Goodpasture综合征,因此删除了Goodparture表位(残基45-54),并且保留了抗血管生成的特性(Maeshima等人,2000a). tumstatin的作用不依赖于二硫键,并且位于一个25残基肽(残基74-98)中(Maeshima等人,2001a;Maeshima等人,2001b). 该肽在内皮细胞中特异性诱导的凋亡与通过负调控mTOR信号抑制cap依赖性翻译有关,并依赖于β整合素(Maeshima等人,2002年).

因此,IV型胶原的NC1结构域表现出控制各种细胞粘附、增殖或凋亡的特定调控亚结构域。这些亚结构域对内皮细胞或癌细胞的特异性非常有趣,尤其是在α3NC1的情况下。事实上,最近公布的IV型胶原NC1结构域的晶体结构揭示了具有两个同源亚结构域(N和C)的3D结构,每个链的这些亚结构域之间的主要差异发生在由N亚结构域中的残基86-95和C亚结构域的196-209组成的区域。奇怪的是,这些区域重叠了之前确定的两个序列,分别具有抗血管生成活性和癌细胞抗增殖作用。更准确地鉴定这些NC1结构域上的整合素结合位点将是一件有趣的事情。事实上,它们与整合素的相互作用可能涉及破坏内皮细胞或肿瘤细胞与基底膜之间的接触,导致这些细胞凋亡。它们还可能参与破坏IV型胶原网络组装过程中发生的C末端结合,并诱导该基质的紊乱,从而干扰细胞的迁移、增殖或存活。此外,tumstatin NC1结构域在调节新生血管形成方面的独特性质非常有趣,并提示了一个有前景的整合素依赖性血管生成抑制剂新家族。

NC1(XV)、NC1(XXVIII)、内皮抑素和内皮抑素样片段

自发现以来1997年O'Reilly及其同事内皮抑素一直是血管生成领域广泛研究、试验和争议的对象。在体外,内皮抑素抑制牛毛细血管内皮细胞的增殖,但不抑制癌细胞的增殖。在体内,它抑制CAM分析中的血管生成和各种原发性肿瘤的生长。此外,只要对小鼠进行治疗,就不会出现毒性、耐药性或肿瘤再生的迹象(O'Reilly等人,1997年). 另一个显著的效果是,内皮抑素在重复周期中给药时,使肿瘤在每个周期之间重新生长,仍然有效,并且根据肿瘤模型,在两到六个周期后诱导肿瘤长时间休眠而无抵抗力(Boehm等人,1997年). 迄今为止,多项研究已证明内皮抑素在肿瘤发生的病理模型中具有抗血管生成的特性(Bergers等人,1999年;Blezinger等人,1999年;Boehle等人,2001年;Dhanabal等人,1999年a;Kisker等人,2001年;Sorensen等人,2002年;Yoon等人,1999年),脉络膜新生血管(Mori等人,2001年)和关节炎(Matsuno等人,2002年;Yin等人,2002年). 然而,在可控的血管生成过程中,如伤口愈合,内皮抑素并不影响整个新生血管的形成。超微结构分析显示血管成熟过程中出现一些异常,但血管密度没有受到影响(Bloch等人,2000年;Berger等人,2000年).

缺乏胶原蛋白XVIII的小鼠肿瘤发生不受影响,这表明即使内皮抑素被检测为循环分子,生理水平也不足以减少肿瘤进展(Fukai等人,2002年). 相反,XVIII胶原是玻璃样血管正常退行和将玻璃体胶原纤维锚定到视网膜内界膜所必需的。因此,胶原蛋白XVIII可能起到守门人的作用,诱导非许可区域的血管退化以促进血管生成。尽管内皮抑素能有效减少脉络膜新生血管,但内源性内皮抑素的作用仍有待充分证明。

在大鼠主动脉或人静脉环血管生成试验中,Ex-vivo、内皮抑素减少并稳定微血管形成(Kruger等人,2000年;Ergun等人,2001年). 在体外,内皮抑素抑制基底细胞和FGF2或VEGF诱导的不同类型内皮细胞的增殖和迁移(Dhanabal等人,1999b;O'Reilly等人,1997年;Taddei等人,1999年;山口等,1999年;You等人,1999年). 从人血浆中纯化的循环形式缺乏12个N末端残基,并且不抑制增殖(Standker等人,1997年); 因此内皮抑素的抗增殖活性需要全长片段,但与锌或肝素结合能力无关(山口等,1999年). 可溶性内皮抑素通过改变Bcl-2表达诱导内皮细胞凋亡(Dhanabal等人,1999年c)以及诱导蛋白衔接子Shb的酪氨酸磷酸化(Dixelius等人,2000年).

内皮抑素的分子靶点尚不清楚。在呈指数增长的内皮细胞中,内皮抑素模拟血清剥夺,下调与增殖、凋亡和细胞迁移相关的基因的转录。有血清存在时,内皮抑素只影响内皮细胞的迁移(Hanai等人,2002年; Shirichi和Hirata,2001年)。

抑制迁移和存活是内皮抑素最稳定的功能。很明显,内皮细胞的迁移涉及结合整合素信号的局部粘连的组装和拆卸,内皮抑素似乎可以有效地干扰这两个系统。固定化内皮抑素促进和可溶性内皮抑素抑制α5β1和αv(v)β整合素依赖性内皮细胞迁移和存活(Rehn等人,2001年). 根据细胞类型和生长因子环境,可溶性内皮抑素对迁移的抑制与局部粘附和肌动蛋白应激纤维形成的增加或减少相关(Dixelius等人,2002年;Wickstrom等人,2001年). 抑制VEGF诱导的迁移诱导eNOS去磷酸化(Urbich等人,2002年). 此外,内皮抑素诱导尿激酶纤溶酶原激活物系统下调(Wickstrom等人,2001年)表明内皮抑素诱导的信号不仅改变了细胞骨架结构和生存信号,还影响了细胞周蛋白水解活性。

有趣的是,正如在IV型胶原NC1片段中观察到的那样,内皮抑素的一些功能可能会干扰MMP信号传导(有关综述,请参阅Egeblad和Werb,2002年). 事实上,内皮抑素已被报道通过Matrigel抑制内皮细胞和癌细胞的侵袭。这种作用似乎是通过与抑制MMP-2活化的MMP-2前体的结合来介导的(Kim等人,2000年). 最近的数据表明内皮抑素与MMP-2的催化结构域直接相互作用(Lee等人,2002年). MMP-2在从胶原XVIII生成内皮抑素片段时效率很低(费雷拉斯等人,2000年)但它可能是内皮抑素下调其他基质金属蛋白酶和蛋白酶表达或激活的关键靶点之一。

内皮抑素和VEGFR2之间的直接相互作用已在前面描述过(Kim等人,2002年). 这种相互作用可能是由于内皮抑素的基本特性,类似于VEGFR2与HIV-1的反式激活蛋白Tat之间的相互作用(Albini等人,1996年)。因此,内皮抑素可能主要通过干扰VEGF与其受体VEGF-R2和VEGF-R1的结合发挥作用**.

有关内皮抑素样分子的分子数据更为有限。已有报道抑制FGF2诱导的内皮细胞迁移,但不抑制其增殖。在肾细胞癌异种移植模型中,观察到肿瘤生长减少,但与内皮抑素相比,类内皮抑素没有引起任何退化(Ramchandran等人,1999年). 然而,在CAM测定中,只有内皮抑素样和NC1(XV)抑制VEGF诱导的血管生成,而FGF2诱导的血管生成仅被内皮抑素和NC1(XV)抑制(Sasaki等人,2000年). 因此,这些片段可能具有不同的抑制特性,这取决于它们的血管生成环境和运动信号,如前一段所述。这些数据与之前的观察结果相关,这些观察结果表明,VEGF和FGF2分别通过不同的整合素αvβ5和αvβ3调节其作用(Friedlander等人,1995年).

结论和展望

这些不同NC1胶原蛋白片段的详细生物学功能尚未完全确定,但它们影响的途径中的相似性令人担忧(表3). 作为固定化底物,来自IV、XV或XVIII胶原的NC1片段可以根据细胞类型诱导迁移、增殖或存活;然而,可溶性形式以相反的方式发挥作用,抑制增殖、迁移和诱导凋亡(图3). 这种消极和积极途径之间的平衡可能是高度受控的调控机制的一部分。在血管生成或分支形态发生等侵袭过程中,细胞需要迁移和增殖,这些过程依赖于蛋白酶活性。在这些过程的第一步中,基质的部分降解可能会揭开一些隐藏的位点,暴露出与细胞表面整合素结合的NC1固定结构域,并根据整合素模式激活不同的通路。细胞外基质的持续蛋白水解可能会释放局部高浓度的可溶性片段,然后作为主要的负性分子。它们可以抑制增殖和迁移,稳定新的血管或管状结构,或通过激活凋亡途径诱导这些新的小管完全退化。

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固定化与可溶性NC1和内皮抑素片段的生物活性。来自IV型、XV型和XVIII型胶原的固定化NC1结构域可诱导不同类型细胞的增殖、存活和迁移。这些效应与PI3K、FAK和paxillin磷酸化增加有关。相比之下,可溶性NC1或内皮抑素片段与细胞表面的各种受体结合,并降低PI3K、FAK和paxillin的磷酸化。内皮抑素和NC1(IV)诱导不同基因的转录降低。内皮抑素与VEGF-R2相互作用,从而减少VEGF与其受体的结合;内皮抑素还与MMP-2直接相互作用,抑制酶的激活。总之,这些可溶性片段的作用与其原始分子相反,对不同细胞类型的增殖和迁移产生负调控,并诱导细胞凋亡和细胞外基质紊乱。

表3

IV、XV和XVIII胶原蛋白的NC1和NC1片段的功能

归纳抑制
胶原蛋白IV
固定NC1癌细胞系(α3)的粘附性和趋化性(Han等人,1997年;Shahan等人,1999a;Shahan等人,2000年)
FAK和PI3K磷酸化(α3)(Pasco等人,2000a)
可溶性NC1(α1和α2链)交感神经元的轴突生长(Lein等人,1991年)Hydra再生(Sarras等人,1993年)白细胞活化(a3)(Monboisse等人,1994年)
鸡神经嵴细胞(α1和α2)的粘附和迁移(Perris等人,1993年)癌细胞系(α3)的增殖和迁移(Han等人,1997年;Shahan等人,1999a;Shahan等人,2000年;Pasco等人,2000b)
内皮细胞的粘附和扩散(α1和α2)(Koliakos等人,1989年;Tsilibary等人,1990年)MMP-2和MMP-3激活(α1、α2和α3)(Netzer等人,1998年;Pasco等人,2000b)
内皮细胞凋亡(54–132 aa肽α3)(Maeshima等人,2001a)内皮细胞(α1、α2和α3)的增殖和迁移(科罗拉多等人,2000年;Kamphaus等人,2000年;Maeshima等人,2000a;Maeshima等人,2001a)
体外血管生成(α1、α2和α3)(科罗拉多等人,2000年;Kamphaus等人,2000年;Maeshima等人,2000a)
FGF2诱导的绒毛尿囊膜血管生成(α1、α2和α6)或VEGF诱导的(α2)(Petitclerc等人,2000年)
肿瘤血管生成(α1、α2和α3)(科罗拉多等人,2000年;Kamphaus等人,2000年;Maeshima等人,2000a;Petitclerc等人,2000年)
蛋白质合成cap依赖性(54–132 aa肽α3)(Maeshima等人,2002年)
胶原蛋白XV
可溶性单体类内皮抑素减少肿瘤生长(Ramchandran等人,1999年)FGF2诱导的内皮细胞迁移(Ramchandran等人,1999年)
绒毛尿囊膜血管生成VEGF诱导(Sasaki等人,2000年)
NC1三聚体绒毛尿囊膜血管生成FGF2和VEGF诱导的血管生成(Sasaki等人,2000年)
胶原蛋白XVIII
可溶性内皮抑素内皮细胞凋亡(Dhanabal等人,1999b)FGF2或VEGF诱导的内皮细胞增殖和迁移(O'Reilly等人,1997年;山口等,1999年;You等人,1999年;Taddei等人,1999年;Dhanabal等人,1999年a)
肿瘤消退(O'Reilly等人,1997年;Boehm等人,1997年)肿瘤血管生成(O'Reilly等人,1997年;Boehm等人,1997年;Bergers等人,1999年;Blezinger等人,1999年;Boehle等人,2001年; Dhanabel等人,1999b;Kisker等人,2001年;Sorensen等人,2002年;Yoon等人,1999年)
基因转录的下调(Shirichi和Hirata,2001;Hanai等人,2002年)脉络膜新生血管(Mori等人,2001年)
内皮细胞G1期阻滞(Hanai等人,2002年)关节炎(Matsuno等人,2002年;Yin等人,2002年)
微血管的体外稳定(Ergun等人,2001年)大鼠主动脉或人静脉环血管生成测定中的微血管形成(Kruger等人,2000年;Ergun等人,2001年)
FGF2诱导的绒毛尿囊膜血管生成(Sasaki等人,2000年)
神经细胞和非神经细胞在秀丽线虫(Ackley等人,2001年)
肾上皮细胞的迁移和分支形态发生(Karihaloo等人,2001年)
FAK磷酸化、局灶粘附和肌动蛋白应激纤维形成生长因子诱导(Dixelius等人,2002年;Wickstrom等人,2001年)
通过Matrigel侵入内皮细胞和癌细胞(Kim等人,2000年)
已固定
单体内皮抑素内皮细胞扩散,FAK磷酸化(Rehn等人,2001年)
NC1三聚体内皮细胞和非内皮细胞的细胞运动(Kuo等人,2001年)Matrigel中的内皮管形成(Kuo等人,2001年)

有趣的是,这些片段的活性依赖于整合素或蛋白多糖的激活,例如内皮抑素中的glypicans。整合素αv(v)β是IV型胶原、XV和XVIII NC1片段和内皮抑素的常见配体。在缺乏β的小鼠中整合素、肿瘤血管生成以及VEGF或低氧诱导的血管生成增强,提示整合素在限制体内血管生成中的作用(Reynolds等人,2002年). 不同NC1片段的抗血管生成活性依赖于与β的结合整合素也可能支持这一假设。在这种情况下,NC1片段–β-整合素相互作用可能是这种负反馈的关键调节器。这些胶原片段生物活性的另一个特征是基因表达下调:IV型胶原α3NC1结构域和内皮抑素降低了参与细胞周期调节、迁移和存活的各种基因的表达。然而,这些活性似乎与环境因素有关,不同片段的抗血管生成活性可能取决于局部释放的生长因子的特异性和浓度。

除了β3整合素外,这些片段的另一个共同靶点是MMP-2。在内皮抑素的情况下,已经显示出与催化结构域的直接相互作用。对于内皮抑素样结构域和IV型胶原α3NC1结构域,这种相互作用尚未被证实,但这三种分子诱导MMP-2膜结合活性降低,这可能是前面提到的负反馈回路的一部分。在XV型胶原敲除小鼠中也观察到原-MMP-2活性的基础水平降低(Eklund等人,2001年). 此外,一些基质金属蛋白酶参与片段本身的生成。因此,在血管生成等过程中,MMPs的蛋白水解活性可能是双相调节的一部分:早期促血管生成,对基底膜破裂和内皮细胞迁移至关重要,晚期抗血管生成,产生内源性抑制剂片段。

来自较大前体蛋白的内源性抑制剂或激活剂现在似乎是重塑过程中的一个共同主题。如果内皮抑制素或肿瘤抑制素最近因其强大的抗血管生成潜能而受到更多关注,那么很明显它们的活性对微血管内皮细胞来说并不是特定的,但这项工作为这些普遍存在的胶原蛋白分子潜在的隐秘生物功能开辟了新的兴趣。因此,这些研究可能不仅在癌症方面很有趣,而且考虑到与胶原蛋白相关的大量疾病,在许多其他人类疾病中也很有趣。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院(NS39278,CA72006,AR46238)的资助,桑德勒家庭维持基金会的资助,以及成骨不全基金会的奖学金。由于篇幅有限,我们未能引用该领域的许多重要和相关研究,对此我们深表歉意。我们感谢布莱尼·怀斯曼对手稿的批判性阅读。

脚注

α1至α6多肽由三组基因编码,第4a1列/第4a2列,第4a3列/第4a4列第4a5列/第4a6列,分别映射到人类13、2和X染色体,以及小鼠8、1和X染色体。每对基因都在染色体上首尾相连地组织起来,它们的表达由位于基因之间的双向启动子调控。

按照奥尔森和尼诺米娅的提议(Olsen和Ninomiya,1999年),胶原XV和XVIII的非胶原结构域从C末端结构域开始编号,与胶原IV相同。

§为了一致性,我们将使用术语“内皮抑素”来表示胶原XVIII,使用术语“类内皮抑素(endostatin like)”来表示胶原蛋白XV。

NC1结构域和TIMP-1的同源性已使用基于序列的方法进行了描述(Netzer等人,1998年)但值得注意的是,最近的X射线晶体学数据发现,NC1结构域的结构不同于任何其他已知结构的蛋白质(Sundaramoorthy等人,2002年;Than等人,2002年),未报告此同源性。

**作者还提到了与VEGF-R1的相互作用(Kim等人,2002年).

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