真核转录机器的蛋白质组学：用多维质谱鉴定与酵母TFIID组分相关的蛋白质

生物化学方法。

亲和纯化多克隆抗体已在前面描述过(45,46)和免疫沉淀（IP）如前所述(45). 酵母全细胞提取物（WCE）的制备（来自菌株YSLS18和BY4741）和WCE的Bio-Rex 70色谱法均如前所述进行(46). 除非另有说明，否则所有操作均在4°C下进行。对于免疫纯化，首先将200μg亲和纯化的多克隆抗体或对照抗体交联至100μl蛋白A-Sepharose（Sigma）。作为对照，使用了两种非特异性兔和两种小鼠单克隆抗体（MAbs），即抗HA（12CA5；Roche）和抗Flag（M2；VWR Scientific）。向1 M Bio-Rex 70馏分的一部分中添加缓冲液a/0（20 mM HEPES-KOH[pH7.6]，10%[vol/vol]甘油，1 mM二硫苏糖醇，0.1 mM苯甲基磺酰氟，1 mM苯甲脒）和Nonide P-40（NP-40[表面安培等级]；Pierce Chemical），以便在用缓冲液a/O（BA/0）稀释后蛋白质溶液的电导率相当于含有300 mM醋酸钾的BA（BA/300）(45)NP-40的最终浓度为0.1%（vol/vol）。为了防止蛋白质沉淀，在用BA/0稀释之前添加NP-40。然后将溴化乙锭（Bio-Rad）添加到稀释的1 M Bio-Rex 70馏分中，使最终浓度达到10μg/ml(45)，然后将相当于1 ml初始未稀释的1 M Bio-Rex 70分数的该稀释1 M Bio-Rex 70分数的量（通常为2至2.5 ml）与珠结合抗体混合，并在4°C的倾斜板上混合12至14 h。树脂收集在微球蛋白柱（Bio-Rad）中，并用BA/300加0.1%NP-40进行广泛清洗。为了从珠状结合抗体-抗原复合物中洗脱蛋白质，用200μl BA/300加上6 M尿素和0.1%NP-40（以达到4 M尿素的最终浓度）将树脂制成泥浆，然后在室温下在倾斜板上培养30分钟。在微型离心机中快速旋转收集洗脱材料，将其冷冻在干冰上，并储存在−80°C下。通常，同时处理5到15个独立的免疫纯化。

DALPC公司。

用新制备的三氯乙酸（TCA；Sigma）沉淀免疫纯化蛋白复合物（50至100μl）中的蛋白质。首先，混合添加0.11×体积的100%（wt/vol）TCA；然后将样品在冰上培养10分钟，添加500μl冷的10%（wt/vol）TCA，并在冰上继续培养10分钟。通过离心（15000×克，10分钟旋转），用500μl丙酮冲洗颗粒并如上所述离心，然后将丙酮吸走。使用Speed-Vac去除残留丙酮，并将蛋白质颗粒重新悬浮在100 mM碳酸氢铵-5%乙腈中。然后通过添加0.1倍体积的50 mM二硫苏糖醇来减少蛋白质，然后在65°C下孵育30分钟。然后，通过添加0.1×体积的100 mM碘乙酰胺将胱氨酸烷基化，然后在30°C下在黑暗中孵育30min。用0.5μg改良序列级胰蛋白酶（Promega）在37°C下隔夜消化还原和烷基化蛋白质。使用RP盒（加利福尼亚州奥本市Michrome Biorresources）对色氨酸肽进行脱盐、冻干，并在0.5%乙酸中重新溶解。将整个肽混合物加载到75μm内径的SCX柱（Partisphere SCX；Whatman）上，该柱在0.5%乙酸-2%乙腈中平衡，并通过增加盐阶梯度0、10、20、30、40、60、80、，和100%溶液B（250 mM醋酸铵、0.5%醋酸、2%乙腈）。该洗脱方案之后，再进行两步洗脱：首先用500 mM KCl-0.5%乙酸-2%乙腈，然后用1 M NaCl-0.5%乙酸-2%乙腈。在整个运行过程中，柱洗脱流速保持在1μl/min。通过使用自动取样器（FAMOS；LC填料），将每个部分（6μl中的5个）分别加载到在0.5%乙酸中平衡的75μm内径RP-HPLC柱（Poros R2；Perceptive Biosystems）上，使用0至40%乙腈的线性梯度洗脱60 min，然后使用40至60%乙腈以0.5μl/min的流速洗脱10 min。使用离子阱质谱仪（LCQ Deca；ThermoFinnigan）直接通过ESI-MS/MS分析RP-HPLC柱洗脱液中的肽配备微电子喷雾源（马萨诸塞州阿灵顿市詹姆斯·a·希尔仪器服务公司）。根据酿酒酵母使用SEQUEST算法打开阅读框架数据库（斯坦福大学SGD）(15).

验证DALPC方法。

DALPC对41个独立免疫纯化反应的分析产生了354700 MS/MS光谱。经分析，这些质谱鉴定出1272个不同的开放阅读框（ORF）。根据材料和方法中的详细说明，对这些数据进行汇编以进行分析。为了确保数据集的可靠性，为每种抗体生成了多种免疫纯化蛋白制剂（4种对照抗体和15种不同的抗TFIID亚单位IgG；总共19种不同的抗体），免疫纯化反应来自独立生成的1 M Bio-Rex 70组分。图​图2A2安培总结了对用15种抗TFIID亚单位特异性抗体的整个集合进行免疫纯化的蛋白质进行的单一完整DALPC分析。该表列数据是图的SDS-PAGE分析的质谱关联。​图1C1摄氏度.

为了证明该方法的有效性，我们首先分析了我们的DALPC蛋白质数据，以特异和准确地鉴定已知的蛋白质(45)因此预测在免疫纯化组分中存在（图。​（图2）。2). 最初的DALPC输出被报告为与每个ORF显著相关的独立肽的数量，这里称为肽命中(35). 在所有抗TBP、抗TAF IgG免疫纯化组分中，以与每个蛋白质的分子量密切相关的方式，可重复鉴定与TFIID亚单位对应的肽命中（图。​（图2A2安培和图。​图3）。三). 相反，TFIID亚单位仅在对照组中零星鉴定，这一发现与免疫纯化的高特异性相一致，最多观察到一个或两个肽命中（图。​（图3三和以下）。重要的是，对于所有TFIID亚单位，抗TBP IgG、抗TAF IgG和对照IgG免疫纯化组分之间的肽命中差异具有统计学意义（见下文和图。​图3）。三). SAGA亚基在共享TAF（TAF90p、TAF61p、TAF-60p、TAF25p和TAF17p）中特异性鉴定，在较小程度上在抗TBP组分中鉴定（图。​（图2A2安培和图。​图4B）。4B类). 总之，我们的DALPC和免疫印迹数据（未显示）首次直接证明内源性TBP可以稳定地与天然SAGA全复合物的所有已知成分相关联。抗TAF17p和抗TBP IgG纯化组分中SAGA的数量略有减少（图。​（图2A2安培和​和4B）4B类)与免疫印迹法一致（数据未显示）。

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图4。

新SAGA亚基的鉴定。（A） DALPC在STAF组分中鉴定的蛋白质按其得分排序。意义(P（P）)比较每种蛋白质的STAF和TFIID-S评分的计算t值的百分比是通过逐步多元排列检验确定的(n个₁= 10,n个₂= 19, α = 0.05). 仅显示具有显著t值的蛋白质；候选SAGA亚基被遮蔽。α值为0.05（>95%置信度；如图所示）和0.1（>90%置信度）时获得了相同的结果，这表明除了列出的亚基之外，还有其他新的SAGA亚基的可能性很低。（B） 用于鉴定在共享TAF级分中富集的蛋白质的DALPC肽命中输出，说明了这些数据的特异性（即TFIID-S命中；左）和再现性（STAF）。肽命中丰度传奇如图所示。​图3。三.（C）由编码的候选亚单位YCL010C型,YGL066W型、和UBP8（UBP8）与SAGA相关。使用从未标记野生型菌株（−）或含有指示HA-标记等位基因的菌株（顶部）制备的WCE进行抗-HA IP。对每个输入（In，2%）和沉淀（P，25%）的一部分进行免疫印迹，以检测指示的蛋白质（左）。从同一印迹的四个独立暴露中检测到单个HA标记蛋白（底部）；检测每个蛋白质的输入和沉淀（top）来自相同的暴露。

为了直接测试DALPC方法的精确度，分析了三种独立的抗TAF30p-IgG免疫纯化制剂中是否存在已知的含TAF30p的复合物，包括TFIID、RNAP II全酶、Swi/Snf、NuA3和INO80染色质重塑复合物(8,24,27,48; X.Shen和C.Wu，未公布数据；另请参见下文）。图中所示的数据。​图2B2B型证明在列出的TAF30p-相关蛋白中，85%在三个独立分析中被鉴定，97%在三个单独分析中的两个中被鉴定。同样，在特定样品中，蛋白质的分子量和该蛋白质的肽命中数之间存在很强的相关性。我们从这些数据中得出结论，我们的方法可以用于准确、准确、具体地定义TBP和TAF相关因素。

DALPC数据评分。

建立了我们方法的有效性后，我们接下来寻求开发一个系统，通过识别在一组免疫纯化组分与第二组组分中富集具有统计学意义的蛋白质，从而对DALPC数据进行无偏见分析（图。​（图3）。三). 这样一个无偏见的评分系统将使我们能够更有效地集中精力，通过识别关联概率最高的蛋白质来独立验证任何新发现。为了给蛋白质评分，我们首先利用我们对上述分子量和肽命中之间的密切关系的观察。首先给出DALPC在一组特定免疫纯化组分中识别的蛋白质，并根据将肽命中平均数归一化为同源蛋白质分子量的分数进行排序。通常计算两个分数。在本例中，生成总的控制IgG评分，然后计算总的TFIID-IgG得分。因此，如图。​图3，三，我们计算了9个对照免疫纯化反应中15个TFIID亚基中每一个亚基的识别控制分数。同样，计算TFIID得分（图。​（图3，三，公式和列出所有分数的表格）。两个分数的统计分析（或者n个，样本量太小，两个分数的比值；然后进行鉴定，以确定具有显著不同分数的蛋白质，从而确定相对于第二组分数（即对照核心）在一组分数（如TFIID-特异分数）中显著富集的蛋白质（见图。​图3，三，表P（P）值）。

关于这个蛋白质评分系统，可以进行一些重要的观察。首先，TFIID复合物的所有已知亚单位（以及分析的其他复合物；见图。​图4A4A级和​和7A第7章和表​表2）2)得分相似。其次，与SDS-PAGE检测到的主要多肽一致（图。​（图1C），1摄氏度)，TFIID亚单位通常是每个抗TBP和抗TAF IgG免疫纯化组分中最核心的蛋白质。第三，抗TBP和抗TAF组分中单个TFIID亚单位的得分反映了我们对TFIID子单位化学计量比的估计（S.L.Sanders、K.A.Garbett和P.A.Weil，提交出版）。因此，虽然来自特定组分的特定蛋白质的分数不是其丰度的绝对度量，但该分数通常反映了其在该特定（组分）组分内的相对丰度。

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图7。

TBP与RSC染色质重塑复合物的相关性。（A） 在三种独立生成的抗TBP IgG免疫纯化制剂中，有三种由DALPC鉴定的蛋白质按TBP评分的降序排列；显示了TBP/TFIID得分比大于4的患者。星号表示已知的RSC亚单位；新的RSC候选亚基被遮蔽。（B） DALPC肽用于鉴定富含抗TBP IgG纯化组分的蛋白质。蛋白质按分子量递减的顺序列出。图例如图所示。​图3。三（C）TBP与RSC的关联。用WCE进行IPs，WCE由顶部和对照（泳道C）、抗TBP（泳道T）或抗TAF67p（泳道67）抗体指示的具有相关基因型的菌株制备。对输入（In，2%）和沉淀（P，20%）的百分比进行免疫印迹，以检测指示的蛋白质（左）。（D） TBP与RSC的相互作用。一种由携带RSC的酵母菌株制备的WCEMYC-RSC1型和HA-RSC2型基因被用于2或5μg大肠杆菌-与谷胱甘肽琼脂糖结合的衍生重组GST或GST-TBP。通过考马斯蓝染色（凝胶）或免疫印迹（Blot）观察25%的每种沉淀物，以检测所示的蛋白质。输入等于2%。（E） 几个候选亚单位与RSC相关。如图图例所示，使用抗HA MAb 12CA5 IgG进行IP。​图4B4B类用表达所示HA标记基因的酵母菌株制备的WCE（顶部）。输入等于4%，沉淀等于20%。注意，与输入相比，Sth1p在沉淀中的迁移速度较慢；这种行为的原因尚不清楚。

新SAGA亚基的鉴定。

为了测试我们的评分系统的有效性和实用性，我们试图鉴定SAGA复合体的新亚单位，因为高纯度SAGA制剂中存在几种未知多肽(20). 通过DALPC对五个共享TAF免疫纯化组分（763 ORF）中的每个蛋白质进行第一排序，确定候选SAGA亚基。在该列表中，共享TAF（STAF）与TFIID-特异（TFIID-S）TAF组分中只有12个蛋白质在统计学上显著富集（>95%置信度）P（P）值图。​图4A）。4A级). 正如预期的那样，所有9个非TAF SAGA亚单位在分析中得分都很高。然而，另外三种蛋白质，即由两个无特征ORF编码的蛋白质，YCL010C型和YGL066W型，编码推定的29和73kDa蛋白（此处分别称为Sgf29p和Sgf73p，表示29和73kDa的SAGA相关因子），以及推定的泛素特异性蛋白酶（或去泛素化酶）Ubp8p(2)得分与已知SAGA亚单位相同或更高。这些数据表明，这三种蛋白质可能是SAGA复合物的新成分（图。4A和B). 鉴于最近将蛋白质泛素化和转录控制联系在一起的研究，SAGA泛素蛋白酶亚基的鉴定尤其令人感兴趣(26,51). 非TAF SAGA组件的特性（除TRA1公司)编码这三种候选蛋白的基因都不是酵母细胞生存所必需的(11).

为了独立测试这些候选亚单位与SAGA的相关性，我们生成了表达HA（流感血凝素）表位标记的基因组等位基因的菌株，这些基因编码假定的SAGA亚单位，从这些菌株中制备WCE并进行共免疫沉淀（Co-IP）分析。具有抗HA MAb 12CA5特异性免疫沉淀SAGA亚基Tra1p、Gcn5p、Ada2p、TAF61p、TAF17p和TAF90p的每个标记候选蛋白的IP，但不包括TFIID特异亚基TAF130p、TAF 67p或TAF19p（图。​（图4C4摄氏度和数据未显示）。此外，当Gcn5p特异性抗体用于免疫纯化-DALPC时，所有三个候选蛋白的得分再次与已知的SAGA亚单位相似（未显示）。总之，这些数据强烈证明Sgf73p、Sgf29p和Ubp8p确实是酵母SAGA复合物的新成分。还需要进一步的工作来阐明这些新亚单位在SAGA功能和基因调控中可能发挥的确切作用。

DNA-结合转录因子与TFIID的关联。

对DALPC数据的分析未能表明存在任何先前未知的积分、化学计量TFIID亚单位（数据未显示）。然而，通过免疫纯化-DALPC（图。​（图5A）。5A级). 在这些候选的TFIID相关因子中，有参与信号转导、RNA处理和转录的蛋白质，包括已知的TFIID-相关的溴代多巴胺激酶Bdf1p(38)（图。​（图5A）。5A级). 目前正在对一些新的关联进行进一步的描述。特别令人感兴趣的是，鉴于TFIID功能的共激活因子模型（见上文引言），鉴定了几种DNA结合反式激活蛋白（Rtg1p、Cst6p和Swi6p）。我们将重点放在Swi6p上进行更详细的分析，因为研究表明TAF17型(塔夫17W133^琥珀色或塔夫17)在酵母细胞中与正常非必需基因的缺失结合时是致命的SWI6系列(37)基因。结合我们的DALPC结果，这些数据表明Swi6p部分通过与含TAF17p的复合物相互作用发挥作用。重要的是，即使在允许的温度下，塔夫17细胞显示Swi6p依赖性基因转录缺陷(37). 基于这种行为，我们推断Swi6p与C末端截短的含TAF17p的TFIID复合物之间的相互作用塔夫17突变细胞可能受到损害。

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图5：。

推测TFIID-相关蛋白。（A） 在用抗TBP和抗TAF IgG产生的免疫纯化制剂中通过DALPC鉴定的蛋白质通过TFIID评分进行排名。意义(P（P）)TFIID和对照组得分的计算t值的比较通过逐步下降多元排列测试确定(n个₁= 9,n个₂= 32, α = 0.1). 仅显示具有显著t值（90%置信水平）的非TFIID亚单位蛋白；在八个或九个（共九个）对照组分中鉴定的背景蛋白没有出现。酵母蛋白质组数据库中列出的功能分类(11)显示。（B） Swi6p-TFIID关联依赖于TAF17p。免疫沉淀由对照（C道）、抗TAF65p（65道）、反TAF61p（61道）或抗TAF67p（67道）抗体与WCE制备而成TAF17开关6-HA_三(TAF17型)单元格或taf17 SWI6-HA_三(塔夫17)细胞在允许的温度（30°C）下生长。用适当的抗体对部分输入（2%）和沉淀（67%）进行免疫印迹，以检测所示的蛋白质（左）。输入物和沉淀物中TAF40p的检测来自同一斑点的独立暴露。

为了直接验证Swi6p与TFIID相互作用的假设，我们在TAF17型野生型细胞和塔夫17Co-IP分析的突变细胞。为此，我们产生了两种酵母菌株，基因型TAF17型或塔夫17都携带HA_三-标记的基因组拷贝SWI6系列WCE由这两种酵母菌株制备而成，并用于Co-IP研究（图。​（图5B）。5亿). TFIID的Swi6p和TAF40p亚单位都是从TAF17型WCE与抗TFIID亚单位特异性抗体。相反，与免疫共沉淀TAF40p的量相比，Swi6p可重复减少50%至80%，这与TFIID相关塔夫17电池（图。​（图5B）。5亿). Swi6p和TFIID之间的关联性丧失并不是由于TFIID含量或完整性在塔夫17自holo-TFIID水平以来的菌株，包括正常量的TAF60p（参见参考文献17)，在中类似TAF17型和塔夫17细胞，根据额外的Co-IP研究判断（数据未显示）。TFIID和Swi6p之间的相互作用很可能是直接的，尽管这一假设需要进一步研究。这些数据首次证明了体内反式激活子和天然TFIID复合体之间的突变敏感相互作用，并进一步证明Swi6p反式激活至少部分是通过与某些Swi6p-依赖基因上的TFIID复合物的相互作用介导的。

免疫纯化-DALPC数据的适当解释。

我们在这里生成了一个可以与GTF TFIID成分相关的蛋白质目录。令人欣慰的是，我们通过独立手段广泛研究的免疫纯化-DALPC鉴定的每一种相互作用都得到了验证。然而，尽管取得了这一成功，但重要的是要认识到，进行这种额外的生物化学测试以及在可能的情况下进行相互作用的基因测试（即图。​图4C，4摄氏度,​、5B、，5亿,​,6,6、和7C至E)并在评估和解释免疫纯化-DALPC数据时包括蛋白质功能的当前知识。例如，我们的分析表明，Spt4p可能是一个假定的TFIID相互作用因子（图。​（图5A）。5A级). Spt4p和Spt5p共同构成DSIF伸长率(23,54); 因此，我们可能期望Spt5p作为TFIID相互作用因子得分。然而，我们发现Spt5p基本上用我们测试的每一种抗体进行了非特异性免疫纯化；Spt5p通常产生0.855和1.208的控制分数和TFIID分数(P（P）> 0.3). 尽管仍有可能有一部分Spt4p与TFIID相互作用而不依赖于Spt5p，但这种相互作用的验证需要进一步的详细调查，目前看来不太可能。显然，与其他高通量、基础广泛的筛查方法一样，如全球双杂交筛查(52)或全球染色质IP分析(49)，必须对免疫纯化-DALPC数据应用额外的生化和遗传过滤器，以充分阐明任何新连接的功能重要性。然而，应该注意的是，与蛋白质芯片等筛选方法相比，我们的方法具有显著优势(58)或全局双杂交分析，因为蛋白质相互作用是在多子单元组装的本地上下文中定义的，而不是通过单个成分之间的成对相互作用。

免疫纯化-DALPC方法的一般适用性。

这里使用的方法鉴定新的TBP-和TAF-相关蛋白酿酒酵母应该普遍适用于各种各样的生物问题和系统，而不管遗传工具的可用性如何。虽然我们在这里使用了分离提取物进行免疫纯化，但直接从WCE进行免疫纯化-DALPC的初步实验产生了与所述结果非常相似的结果（未显示）。产生多克隆抗体的相对容易以及针对已知因子的大量商用抗体使得免疫纯化成为常规应用。在我们的实验室中，我们利用固定化抗原柱直接从免疫血清中产生毫克数量的高度特异性纯化的IgG，其质量足以通过单一亲和纯化步骤进行免疫纯化。基于多克隆抗体的免疫纯化的一个明显替代方案是利用表位或其他亲和标记。然而，我们发现每个单克隆抗体都有其独特的（有时是高度的）非特异性蛋白结合模式。此外，我们观察到标签的可访问性因蛋白质和标签而异，从而使纯化物流和数据解释复杂化。相比之下，在我们实验室生成和测试的25种以上不同多克隆抗体中，只有两种（其中一种是抗TAF40p IgG）不能有效（>70%）免疫沉淀适当的抗原。此外，在后生动物系统中（与酵母不同），标记的蛋白质经常过度表达，并且/或者不是细胞中蛋白质的唯一来源。这些条件可能使真正天然络合物的表征复杂化。最后，由于大多数真核生物系统没有简单的互补测试方法，因此很难甚至不可能确定标签本身不会使蛋白质功能失活。由于这些原因，我们认为我们的多克隆免疫纯化方法可以得到最广泛的应用。

我们发现，成功的免疫纯化DALPC分析的最关键组成部分是用于免疫纯化的抗体的质量。如上所述，我们认为针对全长重组蛋白产生的多克隆抗体提供了最普遍适用的免疫纯化方法。然而，当使用多克隆抗体时，确保抗体的特异性并在解释免疫纯化-DALPC数据时考虑这一点是绝对必要的。例如，SDS-PAGE（图。​（图1）1)抗TAF19p IgG免疫纯化组分的DALPC分析表明，大量非TFIID蛋白与TAF19p相关。然而，含有TAF19p和TAF19p的复合物的进一步生化表征并不支持这一假设（数据未显示）。为了解决这一差异，我们同时使用多克隆抗TAF19p IgG或MAb抗HA IgG进行免疫纯化，利用从酵母菌株制备的Bio-Rex 70 1 M组分，其中基因组拷贝为TAF19型是HA_三已标记。对所得两个免疫纯化组分的SDS-PAGE和DALPC分析表明，使用抗-HA进行免疫纯化，与使用抗TAF19p多克隆IgG进行免疫纯化相比，主要仅纯化TFIID（数据未显示）。表观TAF19p相关蛋白补体的差异不是由于表位可及性，因为总TAF19p~70%是用每种抗体从Bio-Rex 70组分中免疫纯化的。因此，尽管进行了亲和纯化，但这种特殊的多克隆抗TAF19p IgG对TAF19p没有显示足够的特异性。也许这种抗体可以识别组蛋白折叠结构域、TAF19p的关键结构元素、其他几种TAF和无数其他蛋白质(50)在中平底锅-特定时尚；或者，这种特殊抗体可能只是显示出比其他抗体更低的特异性。我们得出结论，高度特异性抗体对可靠的免疫纯化-DALPC分析至关重要。

然而，值得注意的是，我们的多克隆抗TAF19p IgG制剂几乎肯定是一种特殊情况。首先，我们所有其他抗体的“表现”更为特异和可重复（参见图。​图22到​到77和表​表2）2) (29,46; 数据未显示）。其次，我们通过上述方法独立测试了另外两种多克隆抗体对多克隆TAF19p IgG的特异性。因此，我们比较了TFIID通过针对两个TFIID特异亚单位TAF130p和TAF48p的多克隆抗体进行免疫纯化时与TFIID相关的蛋白质群，以及使用MAb（抗HA MAb 12CA5）免疫纯化TFIID时检测到的相关蛋白质。在这些实验中，我们使用了两株同源酵母菌株：一株表达HA标记的TAF130p作为TAF130p的唯一来源，另一株表达HA_三-TAF48p的标记版本。重要的是，四个衍生免疫纯化蛋白组分的DALPC分析检测到的蛋白质基本相同（未显示）。这些数据清楚地表明，我们的多克隆抗体显示出适当的高度特异性和选择性，也强调了免疫纯化-DALPC方法的威力和有效性。

免疫纯化-DALPC方法与其他蛋白质组学方法的比较。

在对这项研究进行综述的同时，出现了另外两份报告，描述了全球蛋白质组学方法，以系统地识别和编目酵母多蛋白复合物(18,25). 这些研究人员使用了串联亲和纯化（TAP[41])或标志_x3个-用于鉴定和纯化酵母蛋白质或蛋白质复合物的标记策略。与我们的DALPC方法相关的这些研究结果的几点值得注意。

首先，在更全面的研究中(18)试图标记1739个不同的基因，只有589个基因或蛋白质被成功标记和纯化。该结果表明，<34%的分析靶基因可以成功标记并随后纯化。据推测，由于上述原因，这些作者获得了如此低的成功率，即标签致命性和（TAP−）标签不可获得性；使用多克隆抗体，就像我们的DALPC方法一样，这两个问题都不相关。第二，两组均使用SDS-PAGE分馏和带切除来生成样品，以便通过质谱鉴定蛋白质。这种方法大大增加了分析589个TAP标记基因或蛋白质（20946个单独的质谱样品）所需的质谱运行次数[18])或600个标记的基因或蛋白质（15683个质谱样品[25]). 使用免疫纯化-DALPC，分别只有589或600个样本需要分析（尽管很可能重复=～1200个样本）。因此，DALPC也更有效。第三，背景污染多肽群，主要由非常丰富的细胞蛋白质组成（糖酵解和一般代谢酶、单链核酸结合蛋白、核糖体和相关翻译蛋白）在这两项研究中非常相似，并且基本上是我们在免疫纯化-DALPC分析中检测到的同一组蛋白质。第四，尽管我们尚未对这两个数据集进行完整的比较分析，但似乎在大多数情况下，如果两个组都标记并分析了相同的基因或蛋白质，那么在鉴定相同的假定毒饵相互作用蛋白集时，它们之间的平均一致性小于50%。这个统计数据表明，用遗传学的说法，两种蛋白质的相互作用屏幕都还没有饱和。最后，当这些工作者碰巧标记并分析了编码TFIID或SAGA亚单位的基因时（在Ho等人[25],GCN5号机组; Gavin等人[18],TAF150/TSM1型,TAF130型,TAF90型,TAF60型,TAF25型,SPT15标准[待定]，标准贯入试验7、和标准贯入试验8)，两组均未鉴定出我们通过免疫纯化DALPC鉴定和表征的TFIID（15个亚基）或SAGA（12个亚基）成分的总量。（加文等人[18]然而，在这方面，确实比Ho等人更接近[25].) 总之，这些观察结果表明，与标记方法相比，我们报告中详细介绍和使用的免疫纯化-DALPC具有更高的敏感性和准确性。

鉴定TBP与染色质重塑复合物的相互作用。

最近的研究表明，TBP向某些mRNA编码基因的启动子募集明显独立于TFIID(31,34). 证据表明，TBP可能与SAGA复合体的组件相互作用(14,43)SAGA可能为在适当SAGA靶基因的启动子上护送、招募或保留TBP提供了一种替代机制(6,32). 这里提供的数据通过首次直接证明内源性TBP可以稳定地与原生的holo-SAGA复合体结合来支持这一假设（图。​（图2）。2). 我们进一步建议在这里观察到RSC和TBP之间的相互作用（图。​（图7）7)可以提供类似的功能。尽管TBP可以明确地与RSC和SAGA结合，但它显然不能作为两种络合物的完整化学计量亚基进行铜化(三,20). 这些结果与我们的发现一致，即与TFIID相比，总TBP中相对较小的一部分与SAGA或RSC相关（S.a.Sanders和P.a.Weil，未发表的观察结果）。这些数据进一步强调了我们方法的威力，因为我们的免疫纯化-DALPC方法很容易证明了传统纯化方法之前未发现的非化学计量关联。

酵母TFIID似乎是Swi6p的转录辅激活剂。

TFIID功能的辅激活子模型认为，TFIID和反式激活因子之间的相互作用对于TFIID在启动子上的募集或稳定以及随后mRNA基因转录的启动至关重要(1). 尽管有大量的体外研究支持这一假设，但缺乏TFIID和体内反式激活剂之间功能相关相互作用的直接生物化学遗传学证据。在这里，我们通过直接证明Swi6p反式激活子与体内TFIID复合物的突变敏感性关联，提供了此类证据（图。​（图5）。5). TAF17p的C末端26个氨基酸的缺失与SWI6系列，以及此类突变体塔夫17细胞显示Swi6p依赖性基因转录缺陷(37). 重要的是，我们已经证明TFIID和Swi6p之间的相互作用在塔夫17细胞，我们的数据表明，这种相互作用是直接的。总之，这些研究表明，TFIID-Swi6p相互作用对于调节Swi6p功能至关重要，并且可能进一步需要TFIID向至少一些Swi6p-依赖启动子招募。Swi6p作为MBF（Swi6p+Mbp1p）和SBF（Swi6p+Swi4p）转录因子复合物的一部分发挥作用，以控制G所需基因的表达₁-到S相变(49). 从我们的结果来看，尚不清楚Swi6p是否仅在其中一种、两种或两种异构反式配合物中与TFIID相互作用。需要进一步研究以解决TFIID-Swi6p相互作用的这一方面和其他方面。

我们感谢B.Cairns和B.Andrews赠送的宝贵试剂，感谢X.Shen和C.Wu在出版之前就INO80复合物的组成交流结果，并感谢他们提供INO80专用试剂。我们特别感谢J.Blackford在DALPC数据统计分析方面的帮助和建议。最后，我们感谢Weil和Link实验室的所有成员进行了有益的讨论。

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款GM52461（P.A.W.）和范德比尔特-英格拉姆癌症支持拨款5P30CA68485、HHMI和英格拉姆家族捐款（A.J.L.）的支持。