《美国病理学杂志》。1999年10月；155(4): 1033–1038.
β-儿茶素对人结直肠癌基质金属蛋白酶-7表达的调节作用
摘要
大多数结直肠癌的腺瘤病-息肉病-大肠杆菌（APC）抑癌基因发生功能缺失突变。这导致β-连环蛋白的积累，与DNA结合蛋白TCF-4一起起转录激活剂的作用。最近定义的靶基因是c-myc公司和cyclin D1，将APC基因缺陷与结肠肿瘤自主增殖能力联系起来。在此，我们报道了基质金属蛋白酶MMP-7作为β-catenin/TCF-4的另一个靶基因的鉴定。MMP-7在80%的人类结直肠癌中过度表达，是早期肿瘤生长的重要因素，对晚期进展步骤也有潜在作用，如侵袭和转移。我们的结果解释了结肠肿瘤中MMP-7过度表达的高百分比。此外，他们指出APC抑癌基因的缺陷也可能影响结肠肿瘤的后期进展。
腺瘤病-息肉病-大肠杆菌（APC）抑癌基因的功能缺失突变是结肠直肠癌发生的早期事件，在80%的人类结肠肿瘤中发现。1正常APC蛋白促进β-catenin降解。作为（无翼）WNT-信号通路的效应器，β-catenin能够与T细胞因子（TCF）家族的转录因子结合并随后激活靶基因。2因此，在APC基因突变的结直肠癌细胞中，β-catenin在细胞核TCF结合部分积累，导致组成性靶基因激活。3,4最近定义的由β-catenin/TCF激活的基因是-myc公司5和细胞周期蛋白D1。6这两种蛋白在细胞增殖中都有重要功能，已知在结直肠癌中过度表达。7,8这些发现直接将APC基因突变或APC控制的WNT-通路的其他效应器与结肠肿瘤的自主生长联系起来。
良性结直肠腺瘤和恶性结直肠癌均存在自主生长。从腺瘤发展到癌的关键步骤是侵袭性生长，此时基底膜和细胞外基质被降解。参与这一过程的一类蛋白质是基质金属蛋白酶（MMPs）。然而，最近的证据表明，基质金属蛋白酶在肿瘤进展中起着更复杂的作用。它们对于创造一个支持原发性肿瘤和转移生长的启动和维持的微环境是必要的。9其机制尚未完全了解；然而，它们也可能参与肿瘤血管生成等过程。与基质细胞产生的明胶酶A（MMP-2）、基质溶素1（MMP-3）和基质溶素3（MMP-11）等其他基质金属蛋白酶相比，MMP-7（也称为基质溶素）在结直肠癌和其他上皮性肿瘤的肿瘤细胞中表达。10MMP-7在80%左右的结直肠癌中过度表达。10,11MMP-7对结肠腺瘤的生长起重要作用12结肠癌细胞的致瘤性。13此外，MMP-7对癌细胞的侵袭和转移潜能起着重要作用。14,15
在APC基因突变的结直肠癌中，β-catenin的过度表达通常主要出现在侵袭前沿。16这使我们提出了一个假设，即β-catenin/TCF通过激活入侵相关基因直接参与入侵过程。GenBank在这些基因的启动子中搜索TCF共有结合序列（5′-A/T A/T CAAAG-3′），发现了几种MMP。在这里，我们证明人类MMP-7基因的启动子包含两个TCF结合位点，并被β-catenin/TCF激活。此外，MMP-7的表达与遗传性和散发性结肠癌中β-catenin的表达相关。我们的结论是，多达80%的结直肠癌中肿瘤进展因子MMP-7的过度表达可能是由APC基因突变引起的。
材料和方法
电动迁移分析（EMSA）
以下双链寡核苷酸用作探针或用于竞争：TCF（1.）：5′-ACATACTTCAAAGTTCTGTA；TCF（1.m）：5′-ACATACTGCAAAAGTTCTGTA；TCF（2.）：5′-AAAAA TCCTTTGAAAGACA-AA；TCF（2.m）：5′-AAAAA TCCTTTGGCAGACAAA；TBE1:5′-CGCACTTTTGATTTCTCGCACCTTTATTTCT（待定）。探针最终标记为3×108如前所述，dpm/μg 0.5 ng探针与0.5μg细菌表达的GST-TCF-4（密码子265-496）孵育。5对于特定竞争，使用了500×量（250 ng）的未标记寡核苷酸。
细胞与细胞培养
从ATCC中获得HeLa和HT29细胞。所有细胞系均在DMEM+10%胎牛血清的标准条件下培养。
DNA克隆
phMMP-7prLuc是通过克隆Xho公司我/Hin公司质粒p-933HPCAT（田纳西州纳什维尔范德比尔特大学L.Matrisian赠送）的DIII片段（编码人类MMP-7启动子的核苷酸−933至+35）进入Xho公司我/Hin公司DIII开放载体pGL3-Basic（德国曼海姆Promega）。对于使用QuickChange突变试剂盒（德国海德堡斯特拉赫内）突变phMMP-7prLuc（野生型；WT），我们使用了以下引物：pTCF（1.m）：5′-GTTATAAAAAACACTACTGCAAAGTTGTAGACTC；pTCF（2.m）：5′-GACAGAAAAAAAAATCCTTTGGCAGACAAATACTGTG。为了构建四个串联重复克隆p4xTCF（1.）-Luc、p4xTCF（1.m）-Luc、p4xTCF（2.m）-Lac和p4xTC F（2.m-Luc），我们聚合了用于EMSA的相应双链寡核苷酸，并将其克隆到Hin公司DIII切割并钝化载体ptkLuc（德国乌尔兹堡病理科E.Serfling赠送），含有胸苷激酶最小启动子。以下质粒是其他研究人员赠送的：来自K.Kinzler和B.Vogelstein（马里兰州巴尔的摩约翰斯·霍普金斯肿瘤中心）的pGST-TCF4（DBD）、pcDNA/myc-hTCF4和pcDNA/myc-DN-TCF4，pcDNAhβ-catenin是来自H.C.Clevers（荷兰乌得勒支大学医院）的礼物，来自J.Ghysdael（法国奥赛居里研究所）的pSV40Ets1，来自M.Schuermann（德国马尔堡）的pMSc-fos和来自P.Angel（德国卡尔斯鲁厄）的pRSVc-jun。
转染和报告者检测
HeLa和HT29细胞在60-mm组织培养皿中以50%的融合率生长，并使用Lipofectamine Plus（德国卡尔斯鲁厄生命技术公司）转染2μg报告构建物、0.5μg pCMVβGal-control和3μg表达载体或空载体pCNA3。40小时后采集细胞，进行荧光素酶分析，并使用Dual Light Kit（德国魏特施塔特Perkin Elmer）通过β-半乳糖苷酶活性标准化转染效率。试验一式三份。
免疫组织化学
使用福尔马林固定、石蜡包埋的具有β-连环蛋白可变表达的结直肠癌组织块。三种肿瘤来自于基因定义的家族性腺瘤病息肉病（FAP）患者，两种来自于遗传性非息肉病结直肠癌（HNPCC）患者。根据杂合性缺失分析（标记D5S107），HNPCC病例的APC基因状态被认为是正常的。然而，这些病例没有APC基因的精确测序数据。其他病例为散发性癌。将3μm系列切片脱蜡、复水，并与不同的小鼠单克隆抗体孵育2小时。抗原提取用于α-MMP-7、mib-1（微波处理）和CEA（蛋白酶XIV）。α-MMMP-7（Chemicon，Hofheim，德国）的稀释度为1:300，α-β-连环蛋白（Transduration，Lexington，KY）的稀释度为1:200，α-Mib-1和α-CEA的稀释度为1:30（Dako，Hamburg，德国）。生物素化兔α-鼠Ig抗血清稀释1:50作为二级抗体。清洗后，将载玻片与链霉亲和素偶联碱性磷酸酶（德国汉堡达科）在室温下培养30分钟，并使用快速红（德国德伊森霍芬西格玛）作为底物在37°C下培养12分钟。用水冲洗后，用血肿（默克，达姆施塔特，德国）复染切片，脱水，盖上盖子。
结果
TCF4与人MMP-7启动子中的两种元素结合
通过搜索GenBank，我们在包括MMP-1、MMP-3和MMP-7在内的几个人类侵袭相关基因的启动子中发现了潜在的TCF结合位点。因为MMP-7在大多数结直肠癌中过度表达，所以我们关注MMP-7。人类MMP-7启动子中已经描述了三个转化生长因子（TGF）-β抑制元件（TIEs）、两个ets转录因子结合位点（PEA3）和一个AP-1结合位点。17我们确定了两个潜在的TCF结合元件：TCF（1.）从−109到−103，TCF（2。
人MMP-7启动子中两个TCF结合位点的鉴定。一：在人类MMP-7启动子TCF（1.）和TCF（2.）中确定的两个TCF结合位点的定位(▪). 还显示了先前定义的TGF-β抑制元件样序列（TIE）、ets（PEA3）和AP-1结合位点（□）。数字表示相对于转录起始位点（+1）的核苷酸位置。这个图表不是按比例绘制的。还显示了这两个位点的核苷酸序列和在以下实验中使用的突变序列（TCF（1.m）和TCF（2.m））。b条：TCF-4特异性结合到两个TCF位点。以TCF（1.）和TCF（2.）序列（wt）或其突变体（mt）作为探针的EMSA，与GST-TCF-4（TCF-4）或GST单独孵育。为了进行特异性竞争，使用未标记的寡核苷酸作为探针或TBE2（c-myc启动子的TCF结合位点）。
为了验证TCF-4的结合，我们使用两种潜在的TCF元件作为电迁移率变化分析中的探针，并与重组GST-TCF-4孵育。TCF-4结合到两个探针上，但TCF（2）的复合形成更强（图1b）GST蛋白本身并没有形成复合物。通过使用两个突变的TCF位点作为探针来确认特异性，然后这些探针不与TCF-4结合。此外，我们还使用了野生型或突变的TCF（1.）、TCF（2.）和TBE1，这是c-myc公司发起人，5作为特定的竞争对手。
β-连环蛋白和TCF4激活人MMP-7启动子
为了确定TCF-4与所定义元素的结合是否具有功能性结果，我们将由人MMP-7启动子控制的荧光素酶报告基因结构与不同表达结构瞬时转染到HeLa细胞中（图2b）与空载体pcDNA3相比，TCF-4或β-catenin表达克隆的共转染分别导致3.2倍或1.88倍的激活。这与TPA对MMP-7启动子的已知刺激作用相似（2.36倍）。17在共转染TCF-4和β-catenin表达构建体后发现协同激活（9.4倍）。我们进一步测试了过度表达的Ets1和c-Jun/c-Fos与MMP-7启动子中的PEA3和AP-1位点结合的效果。仅通过其中一种元素单独刺激启动子对HeLa细胞的作用很弱。然而，TCF4/β-catenin和Ets1的联合表达，c-Jun/c-Fos导致MMP-7启动子的最大激活。这类似于TCF4/β-catenin和TPA的联合激活，模拟AP-1激活。空荧光素酶载体对任一激活物均无反应（未显示）。因此，TCF/β-catenin在很大程度上（～60%）促进了人类MMP-7启动子通过所有定义元素实现的最大激活。
β-catenin/TCF激活人MMP-7启动子。一：瞬时转染分析中使用的报告结构。phMMP-7prLuc（WT）突变(交叉的方框)仅在两个TCF结合位点（TCF（1.m）和TCF（2.m））中的一个位置，保持另一个完整，或在两个位点（TCF1.m/2.m）。对于这两个TCF位点，在胸腺嘧啶激酶最小启动子上游克隆了四个野生型（4xTCF）或突变型（4xTCFm）序列拷贝。所有构建物均含有荧光素酶（Luc）cDNA作为报告子。b条：TCF4和β-catenin激活人类MMP-7启动子。用WT报告体和1μg指定表达载体（act.）共同转染Hela细胞，或用TPA（100 ng/ml）刺激Hela细胞。c（c）：TCF结合位点的突变降低了MMP-7启动子的激活。HeLa细胞与指定的报告构建物（rep.）和TCF4和β-catenin表达构建物共同转染。d日：β-catenin/TCF4通过隔离的TCF位点激活。HeLa细胞与指定的报告构建物（rep.）和TCF4和β-catenin表达构建物共同转染。TCF元件的突变消除了刺激。在所有图表中，列显示了与空表达向量的共转染相比的激活值。数据显示为三个独立实验的平均值和标准偏差。e（电子）显性阴性TCF-4（DNTCF4）降低结肠癌细胞中人类MMP-7启动子的活性。将HT29结肠癌细胞与指定的报告基因（phMMP-7prLuc（WT）或TCF（1.m/2.m））和表达载体（载体控制，β-catenin+TCF，dNTCF）联合转染。注意，DNTCF4仅导致WT MMP-7启动子活性显著降低。所示为与HT29细胞中报告结构的基本活性相关的百分比（100%）。
为了测试每个TCF位点的功能重要性，我们创建了报告结构，其中一个或两个元素发生突变，使得TCF-4不能再结合（与EMSA中使用的突变相同）（图2a）TCF突变（1.）与野生型启动子相比，TCF-4加β-catenin的刺激作用降低到约30%（图2c）与野生型启动子相比，仅在TCF（2.）中突变的启动子通过这两种激活剂可以被高达44%的激活。有趣的是，这两个位点的突变不能完全抑制β-catenin/TCF-4（1.81倍）的刺激。最近的数据表明β-catenin/TCF也激活c-jun基因转录18表明这种残余刺激可能是由于通过人MMP-7启动子的AP-1位点（−67至−61）的间接刺激。17
接下来，我们通过克隆胸腺嘧啶激酶-动物启动子荧光素酶结构体上游每个野生型和突变位点的四个拷贝来测试分离的TCF（1.）和TCF（2.）（图2d）两个聚合TCF位点都对β-catenin/TCF-4有反应。TCF（2.）活性更强，这与我们观察到的TCF-4对该位点的更高结合亲和力一致（图1b）核苷酸替代可消除TCF-4结合，阻止激活。
显性阴性TCF抑制结肠癌细胞中MMP-7启动子的活性
由于两个等位基因突变，HT29结肠癌细胞株没有功能性APC蛋白。因此，MMP-7启动子应由内源性β-catenin/TCF-4组成性激活。因此，两种因子的表达载体的共转染对野生型启动子只有微弱的额外刺激作用（图2e）APC基因缺陷的结肠癌细胞株SW480和SW620也获得了类似的结果，它们通过TCF4和β-catenin表达载体的组合显示了更弱的MMP-7启动子激活（数据未显示）。为了进一步证实β-catenin/TCF-4对激活人MMP-7启动子的重要性，我们试图通过显性负性TCF-4突变体（DN-TCF-4）抑制其在HT29中的内源性活性。4DN-TCF4缺乏β-catenin结合域，因此与TCF元件结合而不激活转录。转染DN-TCF-4构建体将启动子活性抑制到18%。相反，DN-TCF-4对两个TCF位点突变的启动子结构只有微弱的抑制作用（与WT启动子相比，该结构的内源性活性为40%）。
核β-连环蛋白与MMP-7在结直肠癌中的表达
β-连环蛋白在散发性结直肠癌中高比例过度表达。如果MMP-7的激活高度依赖于β-catenin，则可以预期这两种蛋白的相关表达。用α-MMP-7抗体对16例有代表性的强、弱或无免疫组织化学检测的β-catenin大肠癌的连续切片进行染色。包括散发型和遗传型结肠癌。所有病例均显示这两种蛋白的表达模式相关。特别是，这三种肿瘤都包括来自FAP患者的肿瘤，APC基因缺陷同时表达β-catenin和MMP-7。两个研究的HNPCC患者的高级别微卫星不稳定性肿瘤不表达核β-连环蛋白和MMP-7。然而，我们没有包括APC或β-catenin基因突变的HNPCC肿瘤，这些肿瘤中有50%以上发生突变。β-catenin高表达和低表达肿瘤的代表性结果如图3所示用结肠肿瘤标记物CEA和增殖标记物mib-1的免疫组织化学方法控制不同肿瘤的染色效率。有趣的是，在所有研究病例中，我们发现β-catenin表达与增殖活性没有相关性，通过mib-1染色细胞的百分比来测量（比较图3、d和h）)。
散发性结直肠癌中β-catenin和MMP-7表达的相关性（红色染色）。两种代表性强结直肠癌的免疫组织化学研究(a–d)或者很弱(e–h)β-catenin的表达。用所示抗体对连续切片进行染色。注意强相关性(a、 b条)而且很脆弱(e、 （f）)β-catenin和MMP-7的表达。肿瘤标记物CEA和增殖标记物mib-1在这两种肿瘤中的染色效率是相当的（在β-catenin强表达的肿瘤中只有少数细胞mib-1阳性）(d日). 放大倍数，×400。
讨论
我们已经证明，β-catenin通过TCF4结合两个共识元件激活人类MMP-7启动子。转染显性阴性TCF-4突变体可抑制HT-29结肠癌细胞中启动子的激活。此外，β-catenin和MMP-7在结直肠癌中的表达是相关的。这些结果表明MMP-7的表达受β-catenin/TCF的调节。我们认为，大肠癌中APC基因突变与该转录激活物复合体的组成性激活相关，导致MMP-7过度表达。同样的调控机制也被证明对c的激活起作用-myc公司5和细胞周期蛋白D1，6,实现结肠肿瘤细胞的自主生长。在编写这份手稿的过程中，针对小鼠MMP-7启动子发表了类似的结果，这证实了我们的结果。19β-catenin/TCF对人和小鼠MMP-7基因的保守调节强调了这种调节机制的重要性。然而，启动子的结构有一些显著的差异：我们在转录起始位点上游确定了两个TCF位点，围绕人类启动子中的两个Ets位点。小鼠启动子仅包含一个TCF位点，该位点位于TATA盒的下游。这可能与功能相关，例如TCF与其他转录因子的相互作用。
我们的数据可以解释之前在Apc杂合小鼠肠道肿瘤中的重要观察结果分钟等位基因（Min/+），模拟人类FAP综合征的动物模型。12Wilson等人在那里表明，大多数腺瘤（88%）过度表达MMP-7 mRNA。此外，他们还证明，MMP-7基因的额外靶向破坏抑制了这些小鼠的肠道肿瘤发生。作者提出了APC基因缺陷和MMP-7表达在肿瘤发生中的协同机制。我们的数据将MMP-7定义为β-catenin/TCF的靶基因，支持这些发现，也可以解释MMP-7在人类结直肠癌中的高表达频率（高达80%），10,20这与APC基因突变的频率相似。1
与其他基质金属蛋白酶相比，基质金属蛋白酶-7已被证明是早期结肠腺瘤生长的重要因素。12因此，早期腺瘤中也发现少量MMP-7。21然而，MMP-7表达增加，与肿瘤进展相关。晚期高度发育不良的结肠腺瘤是具有侵袭潜能的第一进展阶段，MMP-7表达水平较高。20-22这与MMP-7在肿瘤后期进展中的假定作用相一致。14,15我们还在其他基质金属蛋白酶的启动子中检测到潜在的TCF结合位点（数据未显示），其中之一（基质金属蛋白酶-1）在人类结直肠癌中也过度表达，并且与不良预后相关。23最近的工作还证明了β-连环蛋白对uPAR表达的间接影响，18另一种参与入侵的分子。这些数据将APC基因突变的影响从良性结肠腺瘤的特征性自主增殖扩展到结肠癌发展的后期阶段。
一个需要讨论的重要问题是，为什么MMP-7的高表达仅限于晚期进展，而APC基因突变可能是结直肠癌发生中最早的遗传缺陷。先前对MMP-7启动子的分析也确定了转录因子AP-1和PEA3的结合位点。17这两个因子都是ras信号通路的下游效应器24-26活化的K-ras可增强结肠癌细胞系中MMP-7的表达。27K-ras癌基因的激活突变在晚期、高度发育不良的结肠腺瘤和结直肠癌中积累的比例很高。1,28因此，APC和K-ras突变在激活大肠肿瘤中MMP-7基因转录方面可能具有相加效应。我们的结果支持这一点，即MMP-7启动子的最大激活是通过TCF4、β-catenin、ets-1、c-jun和c-fos表达载体的组合实现的（图2b）进一步的工作将调查不同转录激活物的相对重要性。与其他MMP基因一样，MMP-7的调节元件具有TGF-β抑制元件，负调控其转录。17现在很清楚，TGF-β信号通路分子的失活突变是结肠肿瘤进展过程中额外的重要基因改变，也经常发生在从良性生长到恶性生长的过程中。29此外，与单独APC基因缺陷的小鼠相比，APC基因和TGF-β途径联合缺陷的小鼠发展出更具侵袭性的恶性肿瘤。30这表明两种途径的功能合作。可以推测，β-catenin/TCF的组成性激活和TGF-β途径的失活突变都是有效激活MMP-7转录所必需的。因此，MMP-7可能是一种同时受结直肠癌发生中两条主要致癌途径WNT和TGF-β途径突变影响的效应基因模型。进一步的工作将解决这一点。
我们的结果，将MMP-7定义为β-catenin的靶基因，解释了MMP-7在结直肠癌中高比例过度表达的原因。MMP-7不仅在早期而且在晚期肿瘤发生中的可能功能，14,15扩大APC基因缺陷对结肠肿瘤的影响。
致谢
我们感谢K.W.Kinzler、B.Vogelstein、H.Clevers、L.M.Matrisian、J.Ghysdael、M.Schuermann、P.Angel和E.Serfling提供DNA克隆，感谢L.McKenna批判性阅读手稿。对于专家技术援助，我们感谢U.Suchy和C.Knoll。
工具书类
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