PDK1同源物对于转导AGE-1 PI3激酶信号是必要的，并且足以调节秀丽隐杆线虫

sa680、sa709和mg142是秀丽线虫PDK1同源物的等位基因

我们检查了秀丽线虫受体酪氨酸激酶信号传导相关基因的等位基因映射区域的基因组序列。这个秀丽线虫人PDK1同源物(Alessi等人，1997年a,b条)，我们命名为pdk-1型，位于该区域，是这些等位基因定义的基因的最佳候选基因。我们确定了pdk-1型DNA序列sa680、sa709、和镁142菌株PCR扩增和直接测序。这揭示了一个pdk-1型Gly-295–Arg替代sa680标准应变和apdk-1型Ala-303–Val替代镁142菌株，激酶结构域中的两个保守残基（图。​（图1B）。1B） ●●●●。我们没有检测到pdk-1型中的编码区域sa709标准应变；这种弱等位基因可能在基因的调节区发生突变。Daf-c表型pdk-1（sa680）和pdk-1（sa709）都被一个pdk-1型（+）转基因，确认其为pdk-1型（数据未显示；有关转基因的描述，请参阅材料和方法）。

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图1

pdk-1型编码丝氨酸/苏氨酸激酶。(A、 顶部）遗传和物理地图pdk-1型区域。pdk-1型包含在fosmids H42K12和H33H01中。PDK-1的起始蛋氨酸在H42K12上为9848bp，PDK-1终止密码子在H33H01上为3082bp；fosmids重叠1201bp（从12897到fosmid H42K12上的末端）。（底部）的外显子/内含子结构pdk-1型.编码区域为实心框；非编码区域是开盒；内含子是线条。激酶域由阴影框表示(汉克斯和亨特1995); pleckstrin同源域由阴影框表示(Alessi等人，1997年a). (B类)PDK-1a（GenBank登录号。{“类型”：“中心核苷酸”，“属性”：{“文本”：“AF130406”，“术语id”：“5353962”AF130406型); PDK1b（编号。{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AF130407“，”term_id“：”5353964“，”term_text“：”AF130 407“}}AF130407型)，DMSTPK61（EMBL{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“Y07908”，“term_id”：“1542878”，“term_text”：“Y07908“}}Y07908年)和人类PDK1（GenBank登录号。{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AF017995“，”term_id“：”2407612“，”term_text“：”AF07995“}}AF017995型)使用PILEUP（GCG）进行比对（括号中显示了PILEPP中使用的蛋白质的登录号）。相同的残留物用点表示；引入的用于对齐序列的间隙用破折号表示。激酶结构域由氨基末端阴影区表示，百合同源结构域由羧基末端阴影区指示。这个sa680标准Gly-295–Arg替代由PDK1a序列上方的R表示。这个镁142Ala-303–Val替换由PDK1a序列上方的V表示。

这个线虫pdk-1该基因具有PDK1家族的特征，包括一个氨基末端激酶结构域和一个羧基末端pleckstrin同源结构域(Alessi等人1997a)（图。​（图1A）。1A） ●●●●。在哺乳动物中，PDK1与PI3K的磷脂产物结合，通过Thr-308位的磷酸化激活Akt/PKB丝氨酸/苏氨酸激酶，以响应生长因子信号(Alessi等人，1996年,1997年a). 在秀丽线虫,akt-1型和akt-2型，Akt/PKB的两个同源物，将AGE-1 PI3K信号转导到DAF-16转录因子(Paradis和Ruvkun 1998). 同时灭活akt-1型和akt-2型导致Daf-c表型（表​（表3；三;Paradis和Ruvkun 1998)和激活突变akt-1型减轻了对AGE-1 PI3K信号的需要秀丽线虫(Paradis和Ruvkun 1998). 因此pdk-1型预计无法激活Akt/PKB并导致Daf-c表型。激活突变pdk-1型预计将导致akt-1型和/或akt-2型活动，从而抑制年龄1零突变。这些预测得到了观察到的pdk-1型突变体。

为了确认pdk-1（mg142）突变导致Daf-c表型的显性抑制年龄1功能缺失突变体，我们使用RNA干扰（RNAi）进行了逆转实验(Fire等人，1998年)减少pdk-1型基因活性1岁（mg44）；pdk-1（mg142）应变。如果pdk-1型该基因座负责在该菌株中观察到的抑制表型，RNAipdk-1型在该菌株中，应恢复抑制表型并导致年龄1Daf-c表型。抑制pdk-1型RNAi在1岁（mg44）；pdk-1（mg142）应变使pdk-1型抑制表型（表​（表3）。三). 我们的结论是镁142是pdk-1型轨迹。撤销pdk-1（mg142）抑制表型也支持以下结论镁142是pdk-1型而不是功能丧失突变。

有趣的是，减少pdk-1型野生型动物的RNAi功能（表​（表3）三)不会引起类似于上述两种情况的Daf-c表型pdk-1型功能缺失等位基因。对此结果的一个可能解释是pdk-1型不减少pdk-1型基因活性足以在野生型背景中引起Daf-c表型。然而，RNAipdk-1（mg142）降低基因活性足以恢复该等位基因抑制年龄1Daf-c表型（表​（表3）。三). 因此，有可能pdk-1型实际上废除了pdk-1型基因活性，但pdk-1（sa680）是一种新的隐性干扰突变，而不是功能丧失突变。如果是这样pdk-1型RNAi的基因活性有望逆转Daf-c表型pdk-1（sa680）。我们进行了这个实验，没有观察到pdk-1（sa680）Daf-c表型（数据未显示）。因此，我们的结论是pdk-1（sa680）是一种功能丧失突变pdk-1型禁止pdk-1型基因活性低于pdk-1（sa680）.抑制pdk-1型RNAi的基因活性也不能增强pdk-1（sa680）Daf-c表型（数据未显示）。这意味着pdk-1（sa680）是一个强且可能为零的等位基因，但因为sa680标准突变导致氨基酸替换，pdk-1（sa680）可以保留一些活动。

增加的基因剂量pdk-1型（+）具有与pdk-1（mg142）突变，表明pdk-1（mg142）这归因于基因活性的增加。增加的基因剂量pdk-1型（+）抑制Daf-c表型年龄1（mg44）（表​（表4）。4). 这种抑制依赖于功能性PDK1激酶结构域，因为携带用天门冬酰胺（PDK1a中的K98N）取代保守赖氨酸残基的转基因不能抑制PDK1的激酶活性年龄1（mg44）（表​（表4）。4). 同样，增加akt-1型基因剂量也足以抑制年龄1（mg44）（表​（表4）。4). 我们的结论是增加pdk-1型（+）足以补偿AGE-1 PI3K信号的丢失，可能是通过增加akt-1型和/或akt-2型活动。重要的是，上述基因分析pdk-1型功能丧失和功能获得突变表明pdk-1（mg142）是显性激活突变，而不是显性阴性或功能丧失。

激活的pdk-1需要akt-1和akt-2基因活性

PDK1激活Akt/PKB的生化研究(Alessi等人，1997年b;Stokoe等人，1997年)预测一下pdk-1（mg142）Daf-c表型的抑制年龄1突变体需要akt-1型和akt-2型基因活性。减少akt-1型RNAi单独的基因活性足以干扰pdk-1（mg142）抑制年龄1Daf-c表型（表​（表3）。三). 仅减少akt-2型基因活性部分损害了pdk-1（mg142）抑制年龄1（mg44）（表​（表3）。三). 同时灭活akt-1型和akt-2型通过RNAi导致Daf-c表型（表​（表3；三;Paradis和Ruvkun 1998)这是激活突变的上位性pdk-1（mg142）（表​（表3），三)，表明akt-1型和akt-2型作用于下游pdk-1型这些结果与以下模型一致：pdk-1（mg142）激活akt-1型和akt-2型在没有上游AGE-1 PI3K输入的情况下发出信号。这些结果表明akt-1型和akt-2型是的主要输出pdk-1型发送信号。

生化实验表明，Akt/PKB上Thr-308的PDK1磷酸化是Akt/PKB活性所必需的(Alessi等人，1996年,1997年b). 我们测试了激活突变akt-1、akt-1（mg144），解除了PDK1磷酸化事件的需要。这个akt-1（mg144）突变能够部分抑制pdk-1（sa680）功能丧失突变（表​（表1），1)，表明了这一点akt-1（mg144）活动不需要完全pdk-1型活动。这个实验与模型一致akt-1型作用于的下游pdk-1型然而，pdk-1型活动是激活所必需的akt-1型在AGE-1生成的磷脂信号缺失的情况下发出信号。停用pdk-1型通过RNAi1岁（mg44）；akt-1（mg144）紧张使人丧失能力akt-1（mg144）抑制Daf-c表型年龄1（mg44）（表​（表3）。三). 这一观察与激活的能力形成对比akt-1（mg144）绕过以下要求pdk-1型AGE-1磷酸肌醇信号传导正常的遗传背景下的信号传导（表​（表1）。1). 对这一结果的一种解释是，AKT-1对其正常激活既有非PDK-1磷脂依赖性输入，也有PDK-1依赖性输入akt-1（mg144）只有当存在AGE-1 PI3K生成的磷脂酰肌醇时，突变才能解除PDK-1输入的需求。

正如预期的突变增加一样akt-1型而且可能akt-2型活动，pdk-1（mg142）行为类似于中的激活突变akt-1、akt-1（mg144）(Paradis和Ruvkun 1998). 喜欢akt-1（mg144）、pdk-1（mg142）抑制中的空突变年龄1比抑制DAF-2胰岛素受体样蛋白的功能丧失突变更有效（表​（表2）。2). 这一结果支持了这样的观点，即信号通路的分支发生在DAF-2胰岛素受体样同源物下游，AGE-1 PI3K及其下游信号分子代表这些平行通路的一个分支。来自DAF-2胰岛素受体样同源物的所有信号必须集中在daf-16型，因为daf-16（m27）完全抑制两者的Daf-c表型daf-2型和年龄1突变体（表​（表2）2) (元音和托马斯1992;Gottlieb和Ruvkun，1994年;Larsen等人，1995年).

相当于pdk-1（mg142）的人PDK1 Ala-277-Val突变体激活PDK1激酶对Akt/PKB的活性

遗传证据表明pdk-1（mg142）突变激活了PDK1激酶对Akt/PKB的活性，利用这些激酶的哺乳动物同源物进行了生化验证。Ala-303–Val替代pdk-1（mg142）位于人类PDK1（hPDK1）中保守的激酶结构域的一个区域（图。​（图1B）。1B） ●●●●。在hPDK1（hPDK1.A277V）中构建了等效替代突变，并将其在哺乳动物Akt/PKB底物上的激酶活性与野生型hPDK1。用野生型hPDK1瞬时转染人胚胎293T肾细胞，hPDK1.K110N是一种激酶非活性突变体(Chou等人，1998年)和hPDK1.A277V突变株，均标记有Myc表位。在自然条件下裂解转染细胞，用单克隆抗Myc抗体免疫沉淀hPDK1蛋白。如前所述，在PtdIns-3,4,5-P3存在下，使用重组His-tagged Akt/PKB底物在体外蛋白激酶试验中测定每个hPDK1蛋白衍生物的活性(Chou等人，1998年)（图。​（图2A）。2A） ●●●●。与野生型hPDK1相比，hPDK1.A277V突变株对Akt/PKB底物的蛋白激酶活性显著升高（2.9倍）（图。​（图2A）。2A） ●●●●。正如预期的那样，激酶活性突变体磷酸化底物的能力较差（图。​（图2A）。2A） ●●●●。这从生物化学角度证实了基因证据，即在这个保守位置进行Ala-to-Val替换可以增加PDK1蛋白激酶活性。此外，我们注意到hPDK1.A277V突变导致凝胶迁移率的改变，这让人想起在其他信号蛋白激酶中发现的过度磷酸化，例如p70 S6激酶(Romanelli等人，1999年; 图。​图2B）。2B） ●●●●。hPDK1的这种假定磷酸化可能指示酶的激活。然而，这种修饰是仅适用于Ala-277-Val激活突变，还是上游信号蛋白激活hPDK1的更普遍机制，尚待确定。

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图2

人PDK1中A277V的替代导致酶的激活。将野生型人PDK1（hPDK1）、激酶非活性hPDK1.K110N和hPDK1/A277V表达克隆中激活的A277V突变瞬时转染293T细胞，重复转染后，在体外蛋白激酶检测中检测每个突变株对Akt/PKB的蛋白激酶活性（见材料和方法）。这些数据代表了四个独立的实验。(A）hPDK1蛋白的相对量（hPDK1.K110N和hPDK1.A277V）根据hPDK1-蛋白浓度从B类使用生物活性分子成像仪上的抗Myc抗体和ECL检测（Amersham），以及用于抗Myc抗原免疫沉淀的调整量的裂解物。清洗免疫沉淀，并使用His–Akt作为底物进行体外激酶分析。Akt/PKB（His–Akt）的磷酸化通过放射自显影术进行评估，并在生物放射分子成像仪上进行定量。将数据标准化为野生型hPDK1活性（1），并表示每个hPDK1构建体的两个泳道的平均值。在hPDK1.A277V通道中，仅使用较低物种（与野生型hPDK1通道中的His–Akt相结合）进行定量，因为较高迁移物种的身份尚不清楚。(B）对总细胞裂解物进行总蛋白含量分析（生物活性蛋白分析），并在7.5%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上装载等量的蛋白质，将溶解的蛋白质转移到硝化纤维素中，并用抗Myc抗体进行免疫印迹。与野生型或激酶活性蛋白相比，A277V突变体观察到额外的抗Myc免疫反应带。

pdk-1（sa680）延长秀丽线虫寿命

中的突变年龄1增加秀丽线虫寿命超过两倍(克拉斯1983;Larsen等人，1995年;Morris等人，1996年). 中的突变daf-16型抑制寿命增加(Kenyon等人，1993年;Larsen等人，1995年). 中的一种功能丧失突变pdk-1型增加秀丽线虫寿命几乎是原来的两倍，类似于年龄1（图。​（图3）。三).daf-16（m27）抑制pdk-1（sa680）（图。​（图3）。三). 这些结果表明，来自DAF-2和AGE-1信号通路的寿命调节信号通过PKD-1传播，可能通过AKT-1和AKT-2传播到DAF-16转录因子。有趣的是，两者都是daf-16（m27）;pdk-1（sa680）和激活突变pdk-1型与野生型相比，其本身的寿命略有缩短（图。​（图3）。三). 该结果与之前公布的结果一致，该结果显示daf-16（m26）突变株(Larsen等人，1995年). 然而，由于即使在不同的野生型菌株之间也观察到了菌株间的变异，因此很难解释特定菌株寿命略微缩短的意义(凯尼恩1997). 因此，必须进行更严格的分析，以得出结论，在这些菌株中观察到的生命周期的微小缩短是由这些特定突变引起的。

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图3

成人寿命pdk-1（sa680）突变体。pdk-1（sa680）延长成人寿命和daf-16型在25°C时抑制寿命增加。野生型的平均寿命为17天（□，n个 = 50），15天pdk-1（毫克142）(*,n个 = 50），15天daf-16（m27）；pdk-1（sa680）(●,n个 = 49），27天pdk-1（sa680）（⋄，n个 = 50），27天sqt-1（sc13）年龄1（hx546）( ,n个 = 25). 平均寿命显著不同(P（P）≤2e−9；参见材料和方法）pdk-1（sa680）与…相比sqt-1（sc13）年龄1（hx546）、和daf-16（m27）；pdk-1（sa680）与…相比pdk-1（mg142）.平行测定所有菌株的寿命；数据来自于至少另一次进行的一个具有代表性的实验。

激活突变pdk-1（mg142）不会抑制年龄1（未显示数据）。激活突变akt-1型也不会抑制寿命的增加年龄1突变体(Paradis和Ruvkun 1998). 对该数据的一种可能解释是pdk-1（mg142）或akt-1（mg144）在缺乏正常的PtdIns-3,4-P2和PtdIns3,4,5-P3信号的情况下，足以绕过AGE-1 PI3K信号在生殖发育中的需要，但在寿命中不需要。只携带母体贡献的年龄1活动寿命长，但不会在达斡尔族阶段停止(Morris等人，1996年)这与野生型寿命需要更高水平的通路激活的模型一致。

pdk-1功能丧失突变体具有多效性表型

pdk-1（sa680）和pdk-1（sa709）除了Daf-c和衰老表型外，突变体还有其他几种多效性表型（表​（表5）。5).pdk-1（sa680）在20°C下生长的突变动物的蛋黄（Egl）缺陷，身体比野生型（Lon）长，形成动物群，而不是分散在细菌草坪上（Cpy）(Thomas等人，1993年)生育率低。与Daf-c表型一样pdk-1（sa680）被母亲救活。这个pdk-1（sa680）然而，Egl表型并没有显示完全的母体拯救。基因突变daf-16型抑制所有表型和akt-1（mg144）突变部分抑制Daf-c和生育表型，但不抑制Egl、Lon和Cpy表型（尽管部分抑制这些定性表型可能难以准确评分）。Daf-c表型的抑制较弱，Egl、Lon和Cpy表型的抑制不足akt-1（mg144）激活突变可以反映出通过akt-1（mg144）比daf-16（m27）或者，pdk-1（sa680）可能会有与AKT-1并行的输出，但不会被激活akt-1（mg144）但这集中在DAF-16上。

pdk-1（sa680）和pdk-1（sa709）的分离和绘图

pdk-1（sa680）和pdk-1（sa709）在27°c的Daf-c突变体筛选中分离。sa680标准露头四次sa709标准两次，然后详细描述突变表型。在所有温度下，sa680标准男性都会以达斡尔族的身份被捕，或者在达斡尔人阶段之前死亡。因此，绘图标记总是交叉到sa680型突变体，常用tra-2（q276）获得X染色体标记的XX个雄性杂合子。两者都有sa680标准和sa709标准被映射到X染色体的左臂unc-1型和第三季度。从其中一个中挑选的Unc非Dpy和Dpy非Unc重组子的汇集结果sa680/unc-1（e719）dpy-3（e27），或sa709/unc-1（e719）dpy-3（e27），我们得到以下地图数据：unc-1号机组(13)sa680标准(46)dpy-3型、和unc-1号机组(2)sa709标准(8)dpy-3型。这非常接近pdk-1型在物理地图上。

pdk-1（mg142）分离与映射

pdk-1（mg142）被隔离为年龄1（mg44）在前面描述的屏幕中(Paradis和Ruvkun 1998). 所有绘图实验都是在sqt-1（sc13）年龄1（mg44）突变背景。年龄1（mg44）导致Daf-c表型，母体可以挽救(Riddle 1988年). 因此，在每个映射实验中，我们首先进行纯合sqt-1年龄段1然后通过对下一代分离的表型进行评分，对其他基因座进行基因分型。由于技术上的原因，我们没有对在同一代中具有纯合子定位标记的下一代动物进行评分sqt-1年龄段1（即，我们没有为sqt-1年龄-1；dpy-3型例如）。在回交时，我们发现pdk-1（mg142）X链接。随后的双因子杂交表明毫克142链接到dpy-3（e27）约11 m.u.之间有三个因素交叉镁142和dpy-6（e14）unc-3（e151）建议镁142在的左边dpy-6型此外，三因素交叉镁142和unc-1（e719）dpy-7（e88）表明了这一点镁142要么靠近的右边，要么可能是左边unc-1号机组这些结果如下。首先，我们恢复了42个纯合子镁142动物和19个杂合子mg142/unc-1（e719）dpy-7（e88）动物，代表非重组类。在重组类中，我们发现15个Dpy非Unc重组子中有15个携带镁142（尽管我们可能忽略了不携带镁142因为在Dpy dauers中很难得分）。此结果将镁142远离dpy-7型。携带15个Unc非Dpy重组子中只有一个毫克142。此结果将镁142右侧和附近unc-1号机组，这一解释与pdk-1型分子克隆结果。我们还分离出两种携带mg142 unc-1（e719）dpy-7（e88）然而，染色体表明镁142在的左边unc-1号机组。我们怀疑这一类是双重重组事件的结果。将该数据外推以解释所有重组和非重组类，得出了两个因素之间的映射距离镁142和unc-1号机组3.3 m.u.或三因素地图距离镁1421.7 m.u.右侧unc-1号机组.

pdk-1（mg142）优势测试

unc-4（e120）年龄1（mg44）/+雄性被杂交到sqt-1（sc13）年龄1（mg44）；pdk-1（mg142）雌雄同体。在F中₁我们恢复了以下杂交后代：249只野生型非雄性；242个野生型非auer雌雄同体；10只野生蝙蝠；其他13个（总数来自两次试验）。对分离Sqt、Unc和野生型的野生型非dauer雌雄同体后代进行dauer和non-dauer评分，得出以下结果：70.6%的非dauel和29.4%的dauer(n个 = 422，一次试验）。我们注意到达拉斯队在得分后24–48小时似乎恢复了状态，与之相比年龄1（mg44）达尔斯。我们认为，这证明了pdk-1（mg142）抑制年龄1.

pdk-1（sa680）和pdk-1（sa709）dauer形成分析

表​表11将两个独立实验的结果结合起来，每个实验都有相似的结果。对于pdk-1（sa680）dauer形成分析，在一个实验中，允许父母在室温下产卵8小时，然后将平板移至25.4°C。在第二个实验中，在25.4°C的温度下进行17小时的隔夜产卵，然后移除父母（在本实验中，一些sa680标准父母从后代的内部孵化中“装袋”）。在这两种情况下，产卵后48小时对平板进行计数。仔细检查盘子的侧面sa680标准达尔人有很高的攀登板块的倾向。由于缺乏恢复，不需要紧密同步sa680标准dauers，并且按照描述进行分析，因为sa680标准蛋黄有缺陷。除了形成涂抹物，sa680标准突变体形成的“达斡尔族”动物比例很低，它们在L2阶段后会停止发育，肠道呈暗红色，但不像达斡尔人那样呈放射状收缩，不会停止运动或泵血。类似Dauer-like的动物也出现在daf-2型(Gems等人，1998年)以及年龄1(Gottlieb和Ruvkun，1994年). 对于pdk-1（sa709）dauer形成分析，允许父母在室温下产卵5.5小时，然后将平板移至26.8°C。产卵后41小时对后代进行计数。

pdk-1（mg142）dauer地层分析

允许灰熊成虫在25°C下产卵3小时。在产卵后48小时对所有等级的后代进行评分，在产卵72或96小时对一些菌株进行评分。对于本研究中进行的所有分析，数字表示每个基因型在不同日期进行的至少两次试验中的至少两个试验的总结。在所有分析中，使用了以下评分类别。Dauer-like是指被逮捕的动物，肠道呈黑色年龄1或daf-2型达斡尔族，但并没有像这些达斡尔人那样被完全束缚，或者被逮捕和束缚得像年龄1和daf-2型达斡尔族的肠道没有达斡尔人那么黑年龄1或daf-2型达尔斯。类dauer范畴等价于《天堂与鲁夫昆》（1998）“其他”是指不能归类为达斡尔族的动物，因为该动物很小，形态异常，或者已经死亡。

等位基因测序

基因组DNA来自pdk-1（mg142）、pdk-1（sa680）、和pdk-1（sa709）对菌株进行PCR扩增并直接测序。至少有两种不同的露头pdk-1（mg142）和pdk-1（sa680）对菌株进行了测序。

cDNA特征

pdk-1a型基因结构通过cDNA测序得到确认（yk216b6由日本三岛国家遗传学研究所Y.Kohara提供）。pdk-1b型通过cDNA测序（yk478b12、yk499g8、yk551e8，由Y.Kohara提供）确认基因结构。基因的5′端由5′RACE（GIBCO）使用外显子4的基因特异性引物确定，假设两者都相同pdk-1a型和pdk-1b型. Thepdk-1型5′RACE分析的消息是反式-与第一个蛋氨酸上游10 bp的SL1先导序列拼接。

RNA干扰

这个pdk-1型从yk478b12（Y.Kohara）扩增编码区并按所述制备RNA(Paradis和Ruvkun 1998). 准备akt-1型和akt-2型按照说明进行RNA和注射(Paradis和Ruvkun 1998). 注射后，让蠕虫在20°C下恢复24小时，然后移到新鲜的盘子中，在适当的温度下产卵24小时。产卵后24小时对死卵进行评分，产卵后48小时对dauers或L4幼虫和成虫进行评分。对于仅在20℃下进行的分析，在20℃条件下进行第二次连续24小时产蛋并进行评分。我们发现akt-1型 + akt-2型N新鲜库存中的RNAi₂从秀丽线虫遗传中心和N₂在我们实验室培养出来的​表3三本报告表2《天堂与鲁夫昆》（1998）]. 我们执行了akt-1型 + akt-2型在26°C下进行RNAi分析，以提高新N中分析的一致性₂背景。我们怀疑，无论是修饰突变的存在还是孵化器内温度的波动都会影响Daf-c表型的外显率akt-1型+akt-2型RNAi。

pdk-1转基因株系的构建及转基因对dauer形成影响的评分

基因组DNA的9.2 kb PCR产物pdk-1型（+）基因组区域包含2.7kb的5′上游调控序列，6.1kb的编码序列包含内含子和外显子，0.4kb的pdk-1型使用QIAquick（Qiagen）纯化3′UTR，并以10 ng/μl的浓度注射ttx-3型：：50 ng/μl的GFP（pPD95.75-C40H5-GFP O.Hobert，MGH和哈佛医学院）作为联合注射标记物(Mello等人，1991年).pdk-1（KD）以相同的方式构建和注射，不同之处在于使用PCR引物来引入K98N突变。一旦数组建立为野生类型，它们就被交叉成年龄1（mg44）背景。为了在野生型背景下对阵列进行评分，允许妊娠成虫在25°C下产卵3小时。所有动物在产卵后72小时进行评分。要在年龄1背景，允许妊娠成人在25°C下产卵5小时。所有动物在产卵后72小时进行评分。有关表中使用的类别的描述​表4，4，请参阅“pdk-1（mg142）材料和方法的dauer地层分析部分。表中的数字​表44代表两个独立的转基因株系的总数pdk-1（KD）(镁Ex464和mgEx465）和三个独立的转基因株系pdk-1型(+) (mgEx467、mgEx468、和mgEx469）对于每个基因型。这个也一样pdk-1型构造被注入ttx-3型：：GFP进入sa680标准和sa709标准用于拯救Daf-c表型的菌株（挽救的1/2株系sa680标准和三分之三的线路获救sa709）.

寿命测定

动物在20°C下生长至L4幼虫期，然后转移到含有400μ米25°C下的氟脱氧尿苷（Sigma）。随后每1-3天对动物进行一次评分，并定期移动以保持生长条件无霉菌。如果用白金丝轻轻敲打动物的头部和尾部，它们没有反应，则被判为死亡。寿命定义为动物处于L4幼虫期的天数(t吨 = 直到动物被评分为死亡的那一天。一个t吨-进行测试以成对比较每个菌株的平均寿命。

PDK-1/GFP表达

PDK-1/GFP平移融合构建如下。基因组DNA的9-kb PCR产物pdk-1型基因组区域包括2.9kb的5′上游调控区和6.1kb的编码区，包括外显子和内含子，通过PCR在框架内融合到GFP中unc-54号机组pPD95.75的3′UTR PCR产物（马里兰州巴尔的摩华盛顿卡内基研究所A.Fire）。使用QIAquick（Qiagen）纯化PCR产物，并注射角色-6（pRF4，100 ng/μl）作为共射标记(Mello等人，1991年). 在紫外显微镜下，将蠕虫麻醉在5μ米NaN公司_三M9缓冲器，安装在2%琼脂糖垫上。三个独立的转基因株系(镁Ex479,镁Ex480、和mgEx481）对PDK-1/GFP的表达模式进行评分。

我们感谢P.Delerme和Y.Liu提供的专家技术援助；Y.Kohara提供cDNA；O.Hobert和B.Reinhart为细胞识别提供帮助；J.Avruch，关于PDK1特别是胰岛素信号传导的讨论；J.Hogan帮助进行PDK1-PKA晶体结构比较；以及井上俊彦（T.Inoue）和鲁夫坤实验室的成员，以获得有用的建议和对手稿的批判性阅读。本研究中使用的一些菌株由秀丽线虫遗传中心，由国家研究资源中心支持。医学硕士是霍华德·休斯医学院的博士生研究员。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予G.R.的RO1AG14161和授予A.T.的RO1 CA75134的资助。

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