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.1998年12月；18(12):7106-18.
doi:10.1128/MCB.18.12.7106。

YY1-结合元件在复制依赖性小鼠组蛋白基因表达中的作用

K A Eliassen公司 1, A鲍德温, E M西科尔斯基, M M受伤
附属公司

YY1-结合元件在复制依赖性小鼠组蛋白基因表达中的作用

K A埃利亚森等。 摩尔细胞生物学. 1998年12月.

摘要

当细胞进入真核细胞周期的S期时，高度保守的复制依赖性组蛋白基因家族的表达显著增加。体内正常组蛋白基因表达的要求包括位于核小体组蛋白基因的蛋白质编码序列内的一种被命名为α的元素。突变小鼠H3.2α元件的7个核苷酸中的5个，以产生在H3.3复制无关变体中发现的序列，从而消除体外DNA-蛋白质相互作用，并将体内表达降低四倍。HeLa细胞cDNA文库的酵母单杂交筛选鉴定出负责识别组蛋白H3.2α序列的蛋白质为转录因子阴阳1（YY1）。YY1是一种普遍存在且高度保守的转录因子，据报道参与基因表达的激活和抑制。在此，我们报告了体外组蛋白α-DNA蛋白相互作用依赖于YY1，体外组蛋白alpha-DNA与YY1相互作用所需核苷酸的突变改变了小鼠体内H3.2基因的细胞周期特异性上调。由于组蛋白α序列的所有突变或缺失都会在体外消除相互作用并导致体内组蛋白基因表达减少，因此YY1对组蛋白α元素的识别与体内复制依赖性组蛋白基因的正确时间调控有关。

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数字

图1
图1
解救质粒的限制性分析。从阳性克隆中拯救质粒，用巴姆HI和千磅我用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段后进行比较。识别出的四个独特cDNA显示在通道1至4中。M、 标记。
图2
图2
人类、小鼠和青蛙YY1的蛋白质序列比较。线条开头的数字表示氨基酸数量。星号表示小鼠和青蛙YY1之间的氨基酸变化；加号表示小鼠和人YY1之间的氨基酸变化。一个倒三角形标志着人类cDNA克隆1的开始（图1）。克隆1的序列从三角形延伸到蛋白质的末端。显示了导致四个潜在锌指（a到d）的C和H残留物。材料和方法中给出了YY1克隆的GenBank登录号。
图3
图3
腺相关病毒P5-60 YY1结合位点与H3.2α元素竞争组蛋白α因子的结合。在所有反应中，将小鼠骨髓瘤细胞核提取物（A和B，4μg）或酵母全细胞提取物（C，15μg）与末端标记的H3.2α双链寡核苷酸（A和C）或P5-60双链寡核苷酸（B）（1 ng）在非特异性竞争物poly（dI-dC）–poly（d I-dC未标记的竞争对手双链寡核苷酸以50或100倍摩尔过量添加。车道1，控制反应；通道2和3、4和5、6和7、50和100倍的寡核苷酸过量。（C） 如材料和方法中所述，从对照H3.2报告菌株和含有激活H3.2报告基因的cDNA的酵母菌株（表1）制备酵母全细胞提取物。竞争反应再现了面板A和B中所示的反应。Lanes 9至15是与H3.2α探针结合反应的结果，其中添加了酵母菌株3的全细胞提取物；车道16和17，与酵母菌株2和4的全细胞提取物反应。用EMSA分析反应。（D） 组蛋白αDNA结合位点与YY1 P5-60 DNA结合部位的比较，装箱序列与α因子的相互作用；−，无结合活性（3、4、36）。
图4
图4
（A） YY1通过体外αDNA结合活性进行生化铜净化。通过Western分析，对上述各通道柱中含有αDNA结合活性的透析混合组分的等分样品进行YY1检测。1巷，粗核提取物；泳道2，双链小牛胸腺DNA纤维素；3号车道，DEAE-Sepharose；车道4，羟基磷灰石（HA）；车道5，YY1对照（人重组YY1）。用SDS-PAGE分离混合组分中的蛋白质，并将其电印迹到聚偏二氟乙烯膜上，以便用多克隆抗人YY1抗体进行Western分析。有关柱色谱的详细信息，请参见材料和方法。（B） YY1抗体减少组蛋白α位移。所有通道中的反应均包含4μg粗核提取物和2μg聚（dI-dC）–聚（dI-dC），并在4°C下培养20分钟。通道1至3中的探针为1 ng末端标记的H3.2α寡核苷酸。车道1，控制α反应；第2道，在20分钟孵育结束后再添加2μl免疫前血清15分钟；通道3，20分钟后添加2μl抗YY1抗体并孵育15分钟。通道4至7中的探针为1 ng末端标记的Oct-1共识结合位点。车道4，控制10月1日的反应；车道5，未标记10月1日双工的100倍摩尔过剩；车道6，按车道2添加2μl免疫前血清；第7道，添加2μl抗YY1抗体，如第3道所示。用EMSA分析反应。（C） YY1的免疫缺失消除了粗核提取物中的α-DNA结合活性。核提取物中YY1免疫沉淀的详细信息见材料和方法。通道1至6显示了未填充粗核提取物（C，通道1，15μg蛋白质）、整个免疫沉淀部分（I，通道2，5和6，20μl珠混合物）、上清液部分（S，通道3，15μg/蛋白质）和洗脱液部分（E，通道4，30μl）的Western分析结果。第7条至第9条显示了EMSA的结果，其中含有未提取的粗核提取物（C，第7条，6μg蛋白质）、上清液部分（S，第8条，6微克蛋白质）和从免疫沉淀中洗脱的蛋白质（E，第9条，1/10洗脱液部分）。EMSA的反应条件与图3A泳道1所示的反应条件相同。
图5
图5
组蛋白α元件（YY1-结合位点）的突变导致α复合物在体外消失。从适当的H3.2基因中切除野生型（wt）或突变型CRAS片段萨尔我和斯图I.最终标记的片段与粗核提取物一起用于EMSA。反应条件与图3A车道1中使用的反应条件完全相同。用作探针的突变片段显示在车道上方。各种突变基因中H3.2α序列中的核苷酸变化如表2所示。
图6
图6
H3.2 CRASα元件中YY1-结合位点的突变改变了周期性CHO细胞同步群体中组蛋白基因的上调。（A） 通过有丝分裂振荡获得的同步细胞群被镀在玻片上，固定，并在指定的时间进行染色。用BrdUrd标记细胞，用FastRed染料检测S期细胞（见材料和方法）。百分比表示所示时间内S阶段的细胞数量。（B） 稳定转染细胞同步群体中H3.2 RNA的S1核酸酶保护试验，与面板A中所示的细胞平行放置（通道1至5，稳定转染小鼠H3.2-614基因的CHO细胞；通道6至15，稳定转播H3.2αXba基因的CHO-细胞）。野生型（wt）H3.2基因（1到5道）或H3.2αXba基因（6到10道）在萨尔基因的I位点，用作探针，绘制小鼠和内源性仓鼠H3.2转录本的图谱（见材料和方法）。EF-1α基因（24）在Nco公司我在第11至15道所示分析中使用的场地。第6和第11、第7和第12、第8和第13、第9和第14、第10和第15通道中使用的RNA样本是相同的。M、 标记；Asy，异步。（C） 野生型和突变型小鼠H3.2基因在0-5小时内组蛋白基因表达上调的比较。通过至少三个独立实验的磷光成像仪分析进行定量。
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