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.1998年11月16日；143(4):973-90.
doi:10.1083/jcb.143.4.973。

通过对志贺毒素B片段转运的研究揭示了早期/再循环内体到高尔基体的直接途径

F马拉德 1, C安东尼, D Tenza公司, J萨拉默罗, B Goud公司, L约翰内斯
附属机构

志贺毒素B片段转运研究揭示了早期/循环内体到高尔基体的直接途径

F马拉德等。 J细胞生物学. .

摘要

志贺毒素和该家族的其他毒素可以逃离内吞途径，到达高尔基体。为了使内体与高尔基体运输同步，在低温下将志贺毒素B片段内化到HeLa细胞中。在这些条件下，该蛋白与晚期内吞途径的标记物分离，并与共内部化的转铁蛋白广泛共定位。在随后的37℃孵育后，冷冻切片的超微结构研究未能在多泡或多层晚期内胚体中检测到B片段特异性标记，这表明该蛋白在进入高尔基体的过程中绕过了晚期内吞途径。通过活细胞上的定量共焦显微镜和B片段硫酸化分析确定的B片段运输的快速动力学进一步支持了这一假设，通过观察，在晚期内吞途径中调节囊泡转运的肌动蛋白解聚和pH-中和药物对高尔基体中的B片段积累没有影响。早期/再循环内体水平上的B片段分选似乎涉及囊泡外壳，因为布雷费尔丁A处理导致B片段在转铁蛋白受体膜小管中积聚，并且B片段与早期/再循环外体上的衔接蛋白1型网格蛋白外壳成分共定位。因此，我们假设志贺毒素B片段直接从早期/再循环内体运输到高尔基体。根据我们的发现，TGN38在从质膜到TGN的转运过程中与B片段共定位，这一途径也可用于细胞蛋白。

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数字

图3
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B片段从EE/RE转运到高尔基体的动力学。(A类)活HeLa细胞的共焦显微镜。将荧光标记的B片段在19.5°C内化到HeLa细胞中1 h，然后将细胞转移到共焦显微镜阶段，并在37°C孵育。在指定的时间点采集数字图像（四个集成帧）。请注意，4分钟后，在外围结构中检测到B片段，然后集中在核周区域。(B类)图像如所示A类定量，平均高尔基体相关荧光与平均总细胞相关荧光的比值表示为37°C下孵育时间的函数。显示了八个实验的平均值（±SE）。曲线拟合到（f）（x） =1+2.97[1−exp（−0.036×）]，第页= 0.9979. (C类)硫酸化分析。B-（硫）2在19.5°C内化到HeLa细胞中，然后将细胞转移到37°C。在0、15、30、60和90分钟后，添加放射性硫酸盐15分钟。注意B-（Sulf）2在15-30分钟的时间间隔内，TGN中的浓度达到峰值。显示了2个实验的代表。在每个实验中，数据点都是一式两份的。(D类)B片段和Tf在活细胞中的共转运。在37°C下的第3点和第10分钟，荧光偶联的B片段和荧光偶联的Tf按照A类在37°C下30分钟的时间点，仅B片段在37°C下持续内化，然后固定细胞并对其进行TfR染色。注意，B片段集中在高尔基地区(大箭头在10分钟)而剩余的细胞质B片段结构始终是Tf(4和10分钟)或TfR(30分钟)积极的，积极的(小箭头在30分钟). 通过共焦显微镜获得单个光学切片。
图3
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从EE/RE到高尔基体的B片段运输动力学。(A类)活HeLa细胞的共焦显微镜。将荧光标记的B片段在19.5°C内化到HeLa细胞中1 h，然后将细胞转移到共焦显微镜阶段，并在37°C孵育。在指定的时间点采集数字图像（四个集成帧）。请注意，4分钟后，在外围结构中检测到B片段，然后集中在核周区域。(B类)图像如所示A类定量，平均高尔基体相关荧光与平均总细胞相关荧光的比值表示为37°C下孵育时间的函数。显示了八个实验的平均值（±SE）。曲线拟合到（f）（x） =1+2.97[1−exp（−0.036×）]，第页= 0.9979. (C类)硫酸化分析。B-（硫）2在19.5°C内化到HeLa细胞中，然后将细胞转移到37°C。在0、15、30、60和90分钟后，添加放射性硫酸盐15分钟。注意B-（Sulf）2在15-30分钟的时间间隔内，TGN中的浓度达到峰值。显示了两个典型实验。在每个实验中，数据点都是一式两份的。(D类)B片段和Tf在活细胞中的共转运。对于37°C下的点3和10分钟，荧光团偶联的B片段和荧光团偶联的Tf被内化，如A类在37°C下30分钟的时间点，仅B片段在37°C下持续内化，然后固定细胞并对其进行TfR染色。注意，B片段集中在高尔基地区(大箭头在10分钟)而剩余的细胞质B片段结构始终是Tf(4和10分钟)或TfR(30分钟)积极的，积极的(小箭头在30分钟). 通过共焦显微镜获得单个光学切片。
图3
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从EE/RE到高尔基体的B片段运输动力学。(A类)活HeLa细胞的共焦显微镜。将荧光标记的B片段在19.5°C内化到HeLa细胞中1 h，然后将细胞转移到共焦显微镜阶段，并在37°C孵育。在指定的时间点采集数字图像（四个集成帧）。请注意，4分钟后，在外围结构中检测到B片段，然后集中在核周区域。(B类)图像如所示A类定量，平均高尔基体相关荧光与平均总细胞相关荧光的比值表示为37°C下孵育时间的函数。显示了八个实验的平均值（±SE）。曲线拟合到（f）（x） =1+2.97[1−exp（−0.036×）]，第页= 0.9979. (C类)硫酸化分析。B-（硫）2在19.5°C内化到HeLa细胞中，然后将细胞转移到37°C。在0、15、30、60和90分钟后，添加放射性硫酸盐15分钟。注意B-（Sulf）2在15-30分钟的时间间隔内，TGN中的浓度达到峰值。显示了2个实验的代表。在每个实验中，数据点都是一式两份的。(D类)B片段和Tf在活细胞中的共转运。在37°C下的第3点和第10分钟，荧光偶联的B片段和荧光偶联的Tf按照A类在37°C下30分钟的时间点，仅B片段在37°C下持续内化，然后固定细胞并对其进行TfR染色。注意，B片段集中在高尔基地区(大箭头在10分钟)而剩余的细胞质B片段结构始终是Tf(4和10分钟)或TfR(30分钟)积极的，积极的(小箭头在30分钟). 通过共聚焦显微镜获得单个光学切片。
图3
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从EE/RE到高尔基体的B片段运输动力学。(A类)活HeLa细胞的共焦显微镜。荧光团标记的B片段在19.5°C下内化到HeLa细胞中1小时，然后将细胞转移到共聚焦显微镜的台上，并在37°C下孵育。在指定的时间点采集数字图像（四个集成帧）。请注意，4分钟后，在外围结构中检测到B片段，然后集中在核周区域。(B类)图像如所示A类定量，高尔基体相关荧光平均值与细胞相关荧光平均总值的比值表示为37°C下孵育时间的函数。显示了八个实验的平均值（±SE）。曲线拟合到（f）（x） =1+2.97[1−exp（−0.036×）]，第页= 0.9979. (C类)硫酸化分析。B-（硫）2在19.5°C内化到HeLa细胞中，然后将细胞转移到37°C。在0、15、30、60和90分钟后，添加放射性硫酸盐15分钟。注意B-（Sulf）2在15-30分钟的时间间隔内，TGN中的浓度达到峰值。显示了两个典型实验。在每个实验中，数据点都是一式两份的。(D类)B片段和Tf在活细胞中的共转运。在37°C下的第3点和第10分钟，荧光偶联的B片段和荧光偶联的Tf按照A类在37°C下30分钟的时间点，仅B片段在37°C下持续内化，然后固定细胞并对其进行TfR染色。注意，B片段集中在高尔基地区(大箭头在10分钟)而剩余的细胞质B片段结构始终是Tf(4和10分钟)或TfR(30分钟)积极的，积极的(小箭头在30分钟). 通过共焦显微镜获得单个光学切片。
图5
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在向高尔基体转运期间，在晚期内吞途径的隔室中检测到B片段。(A类和B类)HeLa细胞与B片段和BSA-金（5-nm金颗粒）在19.5°C下孵育。冰冻切片用抗B片段抗体（10-nm金颗粒）染色。箭头在B类表示BSA-金浓度高的区域（体液相），没有B碎片。(C类)按中处理的细胞A类和B类然后移动15分钟至37°C，固定，然后用抗B片段抗体（15-nm金颗粒）和抗-CI-MPR抗体（10-nm金颗粒”）对冰冻切片进行染色。各种内吞结构用数字表示：面积1，BSA-gold–标记为EE；地区2、CI-MPR-和BSA-金-阳性多泡LE；地区三，CI-MPR–阳性多层LE。通用航空公司高尔基体。(D类)在19.5°C孵育后，BSA-金的定量-含有或不含B片段的阳性结构（车道1和2)或在额外切换至37°C 15分钟后（车道三和4). （车道1和三)也含有B片段的BSA-含金结构的百分比；（车道2和4)，BSA-含金结构，无B片段。棒材，100 nm。
图5
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在向高尔基体转运期间，在晚期内吞途径的隔室中检测到B片段。(A类和B类)HeLa细胞与B片段和BSA-金（5-nm金颗粒）在19.5°C下孵育。冰冻切片用抗B片段抗体（10-nm金颗粒）染色。箭头在B类表示BSA-金浓度高的区域（体液相），没有B碎片。(C类)在中处理的单元格A类和B类然后移动15分钟至37°C，固定，然后用抗B片段抗体（15-nm金颗粒）和抗-CI-MPR抗体（10-nm金颗粒”）对冰冻切片进行染色。各种内吞结构用数字表示：面积1，BSA-gold–标记为EE；地区2、CI-MPR-和BSA-金-阳性多泡LE；地区三，CI-MPR–阳性多层膜LE。通用航空公司，高尔基体。(D类)在19.5°C孵育后，BSA-金的定量-含有或不含B片段的阳性结构（车道1和2)或在额外切换至37°C 15分钟后（车道三和4). （车道1和三)也含有B片段的BSA-含金结构的百分比；（车道2和4)，BSA-含金结构，无B片段。棒材，100 nm。
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在向高尔基体转运期间，在晚期内吞途径的隔室中检测到B片段。(A类和B类)将HeLa细胞与B片段和BSA金（5-nm金颗粒）在19.5°C下孵育。冰冻切片用抗B片段抗体（10-nm金颗粒）染色。箭头在B类表示BSA-金浓度高的区域（体液相），没有B碎片。(C类)在中处理的单元格A类和B类然后转移15分钟至37°C，固定，然后用抗B片段抗体（15 nm金颗粒）和抗CI-MPR抗体（10 nm金颗粒）对冷冻切片进行染色。各种内吞结构用数字表示：面积1，BSA-gold–标记为EE；地区2、CI-MPR-和BSA-金-阳性多泡LE；地区三，CI-MPR–阳性多层膜LE。通用航空公司高尔基体。(D类)在19.5°C孵育后，BSA-金的定量-含有或不含B片段的阳性结构（车道1和2)或在额外切换至37°C 15分钟后（车道三和4). （车道1和三)也含有B片段的BSA-含金结构的百分比；（车道2和4)，BSA-含金结构，无B片段。棒材，100 nm。
图10
图10
γ-适应素阳性膜剖面的定量。(A类)B片段和Tf-HRP特异性金颗粒在γ-适应素阳性膜剖面中的分布。列表示B碎片的分数（车道1和2)在标记的γ-adaptin阳性结构中（lane2)或未标记（车道1)对于Tf-HRP，或Tf-HRP的分数（车道三和4)在标记的γ-适应性蛋白阳性结构中（泳道4)或未标记（车道三)B片段。(B类)γ-adaptin阳性结构的表征。注意，仅针对B片段标记了显著更多的γ-自适应蛋白阳性谱(左列)与仅标记为Tf-HRP的此类结构相比(右立柱). * 和**，直接比较表明这些条件有显著差异(P（P）< 0.01; 参见材料和方法）。
图9
图9
在EE/RE涂层膜剖面的超微结构水平上，γ-衔接素和甲氰菊酯与B片段和Tf-HRP共定位(A–E)将HeLa细胞与B片段和BSA金（5-nm金颗粒）在19.5°C下孵育1小时。这些细胞的冷冻切片用抗B片段抗体（15-nm金颗粒）和抗γ-适应抗体（10-nm金颗粒A–C)或抗氯氰菊酯抗体（10-nm金颗粒D类和E类). 在A–C，箭头表示γ-adaptin和B片段之间的共定位区域。在D类和E类箭头指出了网格蛋白和B片段之间的共定位区域。(F-I公司)将血清饥饿的HeLa细胞与B片段和Tf-HRP在19.5℃孵育1h。这些细胞的冰冻切片用抗B片段抗体（15-nm金颗粒）、抗HRP抗体（10-nm金粒子）和抗γ-适配蛋白抗体（5-nm金微粒）标记。箭头输入F类和G公司指向双标签或三标签的配置文件。(H（H）和我)选定结构的放大。棒材，100 nm。
图1
图1
在19.5°C孵育期间，B片段与已建立的内吞途径标记共定位的研究。以下蛋白质与HeLa细胞在19.5°C下孵育1小时：(A类)伦敦交通局(绿色)和B片段(红色)，一个大箭头表示核周染色区域；(B类)表皮生长因子(红色)和B片段(绿色)，箭头指出B片段和EGF染色并列的区域；(D类)TF公司(绿色)和EGF(红色); (E类)Dex3公司(绿色)和B片段(红色)，注意囊泡(大箭头)和尾巴一样(小箭头)Dex3染色。有关标记物浓度，请参见材料和方法。通过共聚焦显微镜获取数字图像（四个积分框）。右侧面板表示红色和绿色图像的叠加。插图以较高的放大倍数显示选定区域。在C类、EGF(红色)和B片段(绿色)在19.5°C下内化，如B类。然后将细胞移到37°C下10分钟，然后固定。注意，B片段和EGF特异性标记基本上没有重叠。
图2
图2
HeLa细胞中免疫电子显微镜显示的从EE/RE到高尔基体的B片段转运动力学。(A类)在19.5°C下将B片段内化1 h，按照材料和方法中的描述固定细胞并制备冷冻切片。在管状和囊泡元素中检测到B片段（10-nm金颗粒），这些元素也标记为TfR（15-nm金粒子）。将在19.5°C内化B片段的细胞移动2分钟(B类)，10分钟(C–D类)和30分钟(E类)至37°C。对冰冻切片进行B片段染色（10-nm金颗粒B类,C类、和E类; 15-nm金颗粒D类)和MPR46（15纳米金颗粒B类; 10-nm金颗粒D类). 对MPR46（in）进行双重染色的冰冻切片B类和D类)显示B片段通过TGN进入高尔基体。棒材，100 nm。
图4
图4
一部分内化的B片段再循环到质膜。FITC-标记的B片段在19.5°C下内化到HeLa细胞中，然后将细胞与抗FITC抗体在冰上孵育30分钟，并在持续存在抗FITC血清的情况下移动到37°C达指定时间。按照材料和方法中的描述，测定每个时间点的荧光，并与0时间点进行比较，以确定新回收的B片段引起的猝灭。显示了三个独立实验的平均值（±SE）。
图6
图6
药物对B片段向高尔基体转运的影响。HeLa细胞在19.5°C下与荧光标记的B片段孵育1小时，然后转移到37°C(A类)在缺席的情况下(CTL公司)或存在1μM Bafi或1μM CytoD，或(B类)在5μg/ml BFA存在下。然后固定细胞并用CTR433抗体标记(A类)或抗TfR抗体(B类). (C类)在Noc处理的HeLa细胞中，BFA抑制B片段向分散的高尔基池的转运。用10μM Noc预处理HeLa细胞1h。然后将细胞转移到冰上，用荧光标记的B片段孵育30分钟，清洗，然后在没有荧光标记的情况下将其转移30分钟至37°C(顶行)或存在(最下面一行)5μg/ml BFA，且持续存在Noc。然后固定细胞并对其进行高尔基体标记CTR433染色。注意，在没有BFA的情况下，与高尔基体分散池相关的B片段(顶部)在药物存在的情况下，CTR433阳性池中没有B片段(底部). 共聚焦显微镜获得四个光学切片。
图7
图7
量化药物对生物合成/分泌途径B片段转运的影响。(A类)HeLa细胞用1μM Bafi预培养2 h(开放式广场)和1μM细胞密度(开放式钻石). 然后将细胞转移到冰上，并与50nM碘化B-Glyc-KDEL一起孵育30分钟。洗涤后，在药物的持续存在下，将细胞转移到37°C。博鳌亚洲论坛(封闭式钻石)仅在温度变化至37°C时添加。控制单元(闭合的圆)没有接受药物治疗。在37°C下经过指定的时间后，在样品缓冲液中溶解细胞，然后在10-20%聚丙烯酰胺-SDS梯度凝胶上分析裂解产物，然后进行放射自显影。糖化B-糖苷KDEL的百分比以孵育时间的函数表示。显示了三个独立实验的平均值（±SE）。(B类)在19.5°C下，放射性标记的EGF内化到HeLa细胞中。然后在不存在的情况下将细胞转移到37°C(闭合的圆)或存在1μM Bafi(开放式广场)，1μM细胞密度(开放式圆圈)，或5μg/ml BFA(开放式钻石). 在37°C下经过指定的时间后，按照材料和方法中的说明测定培养基中TCA可溶计数的数量。显示了两个典型实验。(C类)碘代B-糖蛋白KDEL与HeLa细胞结合，如A类然后将细胞移到37°C，并在指定的时间后添加5μg/ml BFA（相对于B-Glyc-KDEL内化的开始，为−30 min至4 h）。37°C下4 h后，裂解细胞并测定糖化B-糖苷KDEL，如A类显示了两个实验的代表。
图8
图8
在19.5°C时，AP-1型网格蛋白外壳的γ-适应素亚基从TGN重新定位到EE/RE。荧光标记的B片段(A类和C类)在19.5°C下内化到HeLa细胞中1小时。然后直接固定细胞(A类和B类)，或切换30分钟至37°C(C类和D类)γ-adaptin固定和染色前(B类和D类). 注意，在19.5°C时，γ-adaptin和B片段在EE/RE上共定位(A类和B类)转移到37°C后，γ-adaptin重新定位到TGN，与高尔基池中的B片段积累平行(C类和D类).
图11
图11
在相同的结构中发现了B片段和抗TGN38，但没有发现抗-CI-MPR。(A类)荧光标记的B片段(左边)和抗TGN38抗体(正确的)与冰上的HeLa C7细胞结合，细胞在冰上37°C孵育10分钟(顶部)和60分钟(底部)在这两种蛋白持续存在的情况下。然后固定细胞并对其进行染色，以获得内部化的TGN38抗体(正确的). (B类)荧光标记的B片段(左边)和抗CI-MPR抗体(正确的)与冰上的HeLa细胞结合，细胞在冰上37°C孵育30分钟(顶部)和4小时(底部)在这两种蛋白持续存在的情况下。然后固定细胞并对其进行染色，以获得内化的抗CI-MPR抗体(正确的).
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