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.1998年10月；9(10):2767-84.
doi:10.1091/mbc.9.10.2767。

从内质网（ER）出口缺陷的Ste6p突变体揭示了酿酒酵母ER质量控制途径的一些方面

D罗伊萨 1, A Tam公司, W K施密特, S迈克利斯
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从内质网（ER）出口缺陷的Ste6p突变体揭示了酿酒酵母ER质量控制途径的一些方面

D罗伊萨等。 分子生物学细胞. 1998年10月.
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摘要

我们正在研究多跨膜蛋白Ste6p的细胞内转运，Ste6p是酿酒酵母中的a因子转运蛋白，也是ATP结合盒超家族蛋白的一员。在本研究中，我们使用Ste6p作为模型来研究内质网（ER）质量控制的过程，而对酵母内质网质量控制的了解相对较少。根据免疫荧光和亚细胞分馏测定，我们已经鉴定出三种异常保留ER的Ste6p突变形式。通过脉冲追踪代谢标记，我们证明这些突变体定义了两个不同的类别。I类的单一成员Ste6-166p高度不稳定。我们表明，它的降解涉及泛素-蛋白酶体系统，正如它在某些泛素-蛋白质体突变体中的体内稳定性或用蛋白酶体抑制剂药物MG132处理细胞时所示。两种II类突变蛋白Ste6-13p和Ste6-90p相对于野生型Ste6p是超稳定的，并且在ER膜中积累。这是首次报道酵母中的单一蛋白质，其不同的突变形式可以通过ER质量控制系统引导到不同的结果。我们认为这两类含ER的Ste6p突变体可能在酵母内质网质量控制的线性途径中定义不同的检查点步骤。此外，对其中一个ER标记的ste6突变体的交配缺陷的高拷贝抑制因子进行筛选后，发现了蛋白酶体亚基Hrd2p/p97，该亚基先前与ER膜中野生型羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的调节降解有关。

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图1
图1
与步骤6–13,钢6–90、和钢6–166突变。评估隔离物的配合缺陷钢6对突变体进行了定性平板杂交。的补丁材料一携带含有野生型或突变等位基因的质粒的菌株STE6标准被复制品印刷在材料α细胞在二倍体选择板上扩散。还进行了定量交配试验，如材料和方法所述，二倍体形成的效率（以野生型的百分比表示）显示在相应斑块的右侧。使用的菌株为：SM2918(钢6–13)，SM2919(钢6–90)，SM3661(钢6–166)和SM2914（野生型STE6标准). 菌株表达STE6标准来自2μ质粒。
图2
图2
三种Ste6p突变形式的ER通过免疫荧光进行了异常定位。通过与ER标记Kar2p的共同免疫荧光检测Ste6-HAp野生型和突变型的定位。Ste6p定位模式通过抗HA抗体染色（A–D，顶面板）显示，ER在相同细胞中的位置通过ER标记物Kar2p抗体染色（E–H，底面板）检测。二级抗体，罗丹明结合抗鼠和FITC-结合抗兔，分别用于检测Ste6-HAp和Kar2p。所用菌株与图1相同。值得注意的是，野生型和突变型钢6基因产物由高拷贝数表达(2μ)质粒，导致细胞间染色的可变性。与Ste6–166p代谢稳定性的显著下降一致（见图3），携带这种突变蛋白的细胞比例显示出可检测的免疫荧光，大大低于野生型Ste6p或Ste6–13p和Ste6–90p突变蛋白。为了清楚起见，显示了Ste6–166p最亮染色细胞的例子。
图3
图3
Ste6p野生型和ER染色突变形式的蔗糖梯度分离。按照材料和方法中的描述，对从野生型和突变菌株制备的总酵母裂解物进行蔗糖梯度分级。收集梯度部分，并分析总蛋白和标记酶的分布。Ste6p、Ste6–13p和Ste6–90p的分布通过抗HA抗体和HRP偶联羊抗鼠二级抗体的免疫印迹法测定，然后进行增强化学发光检测。虚线表示NADPH细胞色素定义的内质网微粒体峰值c（c）还原酶活性。使用的菌株为SM2544(▵钢6)转换为欧洲标准化委员会携带野生型Ste6p（pSM1085）、Ste6-13p（pSM1144）或Ste6-90p（pSM1084）的质粒，每个质粒都标记有HA表位。
图4
图4
Ste6-13p、Ste6-90p和Ste6-166p根据异常代谢稳定性定义了两类。ER-localized的代谢稳定性钢6通过脉冲相位分析检测突变体。用Express脉冲标记细胞10分钟35S、 并按照指示的时间（min）追踪标签。用抗HA抗体从总提取物中免疫沉淀Ste6-HAp的野生型和突变型，并在8%凝胶上用SDS-PAGE分析免疫沉淀。使用Imagequant软件通过PhosphorImager分析检测并量化条带。Ste6p半衰期（t1/2)显示在每个面板的底部。菌株如图1所示。
图5
图5
ER-localized的映射和序列钢6等位基因。（A） 预测膜中Ste6p的结构。ER放大钢6突变聚集在Ste6p的C末端胞质区域附近的50个氨基酸区域内，如图所示。NBD的Walker A和B站点用粗线表示。还指出了三重HA标记在第一个细胞外环中的位置，该环以Ste6p的“Ecto标记”形式存在，在一些实验中使用。不稳定的I类和超稳定的II类突变分别用阴影和开放的圆圈表示。（B） 氨基酸序列STE6标准在中受影响钢6–13,钢6–90、和钢6–166。所示的Ste6p区域包括Walker B位点和C末端NBD的侧翼区域，并与Ste6p的N末端半部分以及CFTR和MDR的N末端和C末端半部分中的相应片段对齐。在至少50%的残留物中相同的残留品用黑色装箱，而那些相似的则用灰色框起来。使用ClustalW程序进行校准，使用Boxshade程序对保守和类似残基进行着色。等位基因的名称和残基变化显示在Ste6p的C-半序列中的相应位置下方。Ste6–13p和Ste6–90p突变体有两个相邻的氨基酸变化，分别位于1201/1202和1245/1246位置。Ste6–166p，Q1249X的突变导致Ste6p的截短形式，预计其比全长蛋白质短42个氨基酸。
图6
图6
Ste6–166p的降解在第4周或第18–1秒突变体。在野生型中检测了野生型Ste6p和Ste6–166p的代谢稳定性，pep4Δ、和第18–1秒菌株。用Express脉冲标记细胞10分钟35S、 并按照指示的时间（min）追踪标签。按照图4图例和材料与方法中的描述，对条带进行免疫沉淀、检测和量化。标签第18–1秒在限制温度（37°C）下预培养40分钟后进行突变。等基因野生型第18节菌株被置于相同的温度变化下，在Ste6–166p的降解方面没有显著差异（我们的未发表结果）。通过检查同一提取物中的CPY加工过程，确认了嵌段的作用。CPY的p1（ER糖基化）形式在第18–1秒在限制性温度下突变，证实ER至高尔基体阻断。CPY积累的p2型和成熟的CPY在pep4Δ突变体，证实了液泡蛋白水解的缺陷（我们未发表的结果）。使用的菌株为SM3663(政治公众人物4[CEN标准6:：HAe])，SM3664(政治公众人物4[CEN标准6–166:：HAe])、SM3665(pep4Δ[CEN标准6:：HAe])，SM3666(pep4Δ[CEN标准6–166:：HAe])，SM3662(第18–1秒[CEN标准6:：HAe])和SM2807(第18–1秒[CEN标准6–166:：HAe]).
图7
图7
Ste6–166p在泛素-蛋白酶体降解途径缺陷的突变体中稳定。如图4所示，通过脉冲相分析检查Ste6–166p的代谢稳定性。使用的菌株为SM3627（野生型[CEN标准6–166:：HAe])，SM3667型(ubc6、7Δ [CEN标准6–166:：HAe])和SM2734(doa4Δ[CEN标准6–166:：HAe]).
图8
图8
Ste6–166p的降解需要20S蛋白酶体的活性。如图4所示，通过脉冲相分析检查Ste6–166p的代谢稳定性。（A） 的标签前1–1前2–1突变体和等基因野生型菌株在37°C下预培养40分钟后进行。菌株为SM3289（野生型[CEN标准6–166:：HAe])和SM3291(前1–1前2–1[CEN标准6–166:：HAe])。（B） 为了评估蛋白酶体抑制剂MG132对Ste6–166p降解的影响，在标记之前，用50μM MG123在DMSO或DMSO中预处理细胞1小时。使用的菌株是SM3599(能量6Δ [CEN标准6–166:：HAe]).
图9
图9
即使在稳定的条件下，Ste6–166p也不会退出ER。通过免疫荧光检测泛素-蛋白酶体途径缺陷突变体中Ste6–166p的定位。在顶部面板中，使用抗HA抗体检测到Ste6–166p。在底部面板中，ER在同一细胞中的位置是通过与抗Kar2p抗体的共同免疫荧光来确定的。用于检测Ste6-HAp和Kar2p的二级抗体分别为罗丹明结合抗鼠和FITC-结合抗兔(ubc6、7Δ[2μste6–166:：HAe])和SM2731(doa4Δ[2μste6–166:：HAe]).
图10
图10
Ste6p野生型和突变型的泛素化。表达菌株STE6:：透明质酸和myc标记的泛素用于检测各种形式Ste6p的泛素化程度。用12CA5（抗HA）抗体对从这些菌株制备的蛋白质提取物进行免疫沉淀，以免疫沉淀Ste6p。免疫沉淀物在8%SDS凝胶上分离并转移到硝化纤维素。（A） 用9E10（抗myc）抗体探测膜，以检测泛素化形式的Ste6p。（B） 将膜剥离并用抗HA抗体重新处理，以检测提取物中存在的Ste6p的总量。左侧的条指示面板A和B上的相同位置。应变为SM3548([2μSTE6:：HAc，2μubi:：myc])，SM3668型([2μste6–13:：HAc，2μubi:：myc])，SM3550([2μste6–166:：HAe，2μubi:：myc])和SM3669([2μSTE6（未标记），2μubi:：myc]).
图11
图11
双突变体钢6–90,166表现出与单个突变体相同的超不稳定表型钢6–166.比较双重突变的效果钢6–90166带有单一突变等级6–90和钢6–166如图4所示，我们通过脉冲相位分析检查了这些等位基因编码的Ste6p的代谢稳定性。菌株为SM2569([2μSTE6:：HAe])，SM2919([2μste6–90:：HAc])，SM3154([2μste6–90/166:：HAe])和SM3156([2μste6–166:：HAe]).
图12
图12
人力资源D2是与钢6–90和第6–166页。（A） 对含有钢6–90突变整合在基因组中（顶行）并携带2μ没有插入物的质粒（左面板），人力资源D2（中间面板），或人力资源D2在唯一的囊II站点（右侧面板）。按照材料和方法以及图1图例中的说明选择二倍体。作为比较2μHRD2具有CEN标准6–166或集成钢6–13显示了（分别位于中间行和底部行）。菌株为：SM3460(钢6–90/仅矢量），SM3479(钢6–90[2μHRD2])，SM3674(钢6–90[2μHRD2填写]），SM3488([CEN标准6–166]/仅矢量），SM3486([CEN标准6–166/[2μHRD2])，毫米3461(钢6–13/仅矢量）和SM3884(步骤6–13/[2μHRD2])。（B） 高拷贝人力资源D2不抑制其他钢6等位基因。的相对位置钢6测试的突变在Ste6p的拓扑图上显示。开放方块代表钢6不受多拷贝抑制的等位基因人力资源D2，黑色方块是可以被抑制的等位基因人力资源D2.
图13
图13
酵母内质网质量控制模型。（A） ER质量控制被描述为一种包含至少两个“检查点”的线性途径。第一个检查点被认为是识别折叠不良的蛋白质（例如Ste6-166p），导致其泛素化和被蛋白酶体快速降解。蛋白质通过第一个检查点（即Ste6–13p和Ste6–90p），但仍然折叠错误，可能会滞留在第二个检查点。后者也可能导致内质网滞留，使错误折叠的蛋白质有更多时间正确折叠。清除上述两个步骤可能是野生型Ste6p退出内质网的先决条件，或者可能只影响Ste6p的突变形式。（B） 内质网质量控制表现为一种非线性分支途径，其中Ste6p的野生型和突变型被引导至不同的命运。
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