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.1998年9月7日；142(5):1313-24.
doi:10.1083/jcb.142.51313。

营养因子介导的蛋白质降解与蛋白质合成耦合对神经元大小稳态的控制

J L富兰克林 1, E M约翰逊
附属公司

营养因子介导的蛋白质降解与蛋白质合成耦合对神经元大小稳态的控制

J·L·富兰克林等。 J细胞生物学. .

摘要

我们证明NGF将交感神经元中长寿命蛋白质的降解速率与蛋白质合成速率耦合。以特定的百分比抑制蛋白质合成速率会使长寿命蛋白质的降解速率降低几乎相等的百分比，表明这两个过程之间几乎是1:1耦合。抑制蛋白质合成不影响短寿命蛋白质的降解速度。当蛋白质合成受到抑制时，半衰期增加的蛋白质池中包括肌动蛋白和微管蛋白。这两种蛋白质的半衰期均为几天，在蛋白质合成被完全抑制的三维时间内未出现降解。对其他七种长寿命蛋白质的半衰期进行了量化，发现当蛋白质合成被完全阻断时，半衰期增加了84-225%。降解-合成耦合保护细胞在合成减少期间免受蛋白质损失。去除NGF后，蛋白质合成速率大大降低，降解与合成之间失去耦合。解偶联导致细胞蛋白净损失和体细胞萎缩。我们认为，将蛋白质降解速率与蛋白质合成速率相结合是神经营养因子维持神经元大小和生长的稳态控制的基本机制。

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数字

图1
图1
交感神经元中细胞总蛋白的降解。(A类)在含有NGF的培养基中保存的培养物中TCA可沉淀计数损失的双相时间过程，并用1h热脉冲/1h冷切方案标记。(B类)在用24小时热脉冲/6小时冷切方案标记的培养物中TCA可沉淀计数损失的单相时间过程，然后在含有或缺乏NGF的培养基中保持。这种脉冲期程序导致了长寿命蛋白质的丰富标记。插图显示了剥夺NGF后30小时内培养基中出现的TCA可沉淀计数。插图中的开放方块显示了来自缺乏NGF并通过1μg/ml CHX维持存活状态的培养物的数据。CHX防止TCA可沉淀计数损失到培养基中。插图中的其他符号的含义与主图形中的相同。在培养基中发现了从细胞中消失的酸-可沉淀计数，即酸-可溶解计数，表明蛋白质完全降解为氨基酸，并且氨基酸从细胞中释放出来（未显示）。(C类)CHX（1μg/ml）在存在或不存在NGF的情况下不会影响降解速度更快的成分。然而，在NGF存在但不存在的情况下，CHX处理阻止了降解较慢的成分。虚线与图1中的拟合线相同A类. (D类)在存在NGF的情况下，CHX（1μg/ml）几乎完全阻断了长寿命蛋白质库的降解，但在不存在NGF的情况下并非如此。虚线与图1中的拟合线相同B类数据显示为初始时间点测得的TCA可沉淀计数百分比(T型 0).n个=19–50个培养物，每个数据点2到5个镀层A类和C类.英寸B类和D类,n个=23–40个培养基，每个数据点有3到4个单独的镀层，但插图除外，其中n个=每个数据点的单个电镀中的4种培养物。直线是两个指数方程与A类和C类和单指数方程B类和D类。插图中的行未与数据相匹配。曲线拟合A类由于降解开始之前的滞后阶段，在6小时时开始。因为，在CHX的见证下(C类)这可能是由于标记氨基酸的细胞质池在标记被细胞外洗脱后继续并入蛋白质中所致。
图2
图2
CHX（1μg/ml）抑制蛋白质合成对交感神经元中个别蛋白质物种降解的影响。显示单个蛋白质衰变时间过程的自射线照片。CHX在培养基中存在NGF时抑制降解，但在没有NGF时不抑制降解。蛋白质条带的分子量（kD）显示在右侧。当CHX和NGF同时存在于培养基中时，肌动蛋白的衰变在72小时内被完全阻断。在缺乏NGF的CHX维持培养物中，降解与不含CHX的NGF维持的对照细胞中的降解大致相同。(C类)对保存在含有NGF的培养基中的培养物进行CHX处理也能完全阻断微管蛋白的降解。与肌动蛋白一样，在没有NGF的情况下，衰变与在没有CHX的NGF中维持的对照细胞几乎相同。(D类)分子量为100 kD的蛋白质的降解被抑制，但未被NGF维持培养物中CHX的存在完全阻断。同样，当NGF缺失时，CHX不影响该蛋白的降解。我们之前已经确定了A类如肌动蛋白和微管蛋白（未显示）。所示的每条带可能包含一种以上的蛋白质。例如，微管蛋白带同时包含α和β微管蛋白。n个每个数据点的2到3个单独镀层=3–9。为了量化降解，将所有蛋白带的密度归一化为T时的密度0在同一张放射自显影上。
图3
图3
翻译和转录抑制剂以及提取NGF对蛋白质合成速率的剂量和时间依赖性抑制。(A类)神经元暴露于不同浓度的CHX 4小时或72小时后，蛋白质合成速率受到抑制的剂量/反应曲线相似。(B类)翻译抑制剂ANIS也能快速、持续地抑制蛋白质合成速率。(C类)转录抑制剂ACT D导致合成抑制缓慢发展。(D类)NGF停药后蛋白质合成速率下降的时间过程。n个=11–36个培养物，每个数据集2到4个镀层，NGF停药数据除外，其中n个=单个镀层的每个数据点为6至7。曲线是逻辑方程对数据的最佳最小二乘拟合。
图4
图4
翻译和转录抑制剂对长寿命蛋白质降解的剂量依赖性抑制。(A类)CHX对蛋白质降解的影响。(B类)ANIS对蛋白质降解的影响。(C类)ACT D对蛋白质降解的影响。(D类)长寿命蛋白质的降解速率是蛋白质合成速率的线性函数。72小时内蛋白质合成速率的抑制导致同一时期蛋白质降解速率几乎相同的百分比降低。降解速率常数(k个 d日)因此，与蛋白质合成的速率常数类似(k个 秒). CHX和ANIS在较高浓度下的偏差较大（即蛋白质合成和降解较低），这是因为ANIS在完全抑制蛋白质合成的浓度下抑制蛋白质降解的效果不如CHX（图3，A类和B类，和图4B类). 这种差异可能是由ANIS的轻微毒性引起的，因为ANIS的浓度仅略高于此处所示的浓度，因此产生了严重的毒性效应。CHX在任何测试浓度下均无明显毒性作用。另一种蛋白质合成抑制剂，嘌呤霉素对细胞具有高度毒性（数据未显示）。神经元A–C标记如图1所示，B类和D类在初始时间点后72小时测量剩余TCA可沉淀计数。n个=12–31个培养物，每个数据点2到3个单独的镀层A–C.中的曲线A类和B类是logistic方程对数据的最佳最小二乘拟合。蛋白质合成数据D类是图3中72小时的数据，A类和B类降解数据来自图4，A类和B。直线是CHX和ANIS数据的线性回归或两个数据集的组合(实线).
图5
图5
NGF戒断诱导的细胞凋亡前的体细胞萎缩似乎是由总细胞蛋白减少引起的。(A类)显示NGF剥夺后萎缩的相位对比显微照片。左侧，对照细胞保存在含有NGF的培养基中；中间的细胞在NGF中保存并暴露于CHX（1μg/ml）30 h，细胞体直径与对照细胞相似；正确的细胞在1μg/ml CHX中维持30小时后，细胞体缩小。(B类)接受指定治疗的神经元平均体直径变化的时间过程。插图显示了不同时间点的计算细胞体积；计算假定躯体大致为球形。(C类)接受指定处理30小时的培养物的总蛋白质含量。星号，与初始时间点测得的蛋白质含量存在显著差异。数据代表了三个单独的实验。对于每个实验治疗和部分时间点，对随机选择的视野拍摄了大约20张相控显微照片B类测量了这些照片中相-右体的直径。在24小时和30小时的时间点，缺乏NGF的培养物中的许多细胞已经死亡，并作为碎片留在培养皿中。在这些时间点，只测量了存活细胞的直径（相位亮度）。在显示的时间段内，没有一个被剥夺NGF并维持在CHX中的细胞碎裂或死亡。n个=50，从单个镀层中的每个点算起B类.n个=10–16，每种条件下的单个镀层C类所有处理在电镀后5天开始。棒材，10μm。
图5
图5
退出NGF诱导的细胞凋亡前的体细胞萎缩似乎是由细胞总蛋白减少引起的。(A类)显示NGF剥夺后萎缩的相位对比显微照片。左侧，对照细胞保存在含有NGF的培养基中；中间的细胞在NGF中保存并暴露于CHX（1μg/ml）30 h，细胞体直径与对照细胞相似；正确的细胞在1μg/ml CHX中维持30小时后，细胞体缩小。(B类)接受指定治疗的神经元平均体直径变化的时间过程。插图显示了不同时间点计算的细胞体积；计算假定躯体大致为球形。(C类)接受指定处理30小时的培养物的总蛋白质含量。星号，与初始时间点测得的蛋白质含量存在显著差异。数据代表了三个单独的实验。对于每个实验治疗和部分时间点，对随机选择的视野拍摄了大约20张相控显微照片B类测量了这些照片中相-右体的直径。在24小时和30小时的时间点，缺乏NGF的培养物中的许多细胞已经死亡，并作为碎片留在培养皿中。在这些时间点，仅测量存活的细胞（亮相）的直径。在显示的时间段内，没有一个被剥夺NGF并维持在CHX中的细胞碎片化或死亡。n个=50，从单个镀层中的每个点算起B类.n个=10–16，每种条件下的单个镀层C类所有处理在电镀后5天开始。棒材，10μm。
图5
图5
退出NGF诱导的细胞凋亡前的体细胞萎缩似乎是由细胞总蛋白减少引起的。(A类)显示NGF剥夺后萎缩的相位对比显微照片。左侧，对照细胞保存在含有NGF的培养基中；中间的细胞在NGF中保存并暴露于CHX（1μg/ml）30 h，细胞体直径与对照细胞相似；正确的细胞在1μg/ml CHX中维持30小时后，细胞体缩小。(B类)接受指定治疗的神经元平均体直径变化的时间过程。插图显示了不同时间点计算的细胞体积；计算假定躯体大致为球形。(C类)接受指定处理30小时的培养物的总蛋白质含量。星号，与初始时间点测得的蛋白质含量存在显著差异。数据代表了三个单独的实验。对每个实验治疗和部分时间点随机选择的视野拍摄了大约20张相控显微照片B类测量了这些照片中相-右体的直径。在24小时和30小时的时间点，缺乏NGF的培养物中的许多细胞已经死亡，并作为碎片留在培养皿中。在这些时间点，只测量了存活细胞的直径（相位亮度）。在显示的时间段内，没有一个被剥夺NGF并维持在CHX中的细胞碎片化或死亡。n个=50，从单个镀层中的每个点算起B类.n个=10–16，每种条件下的单个镀层C类所有处理在电镀后5天开始。棒材，10μm。
图6
图6
概要模型。(A类)蛋白质降解/合成耦合、大小稳态和生长稳态之间可能的关系示意图。(B类)通过一种介质控制蛋白质降解的假设模型，该介质因NGF的存在而变得短暂。
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