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。1998年9月；18(9):5308-19.
doi:10.1128/MCB18.9.5308。

SNAP-25样分子Vam7p和突触蛋白同源物Vam3p在酵母液泡蛋白运输中共同发挥作用

T K佐藤 1, T达索, S D Emr公司
附属机构

SNAP-25样分子Vam7p和突触蛋白同源物Vam3p在酵母液泡蛋白运输中共同发挥作用

T K佐藤等。 分子细胞生物学。 1998年9月。

摘要

分离酿酒酵母空泡形态发生所需基因产物的基因筛查确定了VAM7，该基因编码一种蛋白质，该蛋白质含有与神经元t-SNARE，SNAP-25（Y.Wada和Y.Anraku，J.Biol.Chem.267:18671-186751992；t。Weimbs，S.H.Low，S.J.Chapin，K.E.Mostov，P.Bucher，和K.Hofmann，Proc。国家。阿卡德。科学。美国94:3046-30511997）。对VAM7（VAM7（tsf））的温度敏感性功能（tsf，temperature-sensitive-for-function）等位基因的分析表明，VAM7基因产物直接作用于空泡蛋白转运。在非容许温度下孵育的vam7（tsf）突变细胞在通过不同的生物合成途径运输到液泡的多种蛋白质的递送方面表现出快速缺陷。电子显微镜在非允许温度下对vam7（tsf）细胞进行的检查显示，异常膜室的积聚可能代表未融合的转运中间产物。部分Vam7p定位于液泡膜。此外，VAM7显示了与液泡突触蛋白同源物VAM3的遗传相互作用。与遗传结果一致，Vam7p在含有Vam3p的复合物中物理相关，并且这种相互作用通过灭活酵母NSF（N-乙基马来酰亚胺敏感因子）同源物Sec18p而增强。除了线圈结构域外，Vam7p还包含一个假定的NADPH氧化酶p40（phox）（PX）结构域。当与vam3（tsf）突变结合时，该结构域中两个保守氨基酸的变化导致合成表型，这表明Vam7p功能需要PX结构域。这项研究为Vam7p和Vam3p在液泡膜上的功能和物理相互作用提供了证据，在液泡膜上，它们作为t-SNARE复合物的一部分发挥作用，该复合物是到达液泡的多种运输中间体对接和/或融合所需的。

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数字

图1
图1
液泡蛋白分选vam7型总悬浮液突变细胞。（A） TKSY43型(vam7型Δ）用互补质粒（pTKS30）或含有温度敏感性功能质粒转化的细胞(总悬浮液)等位基因vam7型（pTKS43ts-167）在允许温度（26°C）或非允许温度（38°C）下培养10分钟，然后用[35S] 半胱氨酸和[35S] 甲硫氨酸10分钟。随后用未标记的半胱氨酸和甲硫氨酸追赶细胞，并在指定的时间点收获。免疫沉淀ALP、CPY和CPS，SDS-PAGE解析，放射自显影。CPS样品在电泳前用内糖苷酶H处理。ER-修饰和Golgi-修饰CPY分别用p1CPY和p2CPY表示。指出了液泡蛋白的其他前体（p）和成熟（m）形式。（B） API交付vam7型总悬浮液细胞。TKSY43型(vam7型Δ）用互补质粒（pTKS30）或含有鞋面7总悬浮液等位基因（pTKS43ts-167）在非允许温度（38°C）下孵育10分钟，然后用[35S] 半胱氨酸和[35S] 蛋氨酸作用10分钟。随后用未标记的半胱氨酸和蛋氨酸追踪细胞，并在指定的时间点收获细胞。通过免疫沉淀从裂解液中回收API，通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行可视化。指出了前体API（prAPI）和成熟API（mAPI）。
图2
图2
超结构分析vam7型Δ和vam7型总悬浮液突变体。（A）野生型（SEY6210）和（B）的横截面vam7型Δ细胞在30°C下生长，EM观察。含有vam7型tsf公司在准备EM分析之前，将等位基因（TKSY43加上pTKS43ts-167）在允许温度（26°C）或非允许温度（38°C）下培养3小时（分别为C和D）。vam7型总悬浮液在非允许温度下，细胞除了一个显著的电子密度液泡隔室外，还积累了新的隔室。在非允许温度下3小时后，新的隔室（E）累积扩大，包括类似于多泡体的隔室扩大（F和G，箭头）蒸汽m3总悬浮液和第41版总悬浮液突变体。n、 细胞核；v、 液泡。棒材：A至D，500 nm；E至G，200 nm。
图3
图3
亚细胞定位VAM7型基因产物。（A） SEY6210（野生型）球形体（5 OD600单位）通过差速离心进行裂解和分馏（参见材料和方法），生成P13、P100和S100组分。TCA沉淀组分，2 OD蛋白质600单位通过SDS-PAGE进行解析。然后将分解的蛋白质转移到硝化纤维素中，用抗Vam7p抗体进行免疫印迹，并通过ECL荧光成像进行可视化。埃及118-110(第18-1秒)球状体被标记为[35S] 半胱氨酸和[35S] 蛋氨酸在允许温度（26°C）下保持30分钟，并追踪15分钟。然后细胞保持在允许温度或转移到非允许温度（38°C）再保持30分钟。在温度转移后，按照上述方法收集细胞并进行分馏。TCA沉淀的裂解物用抗Vam7p抗体免疫沉淀，用SDS-PAGE旋转，并用放射自显影术观察。（B） 从失活的P13组分中对Vam7p进行Accudenz梯度分析第18-1秒细胞。来自EGY118-110的P13分数(第18-1秒)将在非允许温度（38°C）下培养的细胞重新悬浮在含有60%Accudenz的裂解缓冲液中，并在60%–55%–35%Accudenx梯度的底部加载。200000×离心后克在14小时内，收集漂浮（F）、非漂浮（NF）和颗粒（P）级分，并通过蛋白质印迹进行分析。
图4
图4
GFP-Vam7p融合蛋白的定位。（A） CPY和ALP分拣缺陷的补充vam7型GFP-Vam7p融合蛋白的Δ突变体。TKSY43型(vam7型Δ）含有单个副本的单元格(中心)编码GFP-Vam7p融合蛋白的质粒（pTKS35）被标记为[35S] 半胱氨酸和[35S] 蛋氨酸在30°C下保持10分钟，并用未标记的半胱氨酸和蛋氨酸追赶指定的时间。免疫沉淀CPY和ALP，然后通过SDS-PAGE和放射自显影术观察。（B） TKSY43中GFP-Vam7p的Nomarski光学图像（左面板）和荧光定位（右面板）(vam7型Δ）含有GFP-Vam7p融合蛋白（pTKS35）的细胞。
图5
图5
之间的遗传相互作用VAM7型和鞋面3.（A）禁止vam7型总悬浮液和蒸汽m3总悬浮液突变细胞。TKSY43型(vam7型Δ）或TDY2(鞋面3Δ）包含总悬浮液任何一种的等位基因vam7型（pTKS43ts-167）或蒸汽m3分别用不含插入物的多拷贝向量（2μm）转化（pVAM3.6-416），VAM7型（pTKS23），或鞋面3（pVAM3.426），如图所示。收获在26°C下生长的细胞，在允许或不允许的温度下孵育10分钟，并用[35S] 半胱氨酸和[35S] 标记后，用未标记的半胱氨酸和蛋氨酸追踪细胞30分钟，然后用TCA沉淀法收集细胞。用所示抗体对这些细胞的裂解液进行免疫沉淀，并按前面所述进行分析。（B） 之间的合成相互作用vam7型总悬浮液和鞋面3总悬浮液.双突变菌株(vam3Δvam7Δ）窝藏蒸汽m3总悬浮液等位基因（pTKS30和pVAM3.6-416）vam7型总悬浮液等位基因（pTKS43ts-167和pVAM3-416），或两者总悬浮液等位基因（pTK43ts-167和pVAM3.6-416）在26°C下孵育10分钟，并用[35S] 半胱氨酸和[35S] 标记后，用未标记的半胱氨酸和蛋氨酸追踪细胞45分钟，收获细胞，并如上所述进行空泡蛋白分选分析。（C） 双突变细胞(pep12-60 vam7Δ）用含有VAM7型（pTKS30）或鞋面7总悬浮液等位基因（pTKS43ts-167）。如上所述，对单突变株和双突变株进行CPY分选分析。
图6
图6
Vam3p与Vam7p的天然免疫沉淀。球形塑料（5 OD600根据指示，从以下菌株中产生并在26或38°C下培养1小时：TKSY48(第18-1秒vam7Δ），SEY6210（野生型），EGY118-110(第18-1秒)，和CBY42(秒18-1 vam3Δ). 然后用0.5%Triton X-100溶解球状体，并在4°C下用抗Vam7p抗体孵育1 h，然后再添加蛋白A-Sepharose 1 h。用0.1%Triton X-100-洗涤结合免疫复合物，并用SDS-PAGE样品缓冲液从小球中洗脱。两个外径600-将单位样品加载到SDS-PAGE凝胶上，通过电泳进行解析，然后转移到硝化纤维纸上。分别用抗Vam3p和-Vam7p抗体免疫印迹Vam3p和Vam7p，并通过ECL荧光成像进行可视化。在总数中第18-1秒38°C提取物，5%的TCA沉淀并装载，以指示结合到Vam7p的总Vam3p量。
图7
图7
真空贩运缺陷VAM7型PX域突变体蒸汽m3总悬浮液突变。（A） 显示了Vam7p的PX结构域与参与囊泡运输的三种酵母蛋白的PX区域对齐。四个PX结构域之间同源性最高的区域由序列右侧和左侧的数字表示。间隙长度用括号表示。与Vam7p的PX结构域保守的至少两种其他蛋白质的氨基酸残基以黑色突出显示。与Vam7p-PX结构域残基类似的氨基酸残基以灰色表示。被改变的氨基酸(Y42A型和L48Q（L48Q）)在Vam7p序列上方用黑体表示。（B） 之间的合成相互作用鞋面7PX和蒸汽m3总悬浮液突变。标准脉冲相位分析vam3Δvam7Δ双突变体欧洲标准化委员会含有野生型的质粒VAM7型（pTKS30），突变型VAM7型编码酪氨酸42-丙氨酸(Y42A型)或亮氨酸48转谷氨酰胺(L48Q（L48Q）)突变和野生型鞋面3（pVAM3.416）或蒸汽m3tsf公司（pVAM3-6.416）等位基因。双突变体标记10分钟，并在26°C下追逐30分钟。
图7
图7
真空贩运缺陷VAM7型PX域突变体鞋面3总悬浮液突变。（A） 显示了Vam7p的PX结构域与参与囊泡运输的三种酵母蛋白的PX区域对齐。四个PX结构域之间同源性最高的区域由序列右侧和左侧的数字表示。间隙长度用括号表示。与Vam7p的PX结构域保守的至少两个其他蛋白质的氨基酸残基以黑色突出显示。与Vam7p-PX结构域残基类似的氨基酸残基以灰色表示。被改变的氨基酸(Y42A型和L48Q（L48Q）)在Vam7p序列上方用黑体表示。（B） 之间的合成相互作用vam7型PX和蒸汽m3总悬浮液突变。标准脉冲相位分析vam3Δvam7Δ双突变体欧洲标准化委员会含有野生型的质粒VAM7型（pTKS30），突变型VAM7型编码酪氨酸42-丙氨酸(Y42A型)或亮氨酸48转谷氨酰胺(L48Q（L48Q）)突变和野生型鞋面3（pVAM3.416）或蒸汽m3总悬浮液（pVAM3-6.416）等位基因。双突变体标记10分钟，并在26°C下追逐30分钟。
图8
图8
描述液泡处参与对接和/或融合的基因的模型。箭头所示，三种液泡蛋白通过不同的生物合成途径进入液泡。Vam7p和Vam3p在转运中间体与液泡的对接和/或融合中作为t-SNARE复合体发挥作用。其他被提议调控转运中间体与液泡的对接和融合的基因被括号括起来。这些之间的同源性VPS公司指出与囊泡对接和融合有关的基因和蛋白质（•）。图中还示意了Vam7p和Vam3p的PX域和线圈域。
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