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.1998年9月；18(9):5247-55.
doi:10.1128/MCB18.9.5247。

表皮生长因子样同源异型蛋白dlk的调节表达影响基质细胞-前B细胞相互作用、基质细胞脂肪生成和前B细胞白细胞介素-7的需求

S R鲍尔 1, M J Ruiz-Idalgo先生, E K鲁迪科夫, J戈尔茨坦, J拉博达
附属公司

表皮生长因子样同源异型蛋白dlk的调节表达影响基质细胞-前B细胞相互作用、基质细胞脂肪生成和前B细胞白细胞介素-7的需求

S R鲍尔等。 分子细胞生物学. 1998年9月.

摘要

基质细胞的脂肪细胞分化与其支持造血的能力密切相关。其分子基础尚不清楚。我们研究了dlk，一种干预脂肪生成和胎肝造血的表皮生长因子样分子，在已建立的前B细胞培养系统中是否影响基质细胞脂肪生成和B细胞淋巴生成。B细胞前培养需要可溶性白细胞介素-7（IL-7）和与基质细胞的相互作用来促进细胞生长并防止B细胞成熟或凋亡。我们发现BALB/c 3T3成纤维细胞表达dlk并作为基质细胞发挥作用。用反义dlk转染这些细胞可降低dlk的表达并增加胰岛素诱导的脂肪细胞分化。当反义转染剂用作基质时，IL-7不再需要支持前B细胞的生长并防止成熟或凋亡。在缺乏IL-7的情况下，S10基质细胞的反义dlk转染物也促进了前B细胞的生长。这些结果表明，dlk对基质细胞的调节可以影响其脂肪生成以及与之接触的前B细胞的IL-7需求。这些结果表明，dlk影响指向基质细胞和淋巴细胞前体的分化信号，提示dlk可能在骨髓造血环境中发挥重要作用。

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数字

图1
图1
反义dlk表达对BALB/c 3T3细胞的影响。用表达全长dlk cDNA的反义载体转染BALB/c 3T3细胞。（A） 用1μM胰岛素处理未转染（对照）细胞或混合反义转染物（AS dlk）7至10天，然后按照材料和方法中的描述，通过油红O染色评估脂肪细胞分化。深色区域表示脂质积聚。（B） 使用材料和方法中描述的dlk特异性兔抗血清，通过流式细胞术检测dlk的细胞表面表达。根据未转染BALB/c 3T3对照组、汇集的反义dlk转染体（AS dlk）和三个单独的反义转染克隆（Tr1、Tr2和Tr3）的细胞数绘制平均荧光强度。（C） Western blot分析转染反义dlk表达构建物的BALB/C 3T3细胞提取物中dlk的表达。车道：M，分子大小标记；E、，大肠杆菌谷胱甘肽S公司-转移酶-dlk融合蛋白（73-kDa分子量）；B、 未转染BALB/c 3T3细胞；T、 克隆Tr3；A、 抗体转染BALB/c 3T3细胞池。多条dlk带是由交替剪接或糖基化差异引起的。
图2
图2
基质细胞dlk表达减少对前B细胞生长的影响。（A） 前B细胞集落分析。在有或无IL-7的情况下，将D-1-3前B细胞接种在辐照BALB/c 3T3（对照）或dlk反义转染剂（AS-dlk）上的24孔培养皿中。将前B细胞接种在10倍稀释液中(x个轴），以及每次B细胞稀释前形成的菌落数(年轴）绘制。单个可识别的菌落数量最多的是40个，因此达到40+的条表示实际上是汇合的。条形高度表示重复井的平均值。（B） B细胞前生长分析。将前B细胞系D-1-3接种到六孔培养皿的孔中，在不含IL-7的情况下用辐照基质细胞层。对于未转染的BALB/c 3T3细胞或通过转染不含插入物的对照质粒或含有全长dlk cDNA的同一质粒（无论是顺义（sense dlk）还是反义（AS dlk）方向）制成的BALB/c 3T3细胞系，显示了在指定日期采集的双孔中存活的前B细胞的平均数量。对照系、正反义系在选择后合并。Tr3是AS dlk系的克隆衍生物。
图3
图3
转染BALB/c 3T3细胞的流式细胞术分析。（A） 用正反义dlk表达结构转染的细胞。比较CD44和IFN-γ受体（IFN-γ）的表达水平。（B） 用反义Notch构建物转染细胞。显示Notch、CD44和CD45RB的表达水平。较粗的线表示相应标记的特定染色，而虚线或较细的线表示未染色的对照。
图4
图4
强制下调S10基质细胞上dlk表达对前B细胞生长的影响。（A） 分析稳定转染正、反义dlk表达载体的S10细胞的dlk和CD44表达水平。较粗的线表示相应标记的特定染色，而较细的线表示未染色的对照。（B） 在使用D-1-3前B细胞系进行细胞集落分析时，转染的S10细胞也被用作基质。柱状图表示与每个孔接种的前B细胞数量相关的菌落数量。该键显示了什么结构被转染到S10细胞中。
图5
图5
基质细胞dlk表达减少对前B细胞分化的影响。（A） 使用所指示的抗体对在正常培养条件下用S10基质细胞和IL-7或不用IL-7在低dlk表达的反义转染子（如dlk或Tr3）上繁殖的D-1-3前B细胞进行细胞表面标记物分析。每个点图面板显示PE标记抗体的荧光强度（FL-2；年轴）绘制FITC-标记抗体（FL-1；x个轴）。（B） 通过使用逆转录-PCR对在正常培养条件下用S10基质细胞和IL-7（以+表示）繁殖的D-1-3前B细胞分离的RNA进行基因表达分析，或在低dlk表达的反义转染Tr3细胞（以−表示）上不使用IL-7。研究的基因显示在面板顶部。包括一个123-bp的梯子（通道M），用于测定PCR产品尺寸。左侧显示了标准的碱基对长度（MW）。
图6
图6
比较在有或无IL-7的情况下，在Tr3基质细胞上培养的小鼠胎肝细胞新鲜分离的前B细胞系和在有IL-7情况下在S10细胞上培养前B细胞株D-1-3所表达的标记。在有或无IL-7的情况下，胎儿肝细胞的发育集落在Tr3细胞上扩张。细胞类型缩写：FL，胎肝起源；Tr3，所用基质细胞；Isc，Iscove培养基–4%FCS；向培养基中添加IL-7和IL-7。流式细胞术分析前B表型的细胞标志物的表达，包括B220、ThB、CD43和BP-1。
图7
图7
几种基质细胞调节培养基对前B细胞生长的影响。（A） 在所示条件培养基或含有或不含IL-7的正常培养基中，S10基质细胞上培养的D-1-3前B细胞的凋亡动力学；（B） S10基质细胞上培养的D-1-3前B细胞在指定条件培养基中的细胞集落生长测定。
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