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.1998年9月；18(9):4949-60.
doi:10.1128/MCB18.9.4949。

HSP90与非洲爪蟾卵母细胞热休克因子1相互作用并调节其活性

A阿里 1, S巴拉德瓦吉, 罗·奥卡罗尔, N奥夫塞内克
附属机构

HSP90与爪蟾卵母细胞热休克因子1的相互作用及调节

A阿里等。 摩尔细胞生物学. 1998年9月.

摘要

热休克基因的转录激活是一个可逆的多步骤过程，涉及将非活性热休克因子1（HSF1）单体转化为热休克元素（HSE）结合同源三聚体、过度磷酸化以及诱导完全转录能力的进一步修饰。HSF1受多种调节机制控制，包括被额外的细胞因子抑制、与HSP70的物理相互作用以及整合到不同的细胞信号级联中。然而，细胞对应激反应和控制HSF1激活-失活途径的信号传导机制尚不清楚。在这里，我们证明了HSP90，一种已知的调节多种信号转导分子和转录因子的细胞伴侣，在HSF1的调节中发挥作用。HSF1-HSP90杂合物的存在表现为HSP90与未锁核和热休克核提取物中的HSF1共免疫沉淀，HSP90抗体在体外识别HSF1-HSE复合物，以及直接注射到卵母细胞核中的HSP90 Abs在体内识别HSF1。采用两种策略分析HSP90-HSF1相互作用的功能影响：直接核注射HSP90 Abs和用格尔德霉素（GA）处理细胞，GA是一种特异性阻断HSP90伴行活性的药物。HSP90 Abs和GA在热休克恢复过程中均延迟HSF1三聚体的分解，并在hsp70启动子的控制下特异性抑制氯霉素乙酰转移酶报告子构建物的热诱导转录。HSP90抗体在没有热休克的情况下激活HSE结合，这种作用可以通过随后注射纯化的HSP90逆转。GA在非休克条件下没有激活HSE结合，但增加了热休克诱导的HSE结合量。基于这些发现和HSP90的已知特性，我们提出了一种新的调控模型，其中HSP90在激活-去激活途径的不同点参与调控HSF1，影响单体构象和三聚体构象之间的相互转化以及转录激活。我们还提出了HSP90将HSF1与协调应激反应的细胞信号分子联系起来的假设。

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数字

图1
图1
HSP90-HSF1杂合物的鉴定爪蟾卵母细胞核。（A） 免疫印迹显示HSP90的亚细胞分布。卵母细胞在非休克（NS）温度（18°C）或热休克（HS）温度（33°C）下孵育2 h，用SDS-PAGE和纯化牛HSP90作为对照分离单个完整卵母细胞或核质组分的蛋白质。用HSP90 PAb检测HSP90。分子质量标准的位置如左图所示。（B） HSF1和HSP90从卵母细胞核共免疫沉淀。用兔抗鼠HSF1 PAb（55）或YY1 PAb（Santa Cruz）免疫沉淀HSF1和YY1。从非曲棍球或热休克（33℃，1 h）卵母细胞中分离出核提取物。将免疫沉淀材料进行SDS-PAGE并转移到硝酸纤维素中，并用HSP90和HSF1抗体进行印迹检测，如图所示。
图2
图2
在HSP90抗体凝胶迁移率变化分析中识别HSF1的热休克活化DNA结合形式。将等分的非曲棍球（NS）或热休克（HS）卵母细胞提取物与HSP90 MAb或PAb（抗血清）混合，并在与DNA结合反应之前培养30分钟32P标记的HSE探针和HSF1-HSE复合物的迁移在凝胶迁移率变化分析中进行了分析。显示提取物未与抗体混合的通道（−），面板上方显示提取物培养中的最终抗体稀释。指出了非特异性结合活性（ns）、热诱导（HSF1）和超位移（HSF1+ab）复合物的位置。
图3
图3
HSP90在体内与HSF1相互作用。（A） 未注射或微量注射HSP90 MAb的非曲棍球（NS）和热休克（33°C，2 h）卵母细胞的免疫印迹。用HSP90一级抗体检测HSP90，用二级抗体检测注射的HSP90抗体（如材料和方法所述）。右边显示了提取物中存在的内源性卵母细胞HSP90和注射的HSP90单克隆抗体。左侧显示了分子质量标准的位置。（B） 通过凝胶迁移率变化分析，对未注射或注射HSP90 MAb的卵母细胞进行HSF1-HSE复合物迁移分析，这些卵母细胞在33°C下未受休克（NS）或热休克（HS），时间为指定时间。热激活HSF-HSE（HSF1）和HSP90 Ab-超位移（HSF1+Ab）复合物如右图所示。ns，非特异性结合活性。（C） 用HSP90抗血清（pAb）进行了与B组相似的实验。
图4
图4
HSP90抗体在无应激条件下激活HSF1的HSE结合活性。（A） 左，未注射卵母细胞（−）和HSP90 Ab注射卵母公司（MAb或PAb）的凝胶迁移率变化分析，这些卵母细胞在非冲击温度（NS）下孵化或热休克1h（HS）。指出了热激活或Ab激活的HSF1-HSE复合物（HSF1）和HSP90-Ab超位移复合物（HSF1+Ab）的位置。右图，凝胶迁移率变化分析显示了共注射牛HSP90对HSF1-HSE复合物形成的影响。在第三条通道（+HSP90）中，在注射HSP90 PAbs后2 h，将50 ng纯化牛HSP90注射到卵母细胞中，并在非休克温度下孵育1 h ns后制备提取物，非特异性结合。（B） 注射PAbs的卵母细胞对抗YY1的底部凝胶迁移率变化分析（圣克鲁斯；见材料和方法）。顶部，未注射（uninj）和假注射（H）HSF1激活的比较2O） 或HSF1抗血清注射（HSF1 PAb）（55）卵母细胞。（C） 体内通过微量注射HSP90抗体识别HSF1。对未注射（−）或HSP90 MAb的卵母细胞进行凝胶迁移率变化分析。在一些通道中，将HSP90单克隆抗体或纯化牛HSP90添加到提取物中，如下图所示。在均质时（左起第五道），将HSP90（1μg）添加到注射Ab的卵母细胞中，并在DNA结合反应之前（左起的第七道和第八道），向未注射的热休克卵母细胞提取物中添加HSP90 MAb或蛋白（1μg/）。
图5
图5
HSP90 Abs可延迟体内HSF1的失活。将未注射或HSP90 MAb注射的卵母细胞在33°C下热休克1 h（HS），然后在18°C下恢复指定的时间段，并通过凝胶迁移率变化分析HSF1的HSE结合活性。热诱导和超移络合物在左侧均表示为HSF1。ns，非特异性结合活性。
图6
图6
微注射HSP90Abs抑制热诱导的HSF1转录活性。（A） 微量注射的卵母细胞CAT测定热休克蛋白70-CAT（左）或CMV-CAT（右）。在热休克（33℃持续1 h）处理（HS）前1 h向卵母细胞注射HSP90 MAb，并直接将每个启动子的表达与未注射Ab的类似处理卵母细胞的表达进行比较。每个实验用不同批次的卵母细胞重复至少五次，得出类似的结果。非乙酰化（Cm）和乙酰化（Ac）形式的位置[14C、 ]氯霉素显示在每个面板的左侧。背景非质粒注射卵母细胞的CAT活性如右图所示（续）。NS，无热休克。（B） 如上所述，用报告物微量注射卵母细胞进行CAT分析。将HSF1 PAbs注射到卵母细胞核中，基本上如上文所述。
图7
图7
（GA）增强HSF1的热诱导HSE结合活性并延迟恢复过程中的失活。（A） 卵母细胞在每毫升10μg GA（g）或DMSO（D）中孵育2小时，或在30°C下进行热休克前未经处理（U），孵育时间为指定时间。然后通过凝胶迁移率变化分析比较HSF1的HSE结合活性。（B） 如上所述用GA或DMSO处理的卵母细胞的凝胶迁移率变化分析，在33°C下热休克1小时，然后在18°C下恢复指定的时间段。激活的HSF1和非特异性（ns）条带的位置显示在每个面板的左侧。
图8
图8
GA抑制HSF1的热诱导转录活性。CMV-CAT的CAT活动-或热休克蛋白70-比较未经处理或经GA（10μg/ml，2 h）处理的CAT注射卵母细胞在18°C（NS）或热休克（HS）（33°C，2h）下孵育前的情况。每个实验用不同批次的卵母细胞重复至少五次，结果相似。非乙酰化（Cm）和乙酰化（Ac）形式的位置[14C] 左边是氯霉素。
图9
图9
HSP90调节HSF1的模型。我们的数据表明，HSP90与HSF1的非活性单体和活性三聚体形式相互作用，并可能参与调节这些形式（A和C）之间的相互转化。HSP90 Abs和GA均延迟三聚体分解并抑制HSF1（D）的热诱导转录。这些观察结果表明HSP90在调节转录激活域（B）中发挥作用，或者HSP90与三聚体分离是转录能力所必需的。我们还假设HSP90可以将HSF1连接到细胞信号分子（B）。HSF1结构的细节未显示，尽管从圆形到椭圆的形状变化旨在表明与三聚相关的构象变化。HSP90和HSF1之间的一对一化学计量关系没有数据，只是为了简单起见。尽管HSP70在这里没有代表，但我们并不意味着它没有参与任何这些过程。
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