Phosphorylation and activation of cAMP-dependent protein kinase by phosphoinositide-dependent protein kinase

doi:10.1073/pnas.95.17.9849

.1998年8月18日；95(17):9849-54.

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肌醇磷脂依赖性蛋白激酶对cAMP依赖性蛋白酶的磷酸化和活化

X Cheng（X城）¹, Y Ma公司, M摩尔, B A海明斯, S S泰勒

附属公司

PMID： 9707564
预防性维修识别码： PMC21425型
内政部： 10.1073/pnas.95.17.9849

肌醇磷脂依赖性蛋白激酶对cAMP依赖性蛋白酶的磷酸化和活化

X Cheng（X城）等。美国国家科学院程序. 1998.

.1998年8月18日；95(17):9849-54.

doi:10.1073/pnas.95.17.9849。

作者

X Cheng（X城）¹, Y马, M摩尔, B A海明斯, S S泰勒

附属

¹美国加利福尼亚州拉霍亚加利福尼亚大学圣地亚哥分校化学和生物化学系霍华德·休斯医学研究所92093-0654。

PMID： 9707564
预防性维修识别码： PMC21425型
内政部： 10.1073/第9517.9849页

摘要

虽然在cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）催化亚单位的激活环中磷酸化Thr-197是其正常生物功能的一个必要步骤，但体内负责此反应的激酶仍然难以捉摸。以非磷酸化重组催化亚基为底物，我们发现在293细胞中表达的磷脂依赖性蛋白激酶PDK1磷酸化并激活PKA的催化亚基。PDK1对PKA的磷酸化很快，并且对PKI（一种高度特异的热稳定蛋白激酶抑制剂）不敏感。Thr-197被Asp取代的催化亚单位的突变形式不是PDK1的底物。此外，通过使用识别Thr-197磷酸化酶而非非磷酸化酶或Thr197Asp突变的抗体，可以对催化亚单位的磷酸化进行免疫化学监测。因此，PDK1或其同源物之一可能是体内磷酸化Thr-197的PKA激酶的候选基因。这一发现为我们思考这种普遍存在的蛋白激酶及其在细胞中的调节开辟了一个新的维度。

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数字

图1
用固定化Myc-PDK1磷酸化PKA催化亚基的时间过程。免疫沉淀激酶分析如*材料和方法*通过添加20 mM EDTA停止反应，并通过SDS/PAGE对样品进行分析。这个³²通过放射自显影术观察P标记蛋白。磷酸化通过磷酸成像定量。单位是任意的。

图2
PDK1在不同条件下对PKA催化亚基的磷酸化。热稳定蛋白激酶抑制剂PKI的浓度为0.3μM。根据Western blot分析，Myc-PDK1和Myc-PDK1-KD的用量相等。PDK1和C亚基迁移的位置用箭头表示。

图3
通过使用PDK1抗体耗尽Myc-PDK1，可以阻止Myc-PDK1介导的（H89）-C磷酸化。将转染Myc-PDK1的293细胞的S100部分稀释5倍或20倍，然后按照*材料和方法*.在添加蛋白G珠后，通过离心去除交叉反应蛋白。(一个)放射自显影术显示，无论是否与PDK1抗体预孵育，Myc-PDK1都能磷酸化H89-C。(B类)Western blot显示细胞提取物中残留的Myc-PDK1数量，包括PDK1抗体预培养和未预培养。(C类)免疫印迹显示经抗PDK1预处理后Myc-PDK1的下降量。

图4
在Thr-197通过PDK1使（H89）-C磷酸化。(一个)PDK1对野生型C、H89-C和突变体T197D的磷酸化作用。通过SDS/PAGE和放射自显影术分析磷酸化。(B类)使用磷酸化PKC激活环特异性抗体进行蛋白质印迹分析。(C类)使用抗C亚单位抗体的免疫印迹显示等量的野生型C、（H89）-C和T197D用于一个和B类.

图5
PDK1对（H89）-C的磷酸化作用随时间的变化。H89-C（0.37μg）与表达Myc-PDK1（7.5μl）的293个细胞的总细胞提取物在200μM MgATP存在下在室温下孵育。反应混合物的总体积为60μl。在不同的时间间隔，提取5μl，与5μl 2X SDS样品缓冲液混合，并在100°C下加热2 min以停止反应。PDK1对Thr-197的磷酸化作用是通过使用PKC抗体通过Western blot检测的，PKC抗体也对Thr-1967磷酸化的C亚单位具有特异性。使用未转染的293细胞提取物进行的对照实验显示，（H89）-C的磷酸化可以忽略不计（数据未显示）。磷酸化单元是任意的。

图6
PDK1激活PKA。如图1所示，独立转染Myc-PDK1和Myc-PDK1-KD的293细胞（2.5μl）的S100部分以及未转染293细胞通过Myc抗体和蛋白G-Sepharose进行免疫沉淀。然后将免疫沉淀物与组氨酸标记的（H89）-C（0.125μg）在[γ]存在下混合-³²P] ATP。在室温下培养30分钟后，通过离心去除蛋白G珠，并添加H1（1μG）。将反应混合物在室温下进一步培养10分钟。通过SDS/PAGE解析磷酸化H1，并通过放射自显影术进行可视化。H1的磷酸化通过磷酸成像定量。单位是任意的。

图7
PKA、PKB、PKC和p70激活环区域的序列比对^{6000平方公里}强调了磷酸化对PKA活性很重要的特定Thr残基，并以斜体突出了相同的氨基酸残基。共识站点显示在底部。*对应于疏水残基。

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