The fibronectin domain ED-A is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-beta1

doi:10.1083/jcb.142.3.873

.1998年8月10日；142(3):873-81.

doi:10.1083/jcb.142.3.873。

纤维连接蛋白结构域ED-A对转化生长因子-beta1诱导肌纤维母细胞表型至关重要

G塞里尼¹, M L Bochaton-Piallat先生, P罗普拉斯, 盖诺兹, L博尔西, L Zardi公司, G加比亚尼

附属公司

PMID： 9700173
预防性维修识别码： PMC2148176型
DOI（操作界面）： 10.1083/jcb.142.3.873

纤维连接蛋白结构域ED-A对转化生长因子-beta1诱导肌纤维母细胞表型至关重要

G塞里尼等。 J细胞生物学. 1998.

.1998年8月10日；142(3):873-81.

doi:10.1083/jcb.142.3.873。

作者

G塞里尼¹, M L Bochaton-Piallat先生, P罗普拉斯, 盖诺兹, L博尔西, L扎尔迪, G加比亚尼

附属

¹瑞士日内瓦4号日内瓦大学病理学系，1211。

PMID： 9700173
预防性维修识别码： PMC2148176型
DOI（操作界面）： 10.1083/jcb.142.3.873

摘要

转化生长因子-beta1（TGF-beta1）是肌成纤维细胞分化的主要促进剂，可诱导α-平滑肌（sn）肌动蛋白，调节粘附受体的表达，并促进包括ED-a纤维连接蛋白（FN）在内的细胞外基质（ECM）分子的合成，一种在伤口愈合和纤维变性过程中新表达的同种型。我们在此报告，在体内肉芽组织进化期间和体外TGF-beta1刺激后，ED-A FN沉积先于成纤维细胞表达α-SM肌动蛋白。此外，在不同成纤维细胞群体中，α-SM肌动蛋白和ED-a FN的体外表达存在相关性。在ED-A FN上接种成纤维细胞本身并不诱导α-SM肌动蛋白表达；然而，用抗ED-A单克隆抗体IST-9孵育成纤维细胞可特异性阻断TGF-β1诱导的α-SM肌动蛋白和I型胶原增强，但不阻断纤溶酶原激活物抑制剂-1 mRNA的增强。有趣的是，可溶性重组结构域ED-A也发挥了相同的抑制作用，但这两种抑制剂都不能改变FN基质的组装。我们的研究结果表明，含有ED-A的聚合FN对于TGFβ1诱导肌成纤维细胞表型是必要的，并确定了一种迄今未知的细胞因子决定的基因刺激机制，该机制基于在细胞因子本身的控制下产生ECM衍生的允许的外-内信号传导。

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数字

图1
用激光共聚焦扫描显微镜检测创伤后不同时间肉芽组织中α-SM肌动蛋白和ED-A FN的表达。第4节-(一和b条), 7- (*c（c）*)，和12-d岁(d日)肉芽组织双重染色以检测总肌动蛋白(一,红色)或α-SM肌动蛋白(*b–d段*,红色)和ED-A FN(*a–d*,绿色). (一)成纤维细胞显示出对总肌动蛋白的重要细胞质染色，并且已经存在并与ED-A FN相互作用(*黄色染色*，对应于的覆盖红色和*绿色染色*)肉芽组织间质内损伤后4d出现大量新生。(b条)在第4天，α-SM肌动蛋白仅与小血管的SM-细胞有关，而与成纤维细胞无关。(*c（c）*)7天大的伤口组织显示ED-A FN丰富的细胞外网络中成纤维细胞的局部α-SM肌动蛋白染色(d日)12天大的肉芽组织成纤维细胞显示α-SM肌动蛋白广泛阳性。α-SM肌动蛋白和ED-A FN共定位(*c（c）*和d日；*黄色的*); 在12-(d日)比7年前(*c（c）*)肉芽组织。棒材，50μM。

图2
从不同组织分离的培养大鼠成纤维细胞中ED-A FN和α-SM肌动蛋白的表达。第5代从皮下组织、肺和真皮中获得的大鼠成纤维细胞在无血清条件下培养4 d，然后通过等量总蛋白提取物的Western blot分析评估ED-A FN或α-SM actin的表达。ED-A FN的表达水平与α-SM肌动蛋白的表达水平平行。

图3
TGFβ1对培养的人皮下成纤维细胞中α-SM肌动蛋白和ED-A FN表达调控的时程分析。用10 ng/ml的TGFβ1孵育成纤维细胞，在不同的持续刺激时间后提取总蛋白。SDS-PAGE后的免疫印迹显示，TGFβ1仅在治疗72小时后诱导明显的α-SM肌动蛋白增加，而ED-a FN对TGFβl的反应先于然后平行于α-SM的肌动蛋白升高。轨道上装载了等量的总蛋白。这些数据是五个独立实验的平均值；图中未显示的SEM始终低于值的5%。

图4
ED-A FN抗体阻断TGFβ1对培养的人皮下成纤维细胞中α-SM肌动蛋白的诱导。将细胞接种在简单明胶或含有针对不同FN III型结构域的阻断单克隆抗体的明胶上，然后用TGFβ1（10 ng/ml）刺激3 d；然后在等量的总蛋白上通过Western blotting分析α-SM肌动蛋白。注意，只有当成纤维细胞被含有300μg/ml IST-9的明胶包裹时，TGFβ1才能抑制α-SM肌动蛋白诱导。

图5
IST-9对TGFβ1诱导α-SM肌动蛋白的抑制具有剂量依赖性。将细胞接种在简单明胶或含有不同量（50、150和300μg/ml）IST-9的明胶上，然后用TGFβ1（10 ng/ml）刺激3 d；然后在等量的总蛋白上通过Western blotting分析α-SM肌动蛋白。

图6
TGFβ1诱导细胞FN内ED-A和ED-B结构域的插入。第5代用TGFβ1（10 ng/ml）刺激人皮下成纤维细胞3d；总FN、ED-A FN和ED-B FN通过等量总蛋白的Western blot分析进行评估。与对照细胞相比，TGFβ1治疗可使总FN以及ED-A和ED-B FN亚型增加。

图7
ED-A FN抗体可阻断TGFβ1对培养的人皮下成纤维细胞中α-SM肌动蛋白和I型胶原的诱导，但对PAI-1 mRNA的诱导无效。在图4所示的相同实验条件下，与未经处理的细胞相比，TGFβ1处理24小时的细胞含有更高水平的α-SM肌动蛋白、I型胶原和PAI-1 mRNA；用IST-9单抗治疗显著抑制α-SM肌动蛋白和I型胶原的诱导，但不抑制PAI-1的诱导。

图8
在培养的人皮下成纤维细胞中添加rED-A结构域阻止TGFβ1对α-SM肌动蛋白的诱导。将细胞接种在简单明胶或含有300μg/ml rED-A结构域的明胶上，然后用TGFβ1（10ng/ml）刺激或不刺激3天；然后在等量的总蛋白提取物上通过Western blotting分析α-SM肌动蛋白。用rED-A处理成纤维细胞后，基底α-SM肌动蛋白表达水平略有降低，并抑制TGFβ1诱导的α-SM动蛋白。

图9
对IST-9单抗治疗后TGFβ1刺激的成纤维细胞进行FN基质组装评估。将皮下成纤维细胞置于简单明胶上(一和b条)或含有IST-9 mAb的明胶(*c（c）*)然后用TGFβ1（10 ng/ml）刺激3d(b条和*c（c）*). 然后用抗FN兔多克隆抗体对细胞进行染色。与对照组相比(一)，TGFβ1刺激决定成纤维细胞FN表达和组装的增加(b条). IST-9单克隆抗体治疗(*c（c）*)不干扰TGFβ1的作用。棒材，25μM。

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