Dissociation of cytokine-induced phosphorylation of Bad and activation of PKB/akt: involvement of MEK upstream of Bad phosphorylation

doi:10.1073/pnas.95.13.7439

.1998年6月23日；95(13):7439-44.

doi:10.1073/pnas.95.13.7439。

细胞因子诱导Bad磷酸化的分离和PKB/akt的激活：Bad磷酸化MEK上游的参与

M P Scheid公司¹, V杜罗尼奥

附属公司

PMID： 9636168
预防性维修识别码：项目经理22643
DOI（操作界面）： 10.1073/pnas.95.13.7439

细胞因子诱导Bad磷酸化的分离和PKB/akt的激活：Bad磷酸化MEK上游的参与

M P Scheid公司等。美国国家科学院院刊. 1998.

.1998年6月23日；95(13):7439-44.

doi:10.1073/pnas.95.13.7439。

作者

M P Scheid公司¹, V杜罗尼奥

附属

¹加拿大不列颠哥伦比亚大学医学系，温哥华，BC Canada V6H 3Z6。

PMID： 9636168
预防性维修识别码：项目经理22643
DOI（操作界面）： 10.1073/pnas.95.13.7439

摘要

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路已成为细胞因子介导造血细胞存活的重要组成部分。最近，蛋白激酶PKB/akt（此处称为PKB）被确定为PI3K的下游靶点，PI3K是维持生存所必需的。PKB也与Bad的磷酸化有关，可能将细胞因子的生存效应与Bcl-2家族联系起来。我们已经证明，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在缺乏PI3K活性的情况下维持生存，并且我们现在表明，当PKB激活也被完全阻断时，GM-CSF仍然能够刺激Bad的磷酸化。另一方面，白细胞介素3（IL-3）需要PI3K才能存活，阻断PI3K部分抑制Bad磷酸化。IL-4在细胞因子中的独特之处在于它缺乏激活p21ras-mitogen-activated protein kinase（MAPK）级联的能力，被发现可以激活PKB并促进细胞存活，但它不会刺激Bad磷酸化。最后，尽管我们的数据表明，抑制凋亡并不需要MAPK途径，但我们提供的证据表明Bad的磷酸化可能是通过MAPK/ERK激酶（MEK）依赖的途径发生的。总之，这些结果表明，尽管PI3K在某些情况下可能有助于Bad的磷酸化，但至少有一种其他PI3K非依赖性途径参与其中，可能是通过激活MEK。我们的数据还表明，虽然Bad的磷酸化可能是细胞因子抑制凋亡的一种手段，但对生存效应而言，这可能既不充分也不必要。

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图1
PI3K抑制导致的细胞死亡。将MC/9细胞清洗三次，并重新悬浮在含有所示细胞因子的完整培养基中，或不含细胞因子的培养基中（饥饿）。在时间0时添加LY-294002（25μM；闭合圈）或载体（开放圈），并在指定的时间取出重复等分的细胞，清洗，用膜联蛋白-V-FITC和碘化丙啶染色，并使用流式细胞仪进行分析。我们发现，经历凋亡的细胞很快表现出膜联蛋白-V结合的增加，但排除了碘化丙啶（早期凋亡）。在随后的时间点，碘化丙啶染色细胞的百分比逐渐增加（晚期凋亡）。我们在这里报告了膜联蛋白-V-FITC和碘化丙啶染色的总量，这是细胞凋亡两个阶段的代表性人群。结果代表了至少四个独立实验。

图2
PKB的细胞因子激活和PI3K的需求。(A类)用指示的细胞因子刺激缺乏细胞因子3-5小时的MC/9细胞，刺激浓度为先前显示的浓度，以在指示的时间内诱导最大的酪氨酸磷酸化和PI3K活性。此外，一些细胞用LY-294002（25μM）预处理10分钟，并用细胞因子刺激5分钟。细胞在冰镇溶解缓冲液中造粒并溶解（参见*材料和方法*). PKB被免疫沉淀，其活性在*在体外*以Crosstide为底物进行激酶测定。个别实验已归一化为IL-3 5分钟治疗诱导的刺激百分比，该实验始终同时进行。IL-3、IL-4和GM-CSF的典型最大刺激值是未刺激样本的8到12倍，通常在2000-3000 cpm范围内。(B类)如上所述制备细胞，并用LY-294002（25μM）或单独载体预处理10分钟，然后用GM-CSF刺激指定时间。如上所述进行PKB免疫沉淀和激酶分析。给出的结果来自使用重复样品的三个实验，误差条代表SEM。

图3
IL-3、GM-CSF或SCF治疗会导致不良的迁移率改变，但IL-4不会。(A类)细胞缺乏细胞因子3-5小时，用IL-3刺激指定时间，或不刺激细胞。按照中所述分离并溶解细胞*材料和方法*Bad经免疫沉淀（5μg B36420，Transduction Laboratories）并用SDS/PAGE分离，然后转移到硝化纤维素中并对Bad进行免疫印迹。(B类)免疫沉淀Bad来自用IL-3、IL-4或GM-CSF刺激10分钟并用B36420免疫印迹的细胞。(C类)用抗Bad抗体SC-943（圣克鲁斯生物技术）免疫印迹类似实验的全细胞裂解物。所示结果代表了至少四个独立实验。

图4
IL-4不会刺激坏磷酸化。(A类)细胞缺乏细胞因子3-5小时，然后代谢标记为³²P-标记的正磷酸盐2小时，然后用指示的细胞因子刺激10分钟。如图3所示，Bad被免疫沉淀，并通过SDS/PAGE分离。³²P-标记的Bad通过放射自显影术检测，并通过荧光成像仪或通过切除谱带和液体闪烁计数进行定量。此实验一式两份，显示一组样品。(B类)与相同的实验A类，但测试的是SCF而不是GM-CSF。每条车道下面的数字对应于每组重复的未经处理的平均刺激。

图5
PI3K抑制部分阻断IL-3-，但不阻断GM-CSF诱导的Bad磷酸化。(A类)用LY-294002（25μM）或单独载体预孵育细胞10分钟，然后用IL-3或GM-CSF刺激10分钟。如图3所示，Bad被免疫沉淀，用多克隆抗Bad抗体（SC-943）免疫印迹检查迁移率变化。(B类)用车道上方指示的LY-294002浓度预处理细胞10分钟，用IL-3或GM-CSF刺激细胞10分钟。用B36420（Transduction Laboratories）对Bad进行免疫沉淀和免疫印迹，以确定迁移率变化。这些结果代表了三个独立的实验。

图6
MEK抑制可阻止不良磷酸化，但对存活率无影响。(A类)在指定浓度下用PD98059（PD）预孵育细胞30分钟，然后用IL-3或GM-CSF刺激5分钟。用SDS/PAGE分离洗涤剂溶解的细胞裂解物，并用抗磷酸-MAPK进行免疫印迹。(B类)Bad从相同的细胞裂解物中进行免疫沉淀，并进行免疫印迹以确定迁移率变化。这些结果代表了三个独立的实验。(C类)将MC/9细胞清洗并重新悬浮在IL-3、GM-CSF或单独培养基（Unstim）中，并与50μM PD98059（实心棒）或载体（阴影棒）孵育11小时。利用流式细胞术通过膜联蛋白V结合测定细胞凋亡。显示的结果是重复样本的平均值，是两个独立实验的代表。

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