Bcl-XL interacts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-dependent caspase-9 activation

doi:10.1073/pnas.95.8.4386

.1998年4月14日；95(8):4386-91.

doi:10.1073/pnas.95.8.4386。

Bcl-XL与Apaf-1相互作用并抑制Apaf-1依赖的caspase-9激活

胡彦宏¹, M A本尼迪克特, D Wu先生, N Inohara村, G努涅斯

附属公司

PMID： 9539746
预防性维修识别码： PMC22498型
内政部： 10.1073/pnas.95.8.4386

Bcl-XL与Apaf-1相互作用并抑制Apaf-1依赖的caspase-9激活

胡彦宏等人。美国国家科学院程序. 1998.

.1998年4月14日；95(8):4386-91.

doi:10.1073/pnas.95.8.4386。

作者

胡彦宏¹, 本尼迪克特, D Wu先生, N Inohara村, G努涅斯

附属

¹美国密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院东医学中心路1500号病理与综合癌症中心系，邮编48109。

PMID： 9539746
预防性维修识别码： PMC22498型
内政部： 10.1073/pnas.95.8.4386

摘要

最近的研究表明，秀丽隐杆线虫CED-4与死亡蛋白酶CED-3相互作用并促进其激活，而这种激活被CED-9抑制。在这里，我们表明，CED-4的哺乳动物同源物Apaf-1可以与几种死亡蛋白酶相关，包括哺乳动物细胞中的caspase-4、caspase-8、caspase9和线虫CED-3。与caspase-9的相互作用由Apaf-1的N末端CED-4样结构域介导。Apaf-1的表达增强了需要Apaf-1 CED-4样结构域的caspase-9的杀伤活性。此外，Apaf-1在体内促进了胱天蛋白酶-9的加工和激活。Bcl-XL是Bcl-2家族的抗凋亡成员，在哺乳动物细胞中与Apaf-1和caspase-9发生物理相互作用。Apaf-1与Bcl-XL的关联通过其CED-4样结构域和包含WD-40重复序列的C末端结构域介导。Bcl-XL的表达抑制了哺乳动物细胞中Apaf-1与caspase-9的结合。值得注意的是，从大肠杆菌或昆虫细胞纯化的重组Bcl-XL抑制了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9依赖性的处理。此外，Bcl-XL未能抑制由组成活性Apaf-1突变体介导的caspase-9处理，表明Bcl-XL通过Apaf-1调节caspase-9。这些实验表明，Bcl-XL与caspase-9和Apaf-1相关，并表明Bcl-XL抑制Apaf-1介导的caspase-8成熟，这是一个从线虫进化到人类的保守过程。

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数字

图1
Apaf-1与哺乳动物细胞中具有长前体蛋白的几种半胱氨酸蛋白酶相互作用。(A类)本研究中使用的Apaf-1结构示意图。(*B–D类*)Apaf-1与caspase-4、caspase-9和CED-3的相互作用。293T细胞与标记的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和对照载体或标记的Apaf-1、N末端或C末端Apaf-1结构体（分别为Apaf-1-Myc、N-Apaf-1-Mic和C-Apaf-1-Myc）共转染。(上部)免疫沉淀蛋白复合物与指示抗体的Western blot分析。(下部)caspase-3和-4的表达(B类)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(C)、CED-3和Apaf-1蛋白(D类). 减少了第3车道的预防措施-9C是由于N-Apaf-1介导的蛋白酶-9的高效处理。IP：免疫沉淀，WB：蛋白质印迹分析。星号表示非特定带。

图2
Apaf-1与caspase-8的前体相互作用。(A类)Apaf-1与胱天蛋白酶-8的相互作用。(B类)Apaf-1与胱天蛋白酶-8的前结构域相互作用。免疫沉淀分析如图1所示。(上部)免疫沉淀蛋白复合物与指示抗体的Western blot分析。(A类和B类,下部)显示caspase-8的表达(A类)或Apaf-1(B类)Western blot分析的总裂解物。IP：免疫沉淀，WB：蛋白质印迹分析。星号表示非特定带。

图3
全长和N-末端Apaf-1对胱天蛋白酶-9的调节。(A类)Apaf-1增强caspase-9诱导的细胞凋亡。用报告基因pcDNA3-β-半乳糖苷酶和指示质粒瞬时转染293T细胞。WT，全长Apaf-1-Myc；N、 N-末端Apaf-1-Myc；C、 C-末端Apaf-1-Myc；UT，无标签全长Apaf-1。结果表示显示凋亡形态学特征的蓝色细胞百分比，并以三倍培养物的平均+/-SD表示。(B类)Apaf-1促进caspase-9活化体内用抗caspase-9免疫印迹转染所示质粒的细胞裂解液(上部)或抗PARP抗体(下部). 箭头表示全长和处理过的caspase-9和PARP片段。星号表示非特定带。

图4
Bcl-X公司_L（左）与caspase-9和Apaf-1相互作用。(A类)Bcl-X公司_L（左）与caspase-9相互作用。(上部)免疫沉淀Bcl-X的Western blot分析_L（左）共免疫沉淀原-9和处理型（p35）。(下部)caspase-9在总裂解物中的表达。(B类和C)密件抄送-X_L（左）与Apaf-1相互作用。用指示的质粒转染293T细胞，用抗Flag免疫沉淀的裂解物(B类)或抗Myc(C)抗体。WT，全长Apaf-1-Myc；N、 N-末端Apaf-1-Myc；C、 C端Apaf-1-Myc。面板显示共免疫沉淀Apaf-1和Bcl-X的Western blot分析_L（左）蛋白质。星号表示非特定带。

图5
Bcl-X公司_L（左）抑制Apaf-1与caspase-9的结合。用指示质粒转染293T细胞，用抗HA抗体免疫沉淀裂解物。(上部)免疫沉淀caspase-9和共免疫沉淀Apaf-1的Western blot分析。(下部)用抗Myc和抗Flag抗体对总裂解产物进行Western blot分析。

图6
净化Bcl-X_L（左）抑制Apaf-1依赖的caspase-9成熟*在体外*. (A类)Apaf-1对caspase-9的依赖性加工*在体外*在最后两条通道中，在反应前30分钟加入正常兔血清（对照）或抗Apaf-1血清。(B类)N-末端Apaf-1突变体（残基1-559）独立于细胞色素激活caspase-9c（c）和dATP。分析中使用了转染pcDNA3（对照提取物）或pcDNA3-N-Apaf-1（N-Apaf-1提取物）的293T细胞提取物。(C)重组Bcl-X对caspase-9成熟的调控_L（左）.细胞提取物与指定量的重组Bcl-X孵育_L（左）或者Bad然后是细胞色素*c（c）*将dATP添加到反应中。(赖特)表达N末端Apaf-1突变体（残基1-559）的细胞提取物与指定数量的重组Bcl-X孵育_L（左）.原型和处理过的半胱天冬酶-9用箭头表示。

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