Ezrin/radixin/moesin (ERM) proteins bind to a positively charged amino acid cluster in the juxta-membrane cytoplasmic domain of CD44, CD43, and ICAM-2

doi:10.1083/jcb.140.4.885

。1998年2月23日；140(4):885-95.

doi:10.1083/jcb.140.4.885。

Ezrin/radidin/moesin（ERM）蛋白与CD44、CD43和ICAM-2细胞膜胞质结构域中带正电荷的氨基酸簇结合

S Yonemura村¹, M平尾, Y Doi公司, N高桥, T近藤, S筑田, S筑田

附属机构

PMID： 9472040
预防性维修识别码： PMC2141743型
内政部： 10.1083/jcb.140.4.885

Ezrin/radidin/moesin（ERM）蛋白与CD44、CD43和ICAM-2细胞膜胞质结构域中带正电荷的氨基酸簇结合

S Yonemura村等。 J细胞生物学。 1998。

。1998年2月23日；140(4):885-95.

doi:10.1083/jcb.140.4.885。

作者

S Yonemura村¹, M Hirao先生, Y Doi公司, N高桥, T近藤, S筑田, Tsukita南部

附属

¹京都大学医学院细胞生物学系，日本京都606-01，坂谷。yonemura@mfour.med.kyoto-u.ac.jp

PMID： 9472040
预防性维修识别码： PMC2141743型
内政部： 10.1083/jcb.140.4.885

摘要

CD44已被确定为ezrin/radidin/moesin（ERM）蛋白、质膜/肌动蛋白丝交联剂的膜结合伙伴。然而，ERM蛋白不一定在组织中与CD44共定位，但在某些类型的细胞中与CD43和ICAM-2共定位。我们发现，具有CD43和ICAM-2细胞质域以及CD44的谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白在体外与moesin结合。负责CD43和CD44与moesin体外结合的区域被缩小到胞质域中的膜旁20-30氨基酸序列。这些序列和ICAM-2（28个氨基酸）的细胞质结构域均以带正电荷的氨基酸簇为特征。当E-cadherin嵌合分子携带这些带正电荷的CD44、CD43或ICAM-2氨基酸簇在小鼠L成纤维细胞中表达时，它们与ERM蛋白在微绒毛处共同富集，而那些缺乏这些簇的嵌合分子则分散分布在细胞表面。免疫沉淀和定点突变证实了ERM蛋白与CD44、CD43和ICAM-2的近膜带正电荷氨基酸簇的特异性结合。从这些发现中，我们得出结论，ERM蛋白与在其近膜细胞质域中携带带正电荷氨基酸簇的完整膜蛋白结合。

PubMed免责声明

数字

图1
GST融合蛋白的结构(一)和E-钙粘蛋白嵌合蛋白(b条)CD44、CD43或ICAM-2的完整或截短的细胞质结构域。材料和方法中描述了详细信息。

图8
CD43和CD44的近膜细胞质域和ICAM-2的整个细胞质域的氨基酸序列，负责其ERM结合和ERM共定位（图7）。带正电的氨基酸残基以粗体字母表示。通过体外诱变，将CD44、CD43和ICAM-2中强调的带正电荷的氨基酸簇替换为非带电荷的氨基酸，分别构建E-44/KKK:QIN、E-43/KRR:NGG和E-ICAM-2/RRR:GGA。这些序列数据可从EMBL/GenBank/DDBJ获得，注册号为Y00090（ratCD43细胞)，X66081（鼠标*CD44细胞*)和X6549/S46669（鼠标*ICAM-2公司*).

图7
体外结合研究与转染研究结果的比较。带阴影的方块代表CD44、CD43和ICAM-2细胞质域中的区域，这些区域负责其在体外与moesin的直接结合（图3）。在转染实验中，含有以粗线表示的细胞质区域的E-cadherin嵌合分子与moesin在微绒毛处共同富集，而那些含有以断裂线表示的区域的嵌合分子则分散分布在质膜上。

图3
CD44不同截短胞质结构域中moesin结合能力的比较(一)和CD43(b条). GST融合蛋白（图1一)或GST与moesin在150 mM KCl下孵育。如图2所示，计算每个GST融合蛋白与moesin的相对结合能力。G-44/1-31和G-43的相对结合能力定义为1一和b条分别是。在CD44中，a.a.1-19和a.a.1-31(*粗线条*,底部,一)在40 mM KCl下与moesin结合，与CD44的整个细胞质结构域具有相似的亲和力，而a.a.19-70和a.a.1-70对moesin的亲和力很低(虚线,底部,一)，表明a.a.1-19负责CD44的moesin结合（图2），a.a.19-70抑制CD44的moesin结合。在CD43中，a.a.1-31和a.a.62-124与moesin强烈结合，与CD43的整个细胞质域具有相似的亲和力(*粗线条*,底部,b条)a.a.1-39和a.a.38-124与moesin相关性较弱(细线,底部,b条)a.a.1-64和a.a.78-124对moesin的亲和力很低(虚线,底部,b条). 这些发现表明，至少在体外，a.a.1-31和a.a.62-78似乎都对CD43的moesin结合负责（图2），另一个区域对CD43的moesin结合具有抑制作用。

图2
moesin与CD44、CD43和ICAM-2细胞质结构域的关联。商品及服务税(*消费税*)或GST融合蛋白与E-cadherin的整个细胞质域(*G-E-cad*)，闭塞素(*G-Oc公司*)，CD43(*G-43国*)，CD44(*G-44年*)，或ICAM-2(*G-ICAM-2公司*)与谷胱甘肽Sepharose珠结合，并在生理学条件下与纯化的重组moesin孵育(*150 mM氯化钾*)或离子强度低(*40毫摩尔KCl*). 洗涤后，用含谷胱甘肽的缓冲液将GST或GST融合蛋白及其结合蛋白从珠中洗脱出来。谷胱甘肽洗脱液中的蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后进行考马斯亮蓝染色，以密度计估计每个洗脱液中GST或GST融合蛋白的量(*GST融合*)或随后用抗肌球蛋白单克隆抗体M22进行免疫印迹，以密度测定法估计与GST或GST融合蛋白结合的moesin的量(*绑定Moesin*). GST融合蛋白与moesin的相对结合能力(*Moesin的相对结合*)通过比较每个含有恒定量未降解GST融合蛋白的洗脱液与G-43中结合moesin的量来计算(*150 mM氯化钾*)洗脱，仔细注意降解产物对结合数据的影响。数值表示三个实验±SEM的平均相对结合能力。

图4
E-cadherin嵌合分子与CD44的完整和截短细胞质域的免疫荧光定位（图1b条). 瞬时表达E-44的L细胞(一和b条)，E-44/1–19(*c（c）*和d日)或E-44/20–70(*e（电子）*和*（f）*)用抗E-钙粘蛋白抗体双重染色(一,*c（c）*、和*e（电子）*)和抗食管炎抗体(b条,d日、和*（f）*). E-44和E-44/1-19在微绒毛处与moesin精确共浓缩(箭头)而E-44/20-70广泛分布于细胞表面，表明ERM共定位信号位于CD44细胞质结构域a.a.1-19。棒材，20μm。

图5
CD43胞质结构域截断E-cadherin嵌合分子的免疫荧光定位(一和b条;*电子43*/*1–31*)或ICAM-2的整个细胞质域(*c（c）*和d日;*电子ICAM-2*)（图1b条). 用抗E-钙粘蛋白抗体对瞬时表达每个蛋白的L细胞进行双重染色(一和*c（c）*)和抗肌球蛋白抗体(b条和d日). 这两种嵌合蛋白在微绒毛处与moesin精确共浓缩(箭头). 棒材，20μm。

图6
ERM蛋白与E-cadherin嵌合蛋白与CD43全细胞质域共免疫沉淀(*电子43*). 表达E-43或E-43/1-9、49-124的培养L细胞转染体用含有0.1%Nonide P-40的裂解缓冲液溶解，然后用抗E-cadherin单克隆抗体免疫沉淀。免疫沉淀用SDS-PAGE分离，然后用抗ERM蛋白pAb（TK89；*反ERM*)或抗E-钙粘蛋白单克隆抗体(*反E-cad*). TK89认可的ezrin(E类)/根素(对)还有莫西因(*M（M）*). ERM蛋白与E-43共免疫沉淀，但与E-43/1-9,49-124共免疫沉淀。

图9
CD44、CD43和ICAM-2细胞质结构域的定点突变体的Moesin结合能力。具有CD43全细胞质域的GST融合蛋白(*G-43国*)以及CD43、CD44和ICAM-2的定点突变体(*G-43国*/*KRR:纳克*,*G-44年*/*KKK:秦*、和*G-ICAM-2型*/*RRR:GGA公司*; 图8）与moesin在150 mM KCl（用于*G-43国*/*KRR:NGG公司*和*G-ICAM-2公司*/*RRR:GGA公司*)或40 mM KCl（对于*G-44年*/*KKK:秦*). 如图2所示，计算每个GST融合蛋白与moesin的相对结合能力。G-43的相对结合能力定义为1。与G-43相比，定点突变体似乎失去了它们的moesin结合能力。

**图10**
具有CD44、CD43和ICAM-2全细胞质结构域的E-cadherin嵌合分子定点突变体的免疫荧光定位。CD44、CD43和ICAM-2相邻膜区的KKK、KRR和RRR分别被非带电氨基酸取代(*电子44*/*KKK:秦*,*电子43*/*KRR:NGG公司*、和*电子细胞粘附分子-2*/*RRR:GGA公司*)（图8）。用抗E-钙粘蛋白抗体对瞬时表达这些突变体的L细胞进行双重染色(一,*c（c）*、和*e（电子）*)和抗肌球蛋白抗体(b条,d日、和*（f）*). 这些突变体广泛分布于细胞表面，从未集中于微绒毛。棒材，20μm。

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