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.1998年1月15日；12(2):149-62.
doi:10.1101/gad.12.2.149。

低氧诱导因子1α对氧稳态的细胞和发育控制

N V Iyer公司 1, L E科奇, F阿加尼, S W梁, E笑声, R H温格, M加斯曼, J D Gearhart公司, A M劳勒, 阿Y Yu, G L塞门扎
附属公司

低氧诱导因子1α对氧稳态的细胞和发育控制

N V Iyer公司等。 基因开发. .

摘要

缺氧是一种重要的发育和生理刺激，在癌症、心脏病发作、中风和其他主要死亡原因的病理生理学中起着关键作用。缺氧诱导因子1（HIF-1）是唯一已知的哺乳动物转录因子，对生理相关水平的缺氧有独特的反应。我们现在报告，在不表达O2-调节的HIF-1α亚单位的Hif1a-/-胚胎干细胞中，编码葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的mRNA水平降低，细胞增殖受损。缺氧Hif1a-/-胚胎干细胞和囊性类胚体中的血管内皮生长因子mRNA表达也显著降低。HIF-1α的完全缺乏导致了Hif1a-/-胚胎的发育停滞和E11致死，表现为神经管缺陷、心血管畸形和头部间质内的显著细胞死亡。在Hif1a+/+胚胎中，HIF-1α的表达在E8.5和E9.5之间增加，与Hif1a-/-胚胎中发育缺陷和细胞死亡的发生一致。这些结果表明，HIF-1α是细胞和发育氧稳态的主调节器。

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图1
图1
有针对性地中断Hif1a型ES细胞中同源重组的基因。(A类)野生型HIF-1α蛋白的结构Hif1a型位点、靶向载体和靶向Hif1a型轨迹。蛋白质中重要的功能域是bHLH和PAS域，它们是二聚体和DNA结合所必需的，以及反式激活域（TAD）。同源重组（大交叉）导致外显子2被相反转录方向的新霉素耐药基因取代（箭头）。目标克隆对G418和更昔洛韦具有耐药性，因为存在新粘菌素耐药基因，而没有胸苷激酶基因。(B类)ES细胞克隆的DNA印迹杂交分析。野生型和靶向基因座通过14kb和12kb的存在来识别生态图中所示的3′探针分别检测到的RV限制性片段答：。(C类)Hep3B和ES细胞的HIF-1免疫印迹分析。从非低氧（N）（20%O）培养的细胞中制备核提取物2)或缺氧（H）（1%O2)条件4小时。使用HIF-1α特异性亲和纯化抗体进行免疫印迹分析(顶部)或HIF-1β(底部). (D类)HIF-1表达的免疫印迹分析Hif1a型+/+,Hif1a型+/-、和Hif1a型−/−ES细胞。从在非缺氧（N）或缺氧（H）条件下培养4小时的细胞中制备细胞核提取物。使用HIF-1α特异性抗体进行免疫印迹分析(顶部)，HIF-1β(中间的)或对照（C）蛋白拓扑异构酶I(底部). (E类)HIF-1 DNA结合活性的电泳迁移率测定。ES和Hep3B细胞的核提取物与含有18bp的双链寡核苷酸探针孵育欧洲专利局基因序列。HIF-1与组成表达因子（C）的结合被指示。
图1
图1
有针对性地中断Hif1a型ES细胞中同源重组的基因。(A类)野生型HIF-1α蛋白的结构Hif1a型位点、靶向载体和靶向Hif1a型轨迹。蛋白质中重要的功能域是bHLH和PAS域，它们是二聚体和DNA结合所必需的，以及反式激活域（TAD）。同源重组（大交叉）导致外显子2被相反转录方向的新霉素耐药基因取代（箭头）。目标克隆对G418和更昔洛韦具有耐药性，因为存在新粘菌素耐药基因，而没有胸苷激酶基因。(B类)ES细胞克隆的DNA印迹杂交分析。野生型和靶向基因座通过14kb和12kb的存在来识别生态图中所示的3′探针分别检测到的RV限制性片段答：。(C类)Hep3B和ES细胞的HIF-1免疫印迹分析。从非低氧（N）（20%O）培养的细胞中制备核提取物2)或缺氧（H）（1%O2)条件4小时。使用HIF-1α特异性亲和纯化抗体进行免疫印迹分析(顶部)或HIF-1β(底部). (D类)HIF-1表达的免疫印迹分析Hif1a型+/+,Hif1a型+/-、和Hif1a型−/−ES细胞。从在非缺氧（N）或缺氧（H）条件下培养4小时的细胞中制备细胞核提取物。使用HIF-1α特异性抗体进行免疫印迹分析(顶部)，HIF-1β(中间的)或对照（C）蛋白拓扑异构酶I(底部). (E类)HIF-1 DNA结合活性的电泳迁移率测定。ES和Hep3B细胞的核提取物与含有18bp的双链寡核苷酸探针孵育欧洲专利局基因序列。HIF-1与组成表达因子（C）的结合被指示。
图2
图2
葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶编码基因的表达。糖酵解途径如所示左侧。编码各自酶的基因符号根据非缺氧（N）或缺氧（H）条件下培养16小时（车道）的ES细胞中的mRNA表达模式（标准化为18S rRNA）用字体编码1–6在正确的)如下：（1）（bold）缺氧时表达增加Hif1a型+/+细胞，诱导缺失Hif1a型+/−细胞，基础和诱导表达的丢失Hif1a型−/−细胞；（2） （粗体和斜体）缺氧对Hif1a型+/+但缺氧时表达降低Hif1a型+/−和Hif1a型−/−细胞；（3） （斜体）缺氧对Hif1a型+/+但缺氧和非缺氧时表达降低Hif1a型−/−细胞；（4） 低氧或HIF-1α缺乏对表达无影响。还检测了Hep3B细胞中mRNA的表达（lanes7,8). 所示基因编码以下蛋白质：(GLUT1公司和GLUT3公司)葡萄糖转运蛋白1和3；(香港1和香港2号)己糖激酶1和2；（GPI）葡萄糖磷酸异构酶；(PFKL公司)磷酸果糖激酶L；(阿尔达和ALDC公司)醛缩酶A和C；(TPI公司)三磷酸异构酶；(GAPDH公司)甘油醛-3-磷酸脱氢酶；(PGK1系列)磷酸甘油酸激酶1；（PGM）磷酸葡萄糖变位酶；(ENO1公司)烯醇化酶1；(PKM公司)丙酮酸激酶M；(LDHA公司)乳酸脱氢酶A.葡萄糖（EXT）和葡萄糖（INT）分别指细胞外和细胞内葡萄糖。
图3
图3
VEGF mRNA在ES细胞和囊性类胚体中的表达。(A类)ES细胞。Hif1a型+/+和Hif1a型−/−细胞在20%O的完全培养基中孵育2（N） ，1%O下的全培养基2（H） 或葡萄糖缺乏培养基（20%O）2（−G）16小时。分离总RNA并通过杂交分析32P标记的VEGF cDNA(顶部)和18S rRNA寡核苷酸(底部)探针。(B类)类胚体。ES细胞在甲基纤维素中培养4天以诱导分化，然后暴露于20%（N）或0%（H）O2如上文所述，在RNA分离和杂交前16小时。
图4
图4
ES细胞在非缺氧和缺氧培养条件下的生长。Hif1a型+/+（+）或Hif1a型−/−（−）电池（6×105)每个10厘米的盘子都有镀层。24小时后，取出每个基因型的一个平板进行细胞计数（0小时）。其余培养板在非缺氧（N；20%O）条件下培养2)或缺氧（H；1%O2)条件。24小时后更换培养基，对于每种情况，在24或48小时后取下三个平板进行细胞计数，并将其归一化为0小时细胞计数。从每个平板中计算四个场，并进行三次实验。平均值(n个 = 36）和标准差。计算了每个实验条件下的（bar），以及Hif1a型−/−与Hif1a型+/+单元格显示：（*）P（P） < 0.05; (**)P（P） < 0.01（学生的t吨-测试）。
图5
图5
异常发展Hif1a型−/−胚胎。(A类)可行性比较Hif1a型−/−和Hif1a型+/+胚胎在E10.0。(B类)E9.75患者的神经皱襞脱垂（NF）、后脑囊性增大（HB）和心包积液Hif1a型−/−胚胎。（H） 心脏；（PS）心包囊。(C类)E9.75患者头部囊性外观和心包积液Hif1a型−/−胚胎。
图6
图6
组织学分析。通过颅骨区域的切片与分期相匹配Hif1a型+/+(A类)和E9.75–E10.0Hif1a型−/−(C、 E类)图中显示了胚胎。正常的血管（箭头A类)可以与包含在大脑间质中的异常血管结构（箭头C类和E类)第页，共页Hif1a型−/−胚胎，也表现出脱垂的神经褶皱（NF）和相对于Hif1a型+/+胚胎。分期匹配的心脏区域截面Hif1a型+/+(B类)和E9.75–E10.0Hif1a型−/−(D、 如果)图中显示了胚胎。假定心肌增生（M）和异常组织（箭头所示F类)在扩大的心包腔内（PC）和沿心包（P）可见。（AV）房室管；（BA1）第一鳃弓；（NT）神经管；耳泡；（OT）心室流出道。
图7
图7
超重力染色。天青石Hif1a型+/+(左边)和Hif1a型−/−(正确的)胚胎用尼罗兰硫酸盐处理。点状染色提示细胞死亡，在左神经皱褶的前脑和中脑区域的间充质室明显可见Hif1a型−/−胚胎，并且在Hif1a型+/+胚胎。心脏腔内染料的非特异性捕获也可用于心脏形态发生的分析。胚胎上方的箭头间距相同，以显示心室和流出道之间的收缩Hif1a型−/−胚胎。这个Hif1a型−/−心脏没有被染色，表明没有通畅的管腔。
图8
图8
PECAM免疫组织化学。E8.5–E8.75的比较Hif1a型+/+(A类)和Hif1a型−/−(B类)胚胎在血管形成方面没有明显差异。相反，E9.25的血管化Hif1a型−/−胚胎(D类)与同期相比明显异常Hif1a型+/+胚胎(C类). 颅骨区域存在异常的内皮内衬血管结构（如箭头所示D类)无鳃弓血管形成，心管管腔不明显，背主动脉（DA）直径不规则。（BA1）第一鳃弓；（V） 心室。
图9
图9
HIF-1在人组织中表达的免疫印迹分析Hif1a型+/+和Hif1a型−/−胚胎。非低氧（N）和低氧（H）核提取物等分（15μg）Hif1a型+/+ES电池（车道1,2)和由Hif1a型+/+（WT；车道3–8)和Hif1a型−/−（M；车道9)使用HIF-1α特异性抗体分析指定胎龄的胚胎(顶部)，HIF-1β(中间的)或作为对照（C），拓扑异构酶I(底部).
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