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.1997年8月;10(8):915-25。
doi:10.1093/蛋白质/10.8.915。

大肠杆菌中cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基的自磷酸化

附属公司

大肠杆菌中cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基的自磷酸化

W Yonemoto公司等。 蛋白质工程. 1997年8月.

摘要

当cAMP依赖性蛋白激酶(cAPK)的催化(rC)亚单位在大肠杆菌中表达时,它在四个位点(Ser10、Ser139、Ser338和Thr197(49))被自动磷酸化。其中三个位点,Ser10、Ser338和Thr197,也存在于哺乳动物的酶中。为了理解这些磷酸化位点的功能重要性,每个位点都被丙氨酸、谷氨酸或天冬氨酸取代。在体内用32Pi标记后,用免疫沉淀法对每个突变蛋白的表达、溶解度和磷酸化状态进行表征。在可能的情况下,分解亚型并测量动力学特性。哺乳动物酶中的两个稳定的磷酸化位点Ser338和Thr197显示出了不同的作用。Ser338稳定了C末端附近的转弯,对稳定性很重要。rC(S338A)和rC(S138E)都非常不稳定;然而,rC(S338E)的动力学性质与野生型催化亚基(C-亚基)相似。Ser338很可能有助于将C末端锚定在小叶表面。Thr197位于裂缝界面附近的激活环中。T197的突变导致催化活性的显著损失,肽和MgATP的Kms增加,k(cat)略有下降,表明这种磷酸盐对活性位点催化残基的正确定向很重要。将位于E螺旋起始处的Ser139替换为Ala对其余位点的动力学参数、稳定性或磷酸化没有影响。相反,位于A螺旋起始处的Ser10突变产生了大部分不溶性、无活性、无磷酸化的蛋白质,这表明该区域虽然远离活性位点,但至少在大肠杆菌中对可溶性磷酸蛋白的表达具有结构重要性。由于活性位点残基的突变以及缺失突变体产生磷酸化不足的蛋白质,因此大肠杆菌中的这些磷酸化都是由自身磷酸化引起的。

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