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.1997年12月29日；139(7):1687-95.
doi:10.1083/jcb.139.7.1687。

从细胞质到液泡/溶酶体靶向蛋白质的两条不同途径

M Baba先生 1, M Osumi先生, S V斯科特, D J克林斯基, Y Ohsumi先生
附属机构

从细胞质到液泡/溶酶体靶向蛋白质的两条不同途径

M Baba先生等。 J细胞生物学. .

摘要

应激条件导致细胞水平上的各种生理反应。自噬是动物、植物和真菌细胞使用的一个基本过程，允许在营养限制条件下回收大分子成分，并重塑细胞分化的细胞内结构。为了阐明自噬蛋白向液泡/溶酶体转运的分子基础，我们对酵母中的这一途径进行了形态学和生物化学分析。利用液泡水解酶氨肽酶I（API）作为标记物，我们提供证据表明自噬途径与生物合成途径重叠，即用于API导入的细胞质到液泡靶向（Cvt）。在靶向之前，API的前体形式主要定位在胞浆的限制区域，与球形颗粒形成复合物（称为Cvt复合物）。在营养生长期间，Cvt复合体被膜囊选择性包裹，形成直径约150 nm的双膜结合结构，然后与液泡膜融合。这一过程在拓扑上与酵母在饥饿条件下诱导的大自噬相同（Baba，M.，K.Takeshige，N.Baba和Y.Ohsumi，1994）。《细胞生物学杂志》。124:903-913）。然而，与自噬相反，原料药的进口是在不断增长的条件下进行的。这是首次证明利用自噬样机制生物合成传递液泡水解酶。另一个重要发现是，当细胞处于饥饿状态时，Cvt复合体现在被一个更大的自噬体占据，该自噬体内含有其他细胞溶质成分；根据环境条件，细胞使用另一种途径隔离Cvt复合物，并选择性地将API传递到液泡。这些结果共同表明，两个相关但不同的自噬样过程涉及液泡驻留蛋白的生物生成和待降解底物的隔离。

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数字

图1
图1
细胞质中原API的形态学研究。细胞在30°C的YEPD培养基中生长到对数相，并按照材料和方法中的描述准备电子显微镜。如有指示，使用成熟蛋白抗体对API进行免疫染色，该成熟蛋白检测水解酶的成熟形式和前体形式。(A类)SEY6210（野生型）细胞液泡中API的免疫染色显示分散模式。(B–D类)TVY1免疫染色(第四人民党)显示Cvt复合体中API的单元格。箭头指向Cvt复合体。放大倍数较高的图像如所示C类和D。(E类)TVY1细胞中Cvt复合物的冷冻替代固定图像。(如果)用SD培养基中生长的编码API的2μ质粒转化SEY6210菌株中Cvt复合物的冷冻替代固定图像。(G公司)含有2μAPE1接口质粒在SD培养基中生长。N个，细胞核；V（V），液泡。
图2
图2
TVY1中Cvt复合物的膜结合形式(第四人民党)细胞。细胞在30°C的YEPD培养基中生长至对数相，并按图1所示准备电子显微镜。(A类和B类)免疫染色图像显示Cvt小泡（标记为箭头在里面A类)在细胞溶质中。箭头和双箭头分别显示Cvt囊泡的内膜和外膜。(C类)Cvt囊泡的冷冻替代固定图像（标记为箭头). (D类)Cvt囊泡免疫染色（标记为箭头)在胞质溶胶和Cvt体内（标记为双箭头)在液泡中。(E类和如果)液泡中Cvt小体的冷冻替代固定图像（标记为箭头). Cvt囊泡用箭头标记。(G公司和H（H）)Cvt囊泡接触并融合到液泡的冷冻替代固定图像。V（V），真空；虚拟机，液泡膜。
图7
图7
API向液泡转运途径的方案。如文中所述，proAPI在胞浆中形成复合物。根据营养条件，该Cvt复合物通过两条途径靶向液泡。在生长条件下，Cvt复合物周围形成约140至160 nm的双层膜囊泡，并排除胞浆。相反，当细胞缺乏氮时，Cvt复合物与细胞溶质成分一起进入较大的自噬体（300-900 nm）。空泡输送是通过Cvt囊泡或自噬体的外膜和空泡膜融合来实现的。最后，产生的Cvt小体或自噬小体被液泡水解酶分解，释放proAPI进入液泡腔。蛋白质的前体形式随后被加工成成熟水解酶。
图4
图4
生长和氮饥饿条件下Cvt复合物在SEY6210（野生型）中的转运，其中含有编码API的2μ质粒。观察SD培养基中生长的营养细胞(A–E). 为了饥饿，将SD中对数生长的细胞转移到SD（-N）中25分钟(F–H（飞行高度）)或1小时(I–K型)存在1 mM PMSF。如图1所示，为电子显微镜制备样品。(A类)Cvt囊泡的冷冻替代固定图像（标记有箭头). (B类)Cvt囊泡的免疫染色（标记为箭头). (C类和D类)Cvt囊泡的高倍图像。箭头和双箭头分别显示Cvt囊泡的内膜和外膜。(E类)膜囊包裹大Cvt复合体小部分的冷冻替代固定图像（标记为箭头). (如果)隔离膜包裹Cvt复合物的冷冻替代图像（标记有箭头). (G公司)Cvt囊泡的冷冻替代图像（用箭头)融合成液泡。(H（H）)含有Cvt复合物的自噬体的冷冻替代图像。(我)描述Cvt复合物包裹的免疫染色图像。箭头标记包裹膜。(J型)含有Cvt复合物的自噬体的免疫染色。(K（K）)对液泡中含有Cvt复合物的自噬体进行免疫染色。V（V），液泡。
图3
图3
TVY1中的Cvt复合物(第四人民党)氮饥饿条件下的细胞。将YEPD中对数生长的细胞转移到30°C的缺氮培养基（SD[-N]）中30分钟(A类和B类)或60分钟(C类和D类)并按图1所示准备电子显微镜。(A类)冷冻替代固定图像显示自噬体中的Cvt复合物（标记为箭头)在细胞溶质中。(B类)冷冻替代固定图像显示液泡中自噬体中的Cvt复合物。(C类)空泡自噬体中Cvt复合物的免疫染色。(D类)Cvt囊泡的免疫染色（标记为箭头)液泡中。AB公司，自噬体；AP公司，自噬体；V（V），液泡。
图5
图5
突变分析可以区分Cvt小泡的空泡输送和自噬体。(A类)SEY6210（野生型），cvt3型、和cvt7型酵母在SD中培养至1 OD600U/ml并转移至SD（-N）。在0 h（+）和4 h（−）培养后收集等分样品，并进行免疫印迹。前体的位置(赞成的意见)和成熟(米)显示API。(B类)cvt3型和cvt7型对细胞进行脉冲标记10分钟。在添加冷半胱氨酸和蛋氨酸后，收集、清洗细胞，并将其重新悬浮在SD或SD（-N）中，并追踪指定的时间。API通过免疫沉淀回收，在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行解析，并使用磷光成像仪（STORM；Molecular Dynamics，加利福尼亚州森尼维尔）进行定量。
图5
图5
突变分析可以区分Cvt小泡的空泡输送和自噬体。(A类)SEY6210（野生型），cvt3型、和cvt7型酵母在SD中培养至1 OD600U/ml并转移至SD（-N）。在0 h（+）和4 h（−）培养后收集等分样品，并进行免疫印迹。前体的位置(赞成的意见)并且成熟(米)显示API。(B类)cvt3型和cvt7型对细胞进行脉冲标记10分钟。在添加冷半胱氨酸和蛋氨酸后，收集、清洗细胞，并将其重新悬浮在SD或SD（-N）中，并追踪指定的时间。通过免疫沉淀回收API，在SDS聚丙烯酰胺凝胶上解析，并使用荧光成像仪（STORM；分子动力学，加利福尼亚州森尼维尔）进行定量。
图6
图6
中的Cvt复合体分析cvt3型营养和饥饿条件下的突变。营养细胞在30°C至对数期的SD培养基中生长。为了饥饿，将SD培养基中对数生长的细胞转移到SD（-N）中5 h。如图1所示，制备用于电子显微镜的样品。(A类)细胞溶质中Cvt复合物的免疫染色图像。在该菌株中未检测到Cvt小泡。(B类)冷冻替代固定图像显示自噬体中的Cvt复合物（标记为箭头)在饥饿条件下，表明自噬仍然可以进行。AP公司，自噬体；N个，细胞核；V（V），液泡。
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