Direct visualization of the translocation of the gamma-subspecies of protein kinase C in living cells using fusion proteins with green fluorescent protein

doi:10.1083/jcb.139.6.1465

。1997年12月15日；139(6):1465-76.

doi:10.1083/jcb.139.6.1465。

使用绿色荧光蛋白融合蛋白直接显示活细胞中蛋白激酶Cγ亚种的易位

N酒井¹, K佐佐木, N Ikegaki, Y Shirai先生, Y小野, N斋藤

附属公司

PMID： 9396752
预防性维修识别码： PMC2132627型
内政部： 10.1083/jcb.139.6.1465

使用绿色荧光蛋白融合蛋白直接显示活细胞中蛋白激酶Cγ亚种的易位

N酒井等。 J细胞生物学。 1997。

。1997年12月15日；139(6):1465-76.

doi:10.1083/jcb.139.6.1465。

作者

N酒井¹, K佐佐木, N Ikegaki先生, Y Shirai先生, Y小野, N斋藤

附属

¹日本神户657神户大学理学院生物信号研究中心分子药理学实验室。

PMID： 9396752
预防性维修识别码： PMC2132627型
内政部： 10.1083/jcb.139.6.1465

摘要

我们在不同的细胞系中表达融合了绿色荧光蛋白（GFP）的蛋白激酶C（gamma-PKC）的γ亚种，并在共焦激光扫描荧光显微镜下观察了该融合蛋白在活细胞中的运动。γ-PKC-GFP融合蛋白的酶学性质与天然γ-PKC非常相似。在瞬时转染COS-7细胞的细胞质中观察到γ-PKC-GFP的荧光。活性佛波酯（12-O-十四烷酰基佛波醇13-乙酸酯[TPA]）刺激而非非活性佛波酸酯（4alpha-phorbol 12，13-didecanate）刺激可诱导γ-PKC-GFP从细胞质到质膜的显著移位。A23187是一种Ca2+离子载体，与TPA相比，它诱导了更快的γ-PKC-GFP易位。通过消除细胞外和细胞内Ca2+，A23187诱导的移位被消除。TPA诱导的γ-PKC-GFP易位是单向的，而Ca2+离子载体诱导的易位是可逆的；也就是说，γ-PKC-GFP转位到细胞膜，然后返回细胞液，最后在质膜上堆积成斑点状。为了研究γ-PKC的C1和C2结构域在易位中的意义，我们表达了突变的γ-PKC-GFP融合蛋白，其中C1区的两个富含半胱氨酸的区域被破坏（命名为BS 238）或C2区被删除（BS 239）。BS238突变体通过Ca2+离子载体而非TPA易位。相反，BS239突变体通过TPA而不是Ca2+离子载体进行移位。为了检测生理条件下γ-PKC-GFP的移位，我们在NG-108细胞、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体转染的COS-7细胞或表达代谢型谷氨酸受体1（CHO/mGluR1细胞）的CHO细胞中表达它。在NG-108细胞中，K+去极化诱导γ-PKC-GFP快速移位。在NMDA受体转染的COS-7细胞中，NMDA加甘氨酸的应用也使γ-PKC-GFP易位。此外，在受受体刺激的CHO/mGluR1细胞中观察到gamma-PKC-GFP的快速移位和顺序重定位。细胞松弛素D和秋水仙碱均不影响γ-PKC-GFP的易位，表明γ-PKC易位独立于肌动蛋白和微管。γ-PKC-GFP融合蛋白是研究γ-PKC易位的分子机制以及γ-PKC在中枢神经系统中的作用的有用工具。

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数字

图1
γ-PKC-GFP融合蛋白及其突变体的构建。BS186是一种γ-PKC-GFP融合蛋白，其中γ-PKC（BS55）和GFP在γ-PKC-COOH末端结合。在γ-PKC的C1区，有两个富含半胱氨酸的序列与DG或佛波酯（例如TPA）相互作用。为了产生BS 238（C1突变），通过定点突变将两个富含半胱氨酸区域中的每个半胱氨酸残基替换为丝氨酸。BS 238的C1区域不再表现出结合佛波酯的活性（Ono等人，1989年）。γ-PKC的C2区，Ca²⁺如文中所述，为了生产BS 239（C2删除），删除了绑定域。

图2
γ-PKC和γ-PKC-GFP在COS-7细胞中瞬时表达的酶学性质。(A类)抗γ-PKC抗体的免疫印迹分析表明，表达的γ-PKC（BS 55）和γ-PKC-GFP（BS 186）分别是分子量为80和110kD的蛋白质。用5μM TPA处理90分钟，增加了与微粒分数相关的γ-PKC和γ-PKC-GFP的数量。第页，颗粒（颗粒分数）；秒，上清液（胞浆部分）。(B类)胞浆和颗粒组分中表达的γ-PKC和γ-PKC-GFP的激酶活性。用5μM TPA处理90分钟后，γ-PKC和γ-PKC-GFP的激酶活性从胞浆转移到颗粒组分。*幻灯片演示文件*，颗粒（颗粒部分）啜饮，上清液（胞浆部分）。(C类)抗γPKC抗体免疫沉淀的γ-PKC和γ-PKC-GFP的酶学性质。在存在或不存在γ-PKC活化剂的情况下，测定由抗γ-PKCC抗体免疫沉淀的表达的γ-PKC-和γ-PKC-GFP的激酶活性。在PS、DO和Ca的存在下，γ-PKC-GFP的激酶活性最大²⁺γ-PKC也是如此。γ-PKC和γ-PKC-GFP的酶学性质非常相似。

图3
福尔波酯诱导COS-7细胞中γ-PKC-GFP移位。(A类)室温下用5μM TPA改变COS-7细胞中表达的γ-PKC-GFP的荧光。在转染的COS-7细胞中，在整个细胞质中观察到γ-PKC–GFP融合蛋白。5μM TPA激活PKC后，γ-PKC-GFP荧光从胞浆向细胞膜明显移位。TPA治疗后60分钟内几乎完成移位。刺激前在Nomarski干涉显微镜下拍摄了相同的照片，并显示在左上角。(B类)37℃下200 nM TPA和500 nM 4α-PDD对COS-7细胞中表达的γ-PKC-GFP荧光的影响。在37°C下检测时，较低浓度的TPA（200 nM）诱导γ-PKC–GFP从细胞质转移到膜(*上部记录道*). TPA治疗后10分钟，易位发生更快，观察到完全易位。相反，在500 nM时，4α-PDD（一种非活性佛波酯）即使在37°C时也无法诱导γ-PKC-GFP的易位。棒材，10μm。

图4
钙²⁺离子载体诱导COS-7细胞中γ-PKC-GFP易位。(A类)80μM A23187、Ca对COS-7细胞表达的γ-PKC-GFP荧光的影响²⁺电离层。A23187还将γ-PKC-GFP的荧光从胞浆转移到膜；然而，易位的时间进程与TPA诱导的时间进程有显著差异。钙²⁺离子载体诱导的易位快速且可逆(*上部和中部记录道*). 在较低的迹线中，显示了穿过细胞的同一条线上的GFP强度剖面。（测量线位于左上角的箭头之间。）易位表示为30秒和45分钟时细胞边缘荧光的增加。比较GFP强度的分布，在0和5分钟时获得了非常相似的分布，荧光的衰减可以忽略不计。(B类)A23187的γ-PKC-GFP易位并不总是可逆的。左细胞显示单向易位，而右细胞显示可逆易位，如A类单向易位比可逆易位更常见。γ-PKC-GFP最终在质膜和邻近细胞质中以斑片状小点的形式积聚。棒材，10μm。

图5
Thapsigargin诱导γ-PKC-GFP易位。5μM thapsigargin，内质网钙的抑制剂²⁺-ATP酶还诱导γ-PKC-GFP的快速移位。γ-PKC-GFP的荧光像A23187诱导的易位一样，以斑点状聚集。棒材，10μm。

图6
钙的作用²⁺螯合剂对A23187诱导的γ-PKC-GFP易位的影响。2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM预处理完全阻断A23187（50μM）诱导的γ-PKC-GFP易位(*上部记录道*). 使用2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM将γ-PKC–GFP从细胞膜重新定位到细胞液中，即使在A23187诱导的易位发生后(*下部记录道*). 棒材，10μm。

图7
γ-PKC-GFP荧光与γ-PKC-样免疫反应性的比较。用抗γ-PKC抗体对γ-PKC-GFP转染的COS-7细胞进行免疫染色，结果表明，即使在TPA-或A23187诱导的移位完成后，GFP荧光和γ-PKC-样免疫反应也有非常相似的定位。棒材，10μm。

图8
COS-7细胞中表达的突变γ-PKC-GFPs（BS 238和BS 239）的易位。(A类)BS 238（C1突变γ-PKC–GFP）的易位。5μM的TPA没有诱导BS238的易位，而50μM的A23187则诱导了BS238易位。与BS186（对照γ-PKC-GFP）相比，A23187诱导的BS238易位不足。(B类)BS 239的易位（C2缺失γ-PKC–GFP）。与BS 238相比，BS 239被5μM TPA转运，但没有被50μM A23187转运。棒材，10μm。

图9
K（K）⁺去极化诱导NG108-15细胞表达的γ-PKC-GFP易位。用高K替换外部溶液⁺-包含一个快速诱导的γ-PKC–GFP易位。γ-PKC-GFP的荧光在质膜和邻近细胞质上以斑片状斑点的形式积聚，如Ca²⁺离子载体诱导的易位。棒材，10μm。

**图10**
NMDA诱导COS-7细胞中与NMDA受体共存的γ-PKC-GFP易位。通过电穿孔将NMDARζ1和NMDARε1亚单位与γ-PKC-GFP共转染到COS-7细胞中。在不含镁的情况下，将1mM的NMDA用于细胞²⁺以及存在10μM甘氨酸。NMDA诱导γ-PKC-GFP轻微但显著的易位。同时应用100μM AP-5和1 mM NMDA阻断NMDA诱导的γ-PKC-GFP易位。棒材，10μm。

**图11**
mGluR1介导的γ-PKC-GFP易位。如文中所述，通过脂质体感染将γ-PKC-GFP转染到稳定表达mGluR1的CHO细胞中。(*上部记录道*)1 mM的应用*反式-*ACPD可快速诱导γ-PKC-GFP从胞浆向细胞膜移位。荧光在20分钟内从细胞膜重新定位到细胞液(*下部记录道*)500μM MCPG与1 mM同时使用反式-ACPD完全阻断了mGluR1介导的γ-PKC-GFP易位。棒材，10μm。

**图12**
γ-PKC-GFP易位参与细胞骨架。(A类)10μM细胞松弛素D对γ-PKC-GFP易位的影响。10μMγ-PKC-GFP治疗既不影响TPA-也不影响A23187诱导的γ-PKC-GFP易位。(B类)100μM秋水仙碱对γ-PKC-GFP易位的影响。用100μM秋水仙碱处理不会影响TPA或A23187诱导的移位。在这些实验中，如文中所述，通过脂质体感染将γ-PKC-GFP转染到NIH3T3细胞。TPA和A23187的浓度分别为1和50μM。棒材，10μm。

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