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.1997年11月；8(11):2307-27.
doi:10.1091/mbc.8.11.2307。

一种新的环指蛋白复合物，对蛋白质运输到酵母液泡的后期步骤至关重要

东南里德 1, S D Emr公司
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一种新的环指蛋白复合物对蛋白质向酵母液泡转运的后期步骤至关重要

东南里德等。 摩尔生物细胞. 1997年11月.
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摘要

蛋白质向酵母中溶酶体样液泡的转运由多种途径介导，包括液泡水解酶的生物合成途径、内吞途径和自噬。在酿酒酵母液泡蛋白分选（VPS）所需的40多个基因中，4个C类VPS基因的突变导致了最严重的液泡蛋白分拣和形态缺陷。在此，我们提供了补充的遗传和生物化学证据，证明C类VPS基因产物（Vps18p、Vps11p、Vp16p和Vps33p）在物理和功能上相互作用，以介导蛋白质向液泡转运的后期步骤。化学交联实验表明，Vps11p和Vps18p均含有环指锌结合域，是包含Vps16p和Sec1p同源物Vps33p的异低聚体蛋白复合物的组成部分。C类Vps蛋白复合物与液泡膜和明显的致密膜组分共定位。对含有温度调节型vps18等位基因（vps18tsf）的细胞的分析表明，Vps18p功能是生物合成、内吞和自噬蛋白质向液泡的转运途径所必需的。此外，vps18tsf细胞积聚了多泡体、自噬体和其他膜室，这些膜室似乎代表了被阻断的转运中间产物。过度生产Vps16p或液泡突触蛋白同源物Vam3p抑制了与vps18tsf突变细胞相关的缺陷，表明C类Vps蛋白和Vam3p可能在功能上相互作用。因此，我们认为C类Vps蛋白是一种异寡聚体蛋白复合物的组成部分，该复合物介导多种转运中间体向液泡的传递。

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图1
图1
第18版总悬浮液无名指突变体展示多路传输中的快速温度条件缺陷液泡蛋白。（A） 四个C级Vp的示意图概要蛋白质：Vps18、Vps11p、Vps16p和Sec1p同源物Vps33。电压18p和Vps11p都具有C端环指锌结合域（环）。预测采用α螺旋线圈的磁畴确认（线圈2.1，Lupas等。，1991）是用阴影框表示。（B） 环形指的示意图锌结合域（摘自Borden和Freemont，1996）。突变Vps18p环指结构域中第一个保守的半胱氨酸（C）826S） 使Vps18p对函数具有温度敏感性（电压18总悬浮液p） ●●●●。（C） WT（野生型，SEY6210）和第18版总悬浮液（SRY18T-1）球状体在标记之前，在26°C或38°C下预培养5分钟Expres公司35S 15分钟，追逐45分钟培养物分为细胞内（I）和细胞外（E）分数。其中CPY、ALP和CPS的丰度和大小通过免疫沉淀、SDS-PAGE和荧光照相术。高尔基修饰前体（p2，pro）和成熟前体（m）指出了液泡蛋白的形式。（D）第18版总悬浮液（SRY18T-1）球状体在标记之前，在38°C下预培养5分钟Expres公司35S 10分钟，追逐15分钟然后在38°C或26°C，然后分离为细胞内（I）和细胞外（E）分数。这些组分中CPY的丰度和大小为通过免疫沉淀、SDS-PAGE和荧光法测定。
图2
图2
第18页总悬浮液细胞聚集38°C下不同流行区的ALP和CPS前体。（A） 由第18版总悬浮液用Expres标记（SRY18T-1）细胞20分钟35S和在26°C或38°C下追逐40分钟，然后在低张状态下进行溶血缓冲区。300×离心后克，的将裂解产物依次离心，生成13000×克颗粒（P13），100000×克颗粒（P100）和100000×克上清液（S100）分数。ALP和CPS水解酶从每一种中免疫沉淀分数，通过SDS-PAGE进行解析，并通过荧光成像进行可视化。（B）第18版总悬浮液（SRY18T-1）球状体35S标记20分钟，追逐40分钟38°C，然后在低渗缓冲液中进行溶解。离心后300 ×克，裂解物被装载在Accudenz梯度。离心至平衡后，梯度收集组分，并将标记的CPS分布前体物通过免疫沉淀和SDS-PAGE测定。收件人定位液泡膜，未标记成熟的分布通过Western blotting和ECL分析测定空泡ALP。
图3
图3
细胞内转运至液泡第18版总悬浮液突变细胞。（A） 野生型（WT，6210瑞典克朗）和第18版总悬浮液（SRY18T-1）细胞26°C下用重要荧光内吞标记FM4–64染色或38°C。在26°C或38°C的YPD中追逐后，染色细胞通过Nomarski（左）和荧光显微镜（右）观察。（B） 的稳定性一-因子信息素转运体Ste6p通过脉冲追踪分析测定。野生型（WT，6210.1瑞典克朗，材料一)以及第18版总悬浮液（SRY18T-4，材料一)含有pDB192的细胞(2μSTE6标准)在26°C下生长，并在38°C下培养5年在38°C下贴标签前15分钟。添加管槽后（时间0′），在38°C下进一步培养，样品在指定的时间点收获（大通）。这些样品是用Ste6p特异性抗血清进行免疫沉淀SDS-PAGE分析。
图4
图4
自噬检查第18版总悬浮液通过电子显微镜观察突变细胞。第18版总悬浮液第四人民党Δ（SRY18T-9）电池在26°C下呈指数增长，然后转移到氮保护培养基诱导自噬。2.5小时后在26°C或38°C培养时，细胞固定并准备进行超微结构分析。（A） 典型的第18版总悬浮液第四人民党Δ电池在26°C，液泡内含有自噬体。（B） A类a的部分第18版总悬浮液第四人民党Δ电池38°C时饥饿，在细胞质中积聚自噬体（箭头所示）。棒材，1μm。细胞核和液泡是分别用字母n和v标记。
图5
图5
超结构分析第18页总悬浮液突变细胞。第18版总悬浮液（SRY18T-1）和第18版-Δ1（JSR18Δ1）细胞固定，锇/硫代碳酰肼处理和脱水后嵌入，以及然后切片并染色以进行电子显微镜检查。（A） A横截面的第18版总悬浮液（SRY18T-1）细胞在26°C下生长。（B） 在38°C下培养2.5小时后，来自相同培养物的细胞。箭头表示膜室集群在液泡附近堆积第18版总悬浮液单元格位于38°C。（C–G）中的膜室示例第18版总悬浮液放大倍率更高的细胞。这个箭头表示一些类似于多泡的结构身体。（H） A的横截面第18版-Δ1电池（JSR18Δ1）在30°C。棒材：A、B和H，1μm；C–G，0.5μm。原子核（n）和标记液泡（v）。
图6
图6
遗传相互作用视频处理16,视频处理18,视频处理33，以及VAM3型.（A）第18版总悬浮液包含各种质粒在36°C下孵育5分钟，然后标记15分钟Expres的最小值35并在36°C下追逐45分钟。CPY公司通过免疫沉淀回收，并通过SDS-PAGE进行解析。这个高尔基修饰前体（p2）和成熟（m）CPY的位置为表明。这个第18版总悬浮液细胞中含有以下质粒：载体pRS426（2μ载体，通道1），欧洲标准化委员会-基于质粒pJSR6(视频处理18，车道2），和基于2μ的多拷贝质粒pVPS16–36(2μ视频处理16，车道3）和pVAM3型.424（2μVAM3型，车道4）。（B） CPY排序视频处理33–4检测了含有不同质粒的细胞在30°C下进行脉冲追踪分析（如上所述）。以下内容使用质粒：载体pRS426（2μ载体，1区），欧洲标准化委员会-基于pLB33–162的质粒(视频处理33，车道2） 和多拷贝2μ基质粒pJR18-5(2μ视频处理18，车道3）和pVPS16–36(2μ视频处理16，车道4）。
图7
图7
C类Vps蛋白在异寡聚体蛋白复合物。（A） WT产生的球形体（野生型，SEY6210），第18版-Δ1（JSR18Δ1），以及vps11版-Δ2（6211瑞典克朗e（电子）)菌株被标记为Expres公司35S作用30分钟，追逐30分钟，然后渗透溶解。裂解物用交联剂DSP（+X-linker）处理或模拟处理（−X-接头）。交联提取物经过变性非还原条件下的免疫沉淀Vps18p特异性抗血清（1–3道）或Vps11p特异性抗体（4-6车道；第一Ab）。免疫沉淀减少1%2-巯基乙醇（+还原）并进行再免疫沉淀Vps18p-和Vps11p-特异性抗血清（第二抗体）。（B）WT产生的球形体（野生型，SEY6210），虚拟专用数据库33-Δ2（LBY317），以及第16版-Δ2（BHY113）菌株35S标记，渗透溶解，用DSP处理如上所述。交联和模拟处理提取物为使用Vps11p特异性进行顺序免疫沉淀抗血清（第一抗体），然后用变性但不还原的Vps18p特异性抗血清（第二抗体）条件。（C） 1-4车道，35S放射性标记WT（野生型，SEY6210）球原生质体渗透溶解并用DSP处理如上所述。交联提取物经过Vps11p特异性抗血清免疫沉淀（第一抗体）。这个然后用还原剂或非还原缓冲区（分别为+或−还原），然后用所示抗血清（第二抗体）再次沉淀。5号车道，35标有S的vps11版-Δ2（6211瑞典克朗e（电子）)以及第18版-Δ1（JSR18Δ1）裂解产物在用DSP和按照上述顺序进行免疫沉淀。总共例，分析前最终免疫沉淀物减少SDS-PAGE电泳。
图8
图8
C类Vps的亚细胞定位蛋白质。（A） 野生型球形体（SEY6210）被标记为Expres公司35S持续30分钟，并在裂解前追赶60分钟低渗缓冲液。300×离心后克，对裂解产物进行顺序离心生成13000×克颗粒（第13页），100000×克颗粒（P100）和100000×克上清液（S100）级分。Vps18p、Vps11p、Vps 16p、，通过定量测定每个组分中的Vps33p免疫沉淀法、SDS-PAGE和荧光法。（B） 分布这些组分中的几个细胞器标记蛋白也免疫沉淀法测定：mALP（液泡）、Pep12p（内胚体隔间）、Kex2p（晚期高尔基体）和葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PDH，细胞质）。（C） 细胞Accudenz梯度分馏裂解物。将野生型球形体（SEY6210）标记30分钟Expres公司35S并在低张溶栓前追赶60分钟缓冲区。在300×克并且是然后加载到Accudenz坡度的顶部。离心至收集平衡、梯度分数和Vps18p、Vps11p、ALP、，和Pep12p通过免疫沉淀回收，并通过SDS-PAGE电泳。
图9
图9
C类Vps蛋白是可沉积的蛋白质复合物。野生型（SEY6210）球形体用Expres标记30分钟35S并追赶60分钟在低渗缓冲液中溶解之前。在300度的净空旋转后×克，用试剂处理裂解产物指示15分钟，然后以100000×克45分钟生成上清液（S100）和颗粒（P100）分数。Vps18p和Vps11p从每一种中免疫沉淀分数，通过SDS-PAGE进行解析，并通过荧光成像进行可视化。
图10
图10
C类Vps蛋白介导向液泡输送多种运输中间体。普通人四种C类的表型虚拟专用交换机也有空突变体正如观察到的视频处理33,视频处理16，以及视频处理18基因，表明C类Vps蛋白在相同的转运步骤中发挥作用。交叉链接研究表明，Vps11p、Vps18p和Vps16p是与Sec1p同源物Vps33p相互作用的蛋白质复合物。A类C类Vps蛋白复合物的重要部分共分离带有液泡膜。当切换到非允许温度时，第18版tsf公司细胞出现缺陷沿着两条不同的生物合成途径（I，CPY/CPS；二、 ALP）、内吞途径和自噬。此外，液泡突触蛋白同源物Vam3p的过度表达受到抑制相关缺陷第18版tsf公司细胞。因此，我们认为C类Vps蛋白共同起作用使用Vam3p调节后期运输的对接和/或融合带有液泡的中间产物。
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    1. Ammerer G、Hunter CP、Rothman JH、Saari GC、Valls LA、Stevens TH。酿酒酵母的PEP4基因编码蛋白酶A，一种处理液泡前体所需的液泡酶。分子细胞生物学。1986;6:2490–2499.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Baba M，Takeshige K，Baba N，Ohsumi Y。酵母自噬过程的超微结构分析：自噬体的检测及其特征。细胞生物学杂志。1994;124:903–913.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Babst M，Sato TK，Banta LM，Emr SE。酵母的内体运输功能需要一种新的AAA型ATP酶Vps4p。EMBO J.1997；16:1820–1831.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bankaitis VA，Johnson LM，Emr SD。分离蛋白质靶向液泡缺陷的酵母突变体。美国国家科学院院刊，1986年；83:9075–9079.-项目管理咨询公司-公共医学

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