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.1997年6月10日;94(12):6191-6.
doi:10.1073/pnas.94.12.6191。

蛋白激酶C zeta与新型蛋白激酶C结合蛋白ZIP的相互作用

附属公司

蛋白激酶C zeta与新型蛋白激酶C结合蛋白ZIP的相互作用

A脉冲等。 美国国家科学院程序. .

摘要

非典型蛋白激酶C(PKC)成员PKC-zeta参与了多种调节哺乳动物细胞分化、增殖或凋亡的信号转导途径。我们在这里报道了一种细胞质和膜相关蛋白的鉴定,我们将其命名为zeta-interacting protein(ZIP),该蛋白与PKC-zeta的调节域相互作用,但与经典PKC无关。ZIP中的结构基序包括一个最近定义的ZZ锌指作为潜在的蛋白质结合模块、两个PEST序列和一个新的假定的具有一致序列YXDEDX5SDEE/D的蛋白质结合基序。ZIP结合到PKC-zeta调控域中的假底物区域,并在体外被PKC-zeta磷酸化。ZIP通过促进与PKC-zeta结合的同一区域二聚化,表明ZIP:ZIP和ZIP:PKC-zeta复合物之间存在竞争情况。在缺乏PKC-zeta的情况下,ZIP的适当亚细胞定位受到损害,我们表明ZIP的细胞内靶向性依赖于与PKC-zeta的平衡相互作用。考虑到最近其他人在不同背景下分离出的ZIP,我们提出ZIP可能作为连接PKC-zeta与蛋白酪氨酸激酶和细胞因子受体的支架蛋白。

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数字

图1
图1
ZIP cDNA的克隆。(A类)ZIP与小鼠序列A170(30)和人类蛋白p62(19)的比对。Cdc24同源性(见图2)用实线标记,ZZ指用虚线标记,PEST序列用方框标记。点表示身份,破折号表示路线中的间隙。(B类)Western blot分析显示ZIP在5个细胞系中表达。作为免疫染色的对照,GST-ZIP融合蛋白(93 kDa)显示在通道1中,并标有星号。
图2
图2
ZIP中假定的蛋白质结合模块。同源性用爆炸从以下参考文献中提取程序(32)和序列:S.pombe公司scd1(33)中,酿酒酵母Cdc24(34)、大鼠MEK5(35)、人TRK-T3(36)和人p40凤凰(phox)(37).
图3
图3
ZIP和PKC-ζ之间的特定相互作用。(A类)将GST对照蛋白或GST-ZIP融合蛋白(如图所示)固定在谷胱甘肽Sepharose珠上,并与纯化的PKC-ζ(泳道2)、纯化的PKC-α(泳道3)或纯化的PKC-βI(泳道4)一起孵育。洗涤后,用SDS/PAGE溶解复合物,并用PKC-ζ(顶部)或PKC-α和-β(底部)抗血清依次孵育相同的免疫印迹。通道5-7显示了结合分析中使用的纯化PKC蛋白的数量。(B类)从昆虫细胞纯化的PKC-ζ在磷酸化反应中与[32P] -单独标记的ATP(通道1)、纯化的GST-ZIP(通道3)或不相关的控制蛋白GST-MEK(通道2)。图示为磷酸化反应的放射自显影。(C类)PKC-ζ是从表达ZIP(第1道)、PKC-ξ(第2道)或同时表达ZIP和PKC-Ze(第3道)的COS细胞提取物中免疫沉淀而来。分析免疫沉淀物中是否存在PKC-ζ(左侧)或ZIP(赖特)通过序列Western blot分析。
图4
图4
ZIP和PKC-ζ上的结合位点。(A类)如图所示,ZIP缺失突变体与全长PKC-ζ在HF7c酵母细胞中共表达。β-半乳糖苷酶分析中的染色显示在右侧(lacZ)。左边的数字给出了氨基酸的位置。(B类)如图所示,PKC-ζ的缺失突变体与全长ZIP一起进行分析,如A类. (C类)ZIP突变体融合到GAL4激活域(左侧)在HF7c酵母细胞中与融合到GAL4 DNA结合域的ZIP突变体共表达(赖特). β-半乳糖苷酶活性的相互作用(左侧赖特)右侧显示(lacZ)。ZIP中的黑框表示Cdc24同源性(见图2),ZZ锌指的相对位置用ZZ表示。PKC-ζ中的点缀框表示PKC-ξ锌指,其前面是用星号标记的伪基底序列。
图5
图5
ZIP或PKC-ζ的异位表达。转染表达载体pMT2-ZIP的COS细胞在24小时后固定(A类)或48小时(B类C类). 用辣根过氧化物酶偶联物间接免疫化学检测ZIP(A类B类)或德克萨斯州红色标签(C类)二级抗体。N个将核标记为A类B类和核C类用4′,6-二氨基-2-′-苯基吲哚染色。(D类)转染pMT2-PKC-ζ表达载体的COS细胞在转染后48小时用德克萨斯州红标二级抗体进行PKC-ξ染色。(E类F类)表达ZIP的COS细胞与罗丹明-123孵育40小时,以染色线粒体(E类)然后将其固定,并通过间接免疫荧光检测ZIP的表达(F类). 表示ZIP的单元格由箭头标记。
图6
图6
通过PKC-ζ而非ERK对ZIP进行细胞内靶向。COS细胞与编码myc-标记ZIP和PKC-ξ的表达载体共转染(A–D)或myc-ZIP和ERK2(E类F类). 40小时后固定细胞,并通过间接免疫荧光观察蛋白质。ZIP用荧光素(绿色)、PKC-ζ检测,ERK用罗丹明(红色)检测。双重曝光(C类D类)(黄色)显示ZIP和PKC-ζ的重叠荧光。(A–C)左侧细胞仅表达ZIP并呈点状染色,右侧细胞共存于ZIP和PKC-ζ并呈弥漫染色。(D类)在两个黄色单元格ZIP和PKC-ζ共定位中,右上角的单元格仅表达ZIP。(E类F类)尽管不相关蛋白激酶ERK(红色)ZIP(绿色)共表达,但其分布不均匀,但仍聚集在一起。细胞核用4′,6-二氨基-2-′-苯基吲哚染色。

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