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.1997年3月24日；136(6):1201-12.
doi:10.1083/jcb.136.6.1201。

核层粘连组织的破坏改变复制因子的分布并抑制DNA合成

T P跨度 1, R D莫尔, A E高盛, R斗杆, 高盛研发部
附属公司

核层粘连组织的破坏改变复制因子的分布并抑制DNA合成

T P跨度等。 J细胞生物学. .

摘要

核膜是一种纤维结构，位于核膜和核质之间的界面。包括纤层的主要蛋白质，即核纤层蛋白，也存在于核质的病灶中，不同于外周纤层。核层粘连蛋白与细胞核中的许多过程有关，包括DNA复制。为了进一步描述层粘连蛋白在DNA复制中的特殊作用，我们使用截短的人类层粘连作为显性阴性突变体来干扰层粘连组织。当微量注射到哺乳动物细胞中时，该蛋白会破坏细胞核的层粘连组织，当添加到非洲爪蟾间期卵子提取物中时，也会破坏体外组装细胞核的层黏连组织。在这两种情况下，椎板似乎完全缺失，相反，内源性层粘连蛋白和突变层粘连蛋白质在核质聚集体中发现。与层粘连组织的破坏同时，DNA复制也急剧减少。由于这种破坏，PCNA和RFC复合体的大亚单位（DNA复制延长期所需的蛋白质）的分布发生改变，从而在核质内层粘连聚集体中发现它们。相反，XMCM3、XORC2和DNA聚合酶α（DNA复制起始阶段所需的蛋白质）的分布保持不变。所提供的数据表明，DNA复制的延伸阶段可能需要核层粘连。

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数字

图1
图1
(一)纯化ΔNLA的SDS-PAGE和(b条)使用多克隆层粘连蛋白a/C抗体进行相应的Western blot（39）。主谱带为69 kD，即ΔNLA的预测分子质量。也有小条带，代表核层粘连蛋白制剂中表达的蛋白水解片段大肠杆菌(38). 左边的数字表示以kD为单位的分子质量大小标记。
图2
图2
双标记免疫荧光显示正常间期BHK细胞和注射ΔNLA的细胞的核层粘连模式。细胞核染色以检测层粘连蛋白A/C(洛杉矶) (一和c（c）)或层粘连蛋白B(磅) (b条和d日). 在未注射的细胞中，有一个独特的层粘连边缘以及不太强烈的核质病灶(一和b条)，如前所述（39）。在注射后2小时固定的细胞中，层粘连边缘不再明显，而层粘连A/C和B的层粘连染色主要出现在同一病灶中(c（c）和d日). 共焦光学显示了穿过原子核中间区域的截面。棒材，5μm。
图3
图3
在含有人LA的反应中组装的细胞核的特征(一和b条)细胞核染色(一)人层粘连蛋白A和(b条)爪蟾人类LA没有破坏层粘连网络，似乎与内源性LB3共定位。(c（c）)核基质提取和人类LA染色后的核共焦显微图像。在基质提取方案后，LA染色保留在外周椎板中。(d–f日)同一核的三重标记制备的荧光图像。(d日)人层粘连蛋白A的细胞核染色；(e（电子）)生物素化dUTP掺入模式，如得克萨斯州红色缀合的链亲和素所示(代表); (（f）)显示DNA位置的赫斯特染料。加入层粘连蛋白A似乎不会改变提取物中的DNA复制。棒材，5μm。
图6
图6
在核组装反应中添加ΔNLA抑制DNA复制，如生物素化dUTP掺入减少所示。LB3模式和生物素化dUTP掺入的荧光图像(一和b条)控制核和(c–f)ΔNLA存在时形成的核。(一,c（c）、和e（电子）)使用抗体的免疫荧光爪蟾LB3；(b条,d日、和（f）)德克萨斯红共轭链霉亲和素显示了生物素化dUTP的结合模式。与对照细胞核相比，层粘连组织的破坏大大抑制了生物素化核苷酸的掺入。然而，所有的层粘连核确实包含标记核苷酸掺入的微弱点状核质模式，可通过共焦显微镜轻易分辨。(a–d)传统光学（请参见（f）). (e（电子）和（f）)共焦光学。棒材，5μm。
图4
图4
核的双标记荧光观察染色的不同方面的核膜结构和功能。(a–f)在含有以下成分的相间提取物中组装细胞核：(一和b条)缓冲控制(c（c）和d日)层粘连蛋白A和(e（电子）和（f）)ΔNLA。细胞核染色(一)层粘连蛋白B3或(c（c）和e（电子）)人类层粘连蛋白A，以及(b条,d日、和（f）)使用荧光标记WGA的核孔WGA结合蛋白。在所有三种条件下组装的细胞核似乎在核外围具有WGA结合蛋白的基本正常分布。(克和小时)在ΔNLA存在下组装细胞核，并对其进行染色(克)ΔNLA和(小时)膜染料DIOC6(MEM公司). 细胞核含有一个被破坏的层粘连蛋白组织，但保留了正常的膜染色。棒，5μm。(我和j个)将野生型层粘连蛋白A导入(我)缓冲控制和(j个)ΔNLA破坏细胞核。使用myc 9E10表位抗体检测野生型层粘连蛋白A（13）。使用或不使用ΔNLA组装细胞核，组装开始后90分钟，将myc标记的人类层粘连蛋白A添加到反应中。20分钟后将细胞核固定并用myc抗体染色。两者都有(我)控制和(j个)ΔNLA断裂的细胞核显示出显著的myc染色，表明断裂的细胞核保留了导入蛋白质的能力。大多数输入蛋白定位于ΔNLA破坏细胞核的特征性病灶。共焦光学显示穿过原子核中间区域的截面。棒材，5μm。
图5
图5
核组装在含有ΔNLA的相间提取物中。(a–c)常规荧光图像的层粘连和细胞核染色的DNA模式(一)人类LA(b条)爪蟾LB3和(c（c）)DNA。(d日和e（电子）)受损细胞核染色的共焦图像(d日)人类LA和(e（电子）)爪蟾LB3.内源性层粘连结构被破坏，LB3出现与ΔNLA共定位的病灶。棒材，5μm。
图7
图7
向核组装反应中添加ΔNLA可减少[32P] dCTP掺入率为～95%。(A类)琼脂糖凝胶的自显影图显示掺入32P标记的dCTP进入在缓冲液控制或ΔNLA存在下形成的细胞核DNA。核组装后，按照材料和方法中的描述对样品进行处理，并在0.8%琼脂糖凝胶上进行溶解。上部带位于凝胶的原点。(B类)复制分析的定量如所示答：。用FUJIX BAS 2000磷光成像仪定量干燥凝胶的放射性信号。每条通道中两个波段的信号强度/面积值之和用于测量放射性并入DNA的总量。四次重复分析的平均值绘制在条形图中，纵轴表示成像仪确定的信号/面积值（单位：千）。含有ΔNLA的样品的平均值为2292，范围为2035–2513。对照样品的平均值为39030，样品范围为34514–47443。在核组装反应中加入ΔNLA减少了32P标记的dCTP为对照反应中发现的dCTP的~5%。
图8
图8
细胞核在ΔNLA的存在下形成，然后对ΔNLA或层粘连蛋白B3和几个早期DNA复制标记之一进行染色。(一和b条)细胞核染色(一)ΔNLA和(b条)DNA聚合酶α。(c（c）和d日)细胞核染色(c（c）)LB3和(d日)XORC2。(e（电子）和（f）)细胞核染色(e（电子）)LB3和(（f）)XMCM3。DNA聚合酶α、XORC2和XMCM3的分布不会因层粘连结构的破坏而改变。共聚焦显微图像显示了穿过细胞核中间的截面。棒材，5μm。
图9
图9
与核伸长有关的层粘连蛋白和DNA复制因子的染色模式(一和d日)缓冲器或(b条,c（c）,e（电子）、和（f）)ΔNLA。(一)对照细胞核PCNA染色。(b条和c（c）)在ΔNLA染色的情况下组装的细胞核(b条)PCNA和(c（c）)ΔNLA。(d日)对照细胞核RFC染色。(e（电子）和（f）)在ΔNLA染色的情况下组装的细胞核(e（电子）)RFC和(（f）)ΔNLA。由于层粘连破坏，PCNA和RFC分布与对照组不同，因此PCNA和REC与这些细胞核中的层粘连聚集体共定位。共聚焦显微镜显示穿过细胞核中部的切片。棒材，5μm。
图10
图10
(一和b条)在ΔNLA存在下形成的细胞核中的层蛋白和生物素化dUTP掺入，随后转移到含有生物素化的dUTP但缺少ΔNLA的间期提取物中（见正文）。共焦显微照片显示了穿过细胞核中部的部分。(一)细胞核染色爪蟾伦敦银行3(b条)德克萨斯红共轭链霉亲和素结合显示的生物素化dUTP结合模式。被破坏的细胞核被转移到缺乏ΔNLA的核组装反应中，在那里它们形成层粘连边缘并复制DNA。然而，一些层粘连病灶仍然存在。(c（c）)体外组装核的层粘连蛋白结构的组装后破坏。在核形成开始后90分钟添加ΔNLA，此时细胞核具有正常的层粘连组织，并且基本上完成了DNA复制。ΔNLA的加入破坏了组装的LB3染色模式。棒材，5μm。
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