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.1996年10月1日；16(19):6021-37.
doi:10.1523/JNEUROSCI.16-19-06021.1996。

阿尔茨海默病斑块中β-淀粉样蛋白的特定结构域引发人类小胶质细胞的神经元杀伤

D朱利安 1, L J哈弗坎普, J H Yu先生, W卡申, D汤姆, J李, 柯克帕特里克J, L M Kuo先生, A E罗赫
附属公司

阿尔茨海默病斑块中β-淀粉样蛋白的特定结构域引起人类小胶质细胞的神经元杀伤

D朱利安等。 神经科学. .

摘要

阿尔茨海默病（AD）被发现有显著的脑部炎症，其特征是围绕老年斑块的成簇反应性小胶质细胞。最近的一项研究表明，与孤立斑块碎片接触的小胶质细胞会释放神经毒素。为了进一步探讨AD的免疫激活过程，我们分离斑块蛋白并测试其刺激小胶质细胞的能力。三个斑块衍生组分，每个含有全长天然Aβ1-40或Aβ1-42肽，诱导小胶质细胞释放神经毒素。对各种合成肽（Aβ1-16、Aβ1-28、Aβ12-28、Aβ25-35、Aβ17-43、Aβ1-40和Aβ1-42）的筛选证实，小胶质细胞只有在暴露于纳摩尔浓度的人Aβ1-40或人Aβ1-42后才能杀死神经元，而啮齿类动物Aβ1-40（5Arg->Gly，10Tyr-->Phe 13His->Arg）未处于活动状态。这些发现表明，人类Aβ的特定部分对小胶质细胞-塑性相互作用是必要的。当与微球结合时，人类Aβ的N末端部分（Aβ1-16，Aβ1-28，Aβ12-28）为小胶质细胞粘附提供了锚定位点，而C末端区域则没有。尽管其本身无毒，但人类Aβ的10-16结构域对小胶质细胞的结合和激活都是必要的。多肽阻断AD中发生的小胶质细胞-塑性相互作用可能会防止免疫驱动的神经元损伤。

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数字

图1。
图1。
从混合海马培养物中选择性消除小胶质细胞。A、 C、E，对照培养物显示MAP-2/NF免疫染色显示的复杂神经网络(A类)，存在DiI-ac-LDL（+）小胶质细胞(C类)和GFAP（+）星形胶质细胞的近汇合饲养层(E类).B、 D、F，用与乙酰化低密度脂蛋白偶联的皂苷处理培养物后，小胶质细胞被消除(D类)对两个神经元的存活没有影响(B类)或星形胶质细胞(F类). 比例尺，25μm。G公司，经和未经Sap-ac-LDL治疗的特定细胞群计数证实了小胶质细胞的特定耗竭。数据表示为平均值±SE，从至少五个独立培养物的九个随机选择的区域中获得，放大200倍观察。
图2。
图2。
溶解的天然老年斑的成分会引起神经元死亡。A类，从皮质灰质中分离出中性粒/核心或弥漫性斑块，溶解在甲酸中，并用甜菜碱缓冲液透析。等量的斑块蛋白（归一化为400μm时的总胺含量米)在有或无大鼠小胶质细胞的情况下，加入神经元培养物中。如图所示，可溶性神经炎/核心斑块蛋白(神经炎/核心菌斑)导致神经元大量死亡，但仅在小胶质细胞存在的情况下。溶解的弥散斑块蛋白(扩散菌斑)也不是甜菜碱缓冲液(缓冲区控制)引发神经毒性活动。B类，使用两个串联的Superose 12柱（300 mm×10 mm×2；珠状物，10μm直径）对神经炎/核心斑块蛋白质进行尺寸排除色谱分析。色谱图采用80%玻璃蒸馏甲酸，流速为0.3ml/min，并在280nm处进行监测。馏分的近似分子质量包括以下各项：S1200；S2，45；S3，15；S4、10；和S5，5 kDa（分数组成见表1）。C类直方图显示，暴露于峰值S3、S4和S5都会导致形态学标准定义的反应性小胶质细胞百分比显著增加（见材料和方法），而峰值S1和S2则不会。D类，将部分溶解的神经炎/核心斑块应用于海马培养物中是否存在小胶质细胞。在不含小胶质细胞的培养物中未检测到神经元杀伤。然而，在暴露于峰值S3、S4和S5的含有小胶质细胞的培养物中出现神经元丢失，这些峰值均含有Aβ（见表1）。
图3。
图3。
天然斑块的可溶部分诱导小胶质细胞反应。暴露于S1峰的大鼠小胶质细胞培养物的亮场显微照片(A类)或峰值S5(B类)并对Aβ的存在进行免疫染色。如图所示，在与峰值S5孵育的培养物中发现Aβ聚集体。比例尺，25μm。相显微照片显示，培养的小胶质细胞是具有棘状表面的过程承载细胞，是典型的非反应细胞，尽管暴露于S1峰值(C类). 相反，暴露于峰值S5的小胶质细胞收缩过程，呈现出与AD大脑相似的反应性细胞形态(D类). 比例尺，5μm。
图4。
图4。
合成Aβ肽对神经元的毒性作用。A、 B类，在含有神经元和星形胶质细胞（但小胶质细胞缺失）的海马培养物中放置高浓度的大多数Aβ肽，效果甚微。然而，aβ25-35在≥30μ米在两个神经元上(A类)和星形胶质细胞(B类). 在没有小胶质细胞的情况下，Aβ肽（在1μ米)会破坏神经元。然而，当将大鼠小胶质细胞添加到神经元培养物中时，只有Aβ1-40和Aβ1-42引发神经元杀伤(C类).D类增加越来越多的小胶质细胞，在150个小胶质细胞/mm的密度下显示出饱和的神经元杀伤反应2与1μ米Aβ1-42；电镀时E18培养物中发现小胶质细胞(内源性小胶质细胞)在Aβ存在下也显示出有效的杀伤能力。这些观察结果表明，在评估Aβ毒性机制时，需要耗尽小胶质细胞的神经元培养物。E类，剂量-反应曲线显示Aβ1-42是最有效的小胶质细胞刺激，估计ED50共10个米，与80 n相比米对于Aβ1-40（500小胶质细胞/mm2).
图5。
图5。
暴露于合成Aβ肽的细胞反应。相位显微镜显示，培养的大鼠小胶质细胞在暴露于1μ米Aβ1-42(E类); 相比之下，1μ米Aβ17-43(C类)不会改变小胶质细胞的形态，这与在对照条件下生长的未经处理的细胞相同(A类). 神经元和小胶质细胞培养物的荧光显微镜显示出强大的NF（+）MAP2（+）海马神经元(B类)加入1μ米Aβ17-43(D类). 然而，如果海马培养物暴露于1μ米Aβ1-42(F类). 比例尺，25μm。
图6。
图6。
Aβ与微球偶联后激活小胶质细胞。荧光标记微球与Aβ1-42共价偶联，并放置在含有大鼠小胶质细胞（500细胞/mm）的海马培养物中2). 72小时后，Aβ1-42球体(A类)特异性定位于DiI-ac-LDL（+）小胶质细胞(B类; 共定位由箭头). 相反，Aβ17-43微球(C类)与小胶质细胞没有一致的联系(D类). 比例尺，20μm。E类Aβ在溶液中或与微球耦合时的容量比较(珠子装订)诱导神经毒性小胶质细胞（250000个微球/培养；100000个小胶质细胞/培养；72小时培养）。无论Aβ肽是在溶液中还是结合在小球上，神经元的丢失都是相似的，这表明纤维的形成或三级结构的其他变化对于刺激神经毒性小胶质细胞是不必要的。
图7。
图7。
暴露于Aβ1-42后海马培养物的荧光显微照片。A类，对照培养物显示NF（+）MAP-2（+）神经元的复杂网络。B类，将培养物暴露于100μ米在没有小胶质细胞的情况下，Aβ1-42对神经元数量没有影响，而(C类)添加100 n米大鼠小胶质细胞（500细胞/mm）存在时的Aβ1-422)几乎摧毁了所有神经元。D–G型神经特异性烯醇化酶（NSE）的免疫染色对CNS培养物中的神经元没有特异性，如无神经视神经培养物中胶质细胞的免疫荧光可视化所示，包括半乳糖苷（+）寡突胶质细胞(D类)和GFAP（+）星形胶质细胞(F类)，均为NSE（+）(E类和G公司）。比例尺，10μm。H（H）睫状体神经元培养显示，在没有脑胶质细胞的情况下（仅Aβ1-42），暴露48小时后，Aβ1-52对神经元没有毒性。来自Aβ1-42刺激的小胶质细胞的条件培养基(小胶质细胞+Aβ1-42)然而，确实杀死了神经元，这表明星形胶质细胞对小胶质细胞的神经毒性不是必需的。
图8。
图8。
人类小胶质细胞与神经元杀伤。A类，只有溶解的神经炎/核心斑块中含有Aβ的部分[峰值S3（54 n米)，S4（220牛顿米)和S5（250 n米)]诱导人类小胶质细胞参与神经毒性行为。B类，当在1μ米浓度、合成的Aβ1-40和Aβ1-42也能刺激人小胶质细胞释放神经毒素，而较小的Aβ片段则无作用。尽管神经元被杀死，但没有证据表明用天然硝酸盐或亚硝酸盐刺激的人体细胞会增加硝酸盐或亚硝酸盐的产生(C类)或合成的(D类)Aβ。E类，暴露于1μ米Aβ1-42或Aβ1-40的人类形态。然而，啮齿动物型Aβ1-40和人类Aβ片段（包括1-28、12-28和17-43）都是不活跃的。
图9。
图9。
药物阻断大鼠和人小胶质细胞Aβ诱导的神经元杀伤。为了研究细胞杀伤的机制，我们用1μ米Aβ1-42(大鼠/Aβ1-42)和具有级分S5的人细胞（含有250n米来自可溶性神经炎/核心斑块的天然Aβ1-42）(人/S5峰值).A类，作为自由基清除剂的药物（维生素E，100μ米; 过氧化氢酶，25 U/ml；谷胱甘肽，100μ米)不阻断小胶质细胞对神经元的杀伤。一氧化氮合成酶抑制剂没有观察到保护作用我-N个-5-（1-亚氨基乙基）鸟氨酸盐酸盐(我-NIO；10 μ米)或二苯基碘（DPI；300 n米)尽管NMDA拮抗剂AP5可以防止神经元死亡。B类、作用于受体部位的其他NMDA拮抗剂(AP7（AP7）)，在多胺监管场所(伊芬诺地尔)或离子通道(MK801型)所有这些都阻止了神经元死亡，而非NMDA谷氨酸拮抗剂(GAMS游戏,BNQX银行)没有。所有药物均在10μ米.C类从Aβ刺激的大鼠小胶质细胞条件培养基中分离神经毒素(Aβ1-42/小胶质细胞)或来自冷冻AD灰质(AD大脑)涉及在pH 10.5的乙酸乙酯中萃取、酸水解和顺序梯度RP-HPLC（C18柱，在dH中使用0–20%乙腈梯度2O和0.1%三氟乙酸）。小胶质条件培养基中的神经毒素活性与AD脑组织中的神经毒性活性通过使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）在～14%乙腈条件下进行共净化。对照组脑提取物或非刺激小胶质细胞培养液中未发现神经毒性（数据未显示）。
图10。
图10。
Aβ结构域与小胶质细胞的相互作用。A类，大鼠小胶质细胞粘附于与人Aβ1-42肽偶联的Sepharose珠的相显微照片。B类，同一珠子的荧光显微照片显示贴壁细胞被荧光小胶质标记物DiI-ac-LDL标记。比例尺，20μm。C类，6小时后大鼠小胶质细胞对Sepharose偶联珠的粘附。源于神经炎/核心斑块的斑块蛋白为小胶质细胞提供了锚定位点，Aβ1-42也是如此。重要的是，Aβ1-28也促进了珠子结合，而Aβ17-43则没有。对照组包括与甘氨酸偶联的珠子(对照甘氨酸)和牛血清白蛋白(控制-BSA). 所示数据表示为37°C下孵育6小时后，每100个随机选择的珠子的粘附细胞数±SE。
图11。
图11。
激活神经毒性小胶质细胞需要β细胞结合域。荧光显微照片显示微球与大鼠小胶质细胞（500/mm）富集培养物结合2)在37°C下孵育4小时后。Aβ肽与荧光微球的偶联显示Aβ1-42(A类)，Aβ12-28(D类)和Aβ10-16(E类)容易结合，而肽Aβ17-43(B类)，Aβ1-11(C类)和Aβ1-5(F类)没有。绑定模式的数量(G公司)表明含有氨基酸残基10–16的N末端区域是Aβ与小胶质细胞结合所必需的。当放大200倍观察时，数据表示为平均值±SE。
图12。
图12。
Aβ对小胶质细胞作用的比较。A类，剂量-反应曲线显示，尽管Aβ10-16能够与小胶质细胞结合，但它并没有引发神经毒性小胶质细胞。将该小胶质结合域添加到Aβ17-42（既不与小胶质结合也不引起毒性）中，产生了一种肽Aβ10-42，它既与小胶质相结合，又刺激小胶质杀死神经元。B类，图表比较了正在研究的合成肽的结构和功能。阴影区域图示了Aβ的N末端部分，该部分在人类和大鼠形态之间不同，是小胶质细胞粘附所必需的。
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