Targeted Mass Spectrometry Enables Multiplexed Quantification of Immunomodulatory Proteins in Clinical Biospecimens

doi:10.3389/fimmu.2021.765898

.2021年11月11日11:12:765898。

doi:10.3389/fimmu.2021.765898。 eCollection 2021年。

靶向质谱能够对临床生物样品中的免疫调节蛋白进行多重定量

杰弗里·怀特克¹, 瑞秋·A·伦丁¹, 雷昭（Lei Zhao）¹, Regine M Schoenherr女士¹, 奥拉·布里安¹, 黄东青¹, 乌里安娜·沃托维奇¹, 王涛（音译）¹, 雅各布·肯尼迪¹, 理查德·艾维¹, 陈伟林¹, 奥斯卡·D·莫里罗¹, 特拉维斯·D·洛伦岑¹, 马桑吉·蒂亚加拉扬², 西蒙娜·科兰托尼奥^三, 泰莎·W·卡塞雷斯^三, 朗达·R·罗伯茨^三, 约瑟夫·诺茨^三, 约书亚·J·雷丁^三, Jan A Kaczmarczyk先生^三, 克里斯托弗·理查德森^三, 桑德拉·加西亚-邦特利^三, 威廉·博西克^三, 斯蒂芬·休伊特⁴, 凯伦·默里⁵, Nhan道^5 6, 玛丽·布罗菲^5 6, 斯蒂芬·威尔兹^6 7, 余洪波^7 8, 塞缪尔·阿贾拉普^5 9, 艾米丽·博亚¹⁰, 塔拉·希尔特克¹⁰, 亨利·罗德里格斯¹⁰, 阿曼达·G·保罗维奇¹

附属机构

¹美国华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心临床研究部。
²美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究实验室。
^三癌症研究技术计划，抗体表征实验室，弗雷德里克国家癌症研究实验室，美国马里兰州弗雷德里克。
⁴美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心病理实验室实验病理实验室。
⁵退伍军人管理局（VA）合作研究项目，退伍军人管理局（VA）波士顿医疗保健系统（151MAV），牙买加平原，马萨诸塞州，美国。
⁶美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院医学系。
⁷美国马萨诸塞州牙买加平原退伍军人管理局（VA）波士顿医疗系统病理和实验室医学服务项目。
⁸哈佛医学院病理学系，美国马萨诸塞州波士顿。
⁹美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所医学部。
¹⁰美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症临床蛋白质组研究办公室。

PMID： 34858420
预防性维修识别码： PMC8632241号
内政部： 10.3389/fimmu.2021.765898

靶向质谱能够对临床生物样品中的免疫调节蛋白进行多重定量

杰弗里·怀特克等。前部免疫. 2021.

.2021年11月11日11:12:765898。

doi:10.3389/fimmu.2021.765898。 eCollection 2021年。

作者

附属机构

¹美国华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心临床研究部。
²美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究实验室。
^三癌症研究技术计划，抗体表征实验室，弗雷德里克国家癌症研究实验室，美国马里兰州弗雷德里克。
⁴美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心病理实验室实验病理实验室。
⁵退伍军人管理局（VA）合作研究项目，退伍军人管理局（VA）波士顿医疗保健系统（151MAV），牙买加平原，马萨诸塞州，美国。
⁶美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院医学系。
⁷美国马萨诸塞州牙买加平原退伍军人管理局（VA）波士顿医疗系统病理和实验室医学服务项目。
⁸哈佛医学院病理学系，美国马萨诸塞州波士顿。
⁹美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所医学部。
¹⁰美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症临床蛋白质组研究办公室。

PMID： 34858420
预防性维修识别码： PMC8632241号
内政部： 10.3389/fimmu.2021.765898

摘要

免疫疗法正在彻底改变癌症治疗，在一部分患者中产生持久的反应和潜在的治愈。然而，大多数肿瘤的反应率较低，3/4级毒性并不罕见，我们目前对肿瘤免疫生物学的理解尚不完整。虽然肿瘤微环境中的数百种免疫调节蛋白形成了抗肿瘤反应，但其中很少能被可靠地量化。为了满足这一需求，我们开发了一个多重靶向蛋白质组分析小组，该小组使用肽免疫亲和力富集结合多反应监测质谱法，靶向代表46种蛋白质的52个肽。我们验证了组织和血浆基质中的分析，其中性能优值显示超过3个数量级的动态范围，日间CV中位数为5.2%（组织）和21%（血浆）。临床生物样本的可行性研究表明，在冷冻组织中检测到48/52肽，在血浆中检测到38/52肽。这些分析结果作为研究团体的资源公开提供。

关键词：癌症；相关生物标志物；免疫-MRM；免疫治疗；质谱法。

版权所有©2021 Whiteaker、Lundeen、Zhao、Schoenherr、Burian、Huang、Voytovich、Wang、Kennedy、Ivey、Lin、Murillo、Lorentzen、Thiagarajan、Colantonio、Caceres、Roberts、Knotts、Reading、Kaczmarczyk、Richardson、Garcia-Buntley、Bocik、Hewitt、Murray、Do、Brophy、Wilz、Yu、Ajjarapu、Boja、Hiltke、Rodriguez和Paulovich。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
Immuno-MRM可实现高度复用的蛋白质定量。**（A）**免疫-MRM分析工作流程从从感兴趣的生物样品中产生蛋白裂解物开始。每个靶向肽序列特有的可裂解稳定同位素标记标准物以已知浓度加入样品中。蛋白质混合物通过酶消化（Lys-C和胰蛋白酶）转化为肽。与磁珠偶联的定制单克隆抗体用于富集内源性肽和标记的标准物。洗脱液通过多重反应监测质谱法进行分析，其中分析肽和内标物与监测跃迁的等效相对面积共存。通过对目标肽的分析物富集和质谱参数优化，实现了高灵敏度。通过对片段离子跃迁的最佳选择，保持了较高的特异性。**（B）**胰蛋白酶介导的肽释放是通过过夜酶消化细胞裂解物池中的蛋白质而产生的。将检测到的33种内源性肽的峰面积比（轻：重）归一化为最大时间点，并随时间绘制曲线。误差线是三个重复的标准偏差。**（C）**以组织基质为特征的分析性能优值。**（D）**血浆基质中特征分析的性能优值。CXCL10肽VEIIATMK的代表性响应曲线。测量每个浓度点，一式三份。R的分布²响应曲线的线性回归值。定量下限（LOQ）的分布，其中每个点是指由曲线上CV小于20%的最低点确定的浓度。可重复性的特征是三种浓度的内（日内）和间（日间）变异性的CV值分布，除了内源性肽的测定。每个点对应于在五天内以三种浓度（低（Lo）、中（Med）和高（Hi））测量的肽的平均%CV，一式三份（n=15，每种浓度一个肽）。内源性测量是指在5天内（n=25）测量的五个重复中，在LOQ以上检测到的内源性肽的日内和日间变化。稳定性显示了4种条件下与即时分析相比的%CV分布和相对百分比差异：（i）在4℃下储存8小时，（ii）在4°C下储存48小时，（iii）在两个冻融循环后，以及（iv）在-80℃下储存5周。对于方框图，线条显示中值，方框显示内部四分位数，胡须显示5-95%的数据。

图2
免疫-MRM分析显示在冷冻组织中检测到。**（A）**从11种肿瘤类型的110个肿瘤中获得冷冻组织。饼图中显示了每种类型的数量。**（B）**利用可用图像绘制肿瘤的脂肪、淋巴细胞、红细胞、基质和肿瘤细胞的相对分数（110张图像中有108张）。用HALO算法测定细胞的微观异质性。每个点代表一个单独的肿瘤。方框图显示中值（直线）、内四分位数（方框）和5-95%范围（垂直线）。**（C）**肽检测的分布以直方图的形式绘制，显示了110个冷冻肿瘤中LOQ以上检测到的肽数量。**（D）**热图显示在>50%的肿瘤标本中检测到高于LOQ的分析物的无监督聚类。对每个肽分析物的峰面积比（轻：重）进行标准化，并使用z评分进行聚类。**（E）**直方图显示免疫-MRM测定的蛋白质表达与RNAseq测定的mRNA转录水平的相关性（52）。中位数由虚线（0.559）表示。

图3
测定组织中检测的样品要求。预测组织数量减少的分析物数量由使用500μg蛋白质消化输入测量的信噪比确定。误差条显示95%的置信区间。

图4
血浆中蛋白质表达测定的实用性。**（A）**如饼图所示，采集了45名乳腺、结肠直肠或卵巢肿瘤患者的血浆样本。**（B）**肽检测的分布以直方图形式绘制，显示了使用100μL等分血浆作为输入的45份血浆中检测到的高于LOQ的肽数量。**（C）**热图显示在>50%的血浆样品中检测到的高于LOQ的分析物的无监督聚类。对每个肽分析物的峰面积比（轻：重）进行标准化，并使用z评分进行聚类。**（D）**显示组织和血浆样本均可用的患者蛋白质表达水平相关性的直方图。

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肿瘤免疫的泛癌蛋白质组学特征。
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参考文献

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1. Abdel-Wahab N，Shah M，Suarez-Almazor ME。癌症患者免疫检查点阻断相关的不良事件：病例报告的系统回顾。《公共科学图书馆·综合》（2016）11（7）：e0160221。doi:10.1371/journal.pone.0160221-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Perdigoto AL、Kluger H、Herold KC。免疫检查点抑制剂引起的不良事件。Curr Opin免疫学（2021）69:29–38。doi:10.1016/j.coi.2021.02.002-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Sharma P、Siddiqui BA、Anandhan S、Yadav SS、Subudhi SK、Gao J等。免疫检查点治疗的下一个十年。癌症发现（2021）11（4）：838–57。数字对象标识代码：10.1158/2159-8290立方厘米-20-1680-内政部-公共医学

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[9] Perdigoto AL、Kluger H、Herold KC。免疫检查点抑制剂引起的不良事件。Curr Opin免疫学（2021）69:29–38。doi:10.1016/j.coi.2021.02.002-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Perdigoto AL、Kluger H、Herold KC。免疫检查点抑制剂引起的不良事件。Curr Opin免疫学（2021）69:29–38。doi:10.1016/j.coi.2021.02.002-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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