Mapping the micro-proteome of the nuclear lamina and lamina-associated domains

doi:10.26508/lsa.202000774

.2021年3月23日；4（5）：e202000774。

doi:10.26508/lsa.202000774。 2021年5月印刷。

绘制核膜和膜相关结构域的微蛋白质组

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物化学系。
²美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院表观遗传学中心。
^三新加坡免疫学科学、技术和研究局医学生物学研究所发育和再生生物学实验室（A*STAR）。
⁴美国马里兰州巴尔的摩市约翰·霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学系。
⁵美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞生物学系。
⁶印度班加罗尔国家心理健康和神经科学研究所分子医学中心。
⁷印度班加罗尔国际科技园生物信息研究所。
⁸印度马尼帕省马尼帕高等教育学院（MAHE）。
⁹美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院病理学和肿瘤学系。
¹⁰美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物化学系kreddy4@jhmi.edu。
¹¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症研究所。

PMID： 33758005
预防性维修识别码： PMC8008952型
内政部： 10.26508/lsa.202000774

绘制核膜和膜相关结构域的微蛋白质组

王显荣（Xianrong Wong）等人。生命科学联盟. 2021.

.2021年3月23日；4（5）：e202000774。

doi:10.26508/lsa.202000774。 2021年5月印刷。

作者

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物化学系。
²美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院表观遗传学中心。
^三新加坡免疫学科学、技术和研究局医学生物学研究所发育和再生生物学实验室（A*STAR）。
⁴美国马里兰州巴尔的摩市约翰·霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学系。
⁵美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院细胞生物学系。
⁶印度班加罗尔国家心理健康和神经科学研究所分子医学中心。
⁷印度班加罗尔国际科技园生物信息研究所。
⁸印度马尼帕省马尼帕高等教育学院（MAHE）。
⁹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理与肿瘤系。
¹⁰美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物化学系kreddy4@jhmi.edu。
¹¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症研究所。

PMID： 33758005
预防性维修识别码： PMC8008952型
内政部： 10.26508/lsa.202000774

摘要

核纹层是由丝状物组成的蛋白质网络，通过将蛋白质和DNA的大结构域（即所谓的纹层相关结构域（lamina-associated domains，LAD））连接到细胞核的外围，提供结构和基因调节功能。LAD是哺乳动物基因组中的很大一部分，其部分被与核外周的联系所抑制。人们对LAD的发生和维持以及参与这些功能的蛋白质知之甚少。为了识别位于核外周并可能与LAD相互作用的蛋白质，我们采用了一种双分支方法。首先，我们对内核膜结合的LAP2β进行了相互作用组分析，以进一步表征核膜蛋白质组。为了实现这一点，我们利用了BioID系统，该系统以前已成功用于表征核纹层蛋白质组。其次，我们建立了一个系统，通过开发染色质导向的BioID系统来识别与LAD结合的蛋白质。我们将BioID系统与m6A-tracer系统结合，m6A-tracer系统与活细胞中的LAD结合，以鉴定LAD近端和核层蛋白。在结合这些数据集的过程中，我们进一步表征了核纹层的蛋白质网络，确定了推测的LAD近端蛋白质，并发现了一些似乎与两个微蛋白组都有界面的蛋白质。重要的是，本研究鉴定了几种对LAD功能至关重要的蛋白质，包括与H3K9甲基化相关的异染色质调节蛋白。

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数字

图1。 — **图1.研究核外围微行星的策略。**
**（A）**显示小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）核外周Lap2β（绿色）生物素化相互作用组的典型图像。**（B、C）**BirA*在细胞核内定位的图示。Dam LmnB1的Shield1稳定后，叶片相关结构域在GATCs处甲基化，从而招募BirA*mCherry m6A。（C）中的绿色阴影表示假定的生物素化半径，其中近端蛋白质上的可用赖氨酸将被BirA*修饰。**（D）**在没有DD-Dam LmnB1（顶行）、MEF中没有（中行）和存在（底行）屏蔽配体的情况下，显示BirA*-m6a示踪剂（红色）及其生物素化蛋白（绿色）的预期定位的代表性图像。**（E）**基于质谱的BioID叶片相关域微蛋白质组分析的实验工作流程。用外源生物素培养表达BirA*-LAP2β、BirA*-m6A-tracer、BirA*-m6A-tracer/DD-Dam-LMNB1+/-屏蔽配体的MEF细胞，然后提取细胞核，并使用生物素化位点鉴定技术（BioSITe）耦合液相色谱/串联质谱分析来鉴定生物素化蛋白。

**图S1。**
BirA*-Lap2b表达和核蛋白富集策略的验证。**（A）**Western blot显示2种不同暴露（15 s，8 min）下BirA-Lap2β水平的相对水平。绿色箭头表示BirA-Lap2β融合蛋白，其表达量为内源性Lap2？的1–2%。（抗体BD611000）**（B）**MEF中BirA-Lap2b驱动生物素化的流行率。对细胞进行Lamin B1（青色）、Bitoin（链霉亲和素488，绿色）和DNA（Hoechst）染色。>75%的细胞内核膜富含生物素化蛋白。内核膜浓缩程度低或无内核膜富集的细胞仍有生物素化信号，但主要位于线粒体（如左上角的上面板）。上部面板显示单元格的字段视图，下部面板显示单个单元格。**（C）**核浓缩去除内源性生物素化蛋白质（中图），同时保留层粘连成分（左图）。在方案制定策略（右侧面板）中，使用HRP-链霉亲和素对BirA*标记的拉明a提取物进行检测，包括有核提取和无核提取。（和+/-生物素）。在没有核提取的情况下，大多数检测到的蛋白质是内源性标记的线粒体蛋白质（右车道、生物素（+）和BirA*LmnA）。提取后，大多数蛋白质都是新的，对Lamin A标记具有特异性（BirA*LmnA与mCherry LmnA）。

图2。 — **图2.LAP2βBioID相互作用组。**
**（A）**BirA*-LAP2β与单独含有BirA*-m6A示踪剂的细胞的质谱身份的MS1水平定量比的重复运行图。**（B）**LAP2β相互作用组研究的生物素化程度分析。**（C）**LAP2β近端蛋白的基因集富集分析。**（D）**当前LAP2βBioID分析的文氏图和已发表的核纹层蛋白质组分析。

图3。 — **图3.层粘连相关结构域（LAD）微卫星组分析。**
**（A）**BirA*-m6A-tracer/DD-Dam-LMNB1正负屏蔽配体质谱特性的MS1级定量比值的重复运行图。**（B）**m6A-tracer BioID LAD蛋白质组的基因集富集分析。**（C）**发表的核膜蛋白质组分析的综合文氏图、我们当前的LAP2βBioID相互作用组分析和LAD-组分析。标记为*的蛋白质已被包括我们在内的多个小组验证。表1总结了实验和结果。标有**的蛋白质已经过内部生物信息学验证。注：并不是为了显示目的而显示这些重叠中的所有蛋白质。有关蛋白质的完整列表，请参见表S3。来自C57BL/6 3T3衍生WT MEF的数据。

**图4。**
Nup153与层粘连蛋白相互作用，但不与LAD相互作用（1区）。**（A）**日志₂LmnB1 DamID（蓝色）和Nup153 DamID的人成纤维细胞（hg19-build）chr 8的比率图以绿色显示（10，73）。**（B）**插图显示了具有Nup153结合位点的高度致密的层膜相关结构域（LAD）的放大视图。**（C）**显示Nup153分布相对于LAD的百分比（在基本覆盖范围内）的维恩图。**（D）**LmnB1剖面锚定在所有LAD-Nup153峰（在LAD内发现的13.7%）中心。折线图表示所有Nup153峰值的平均趋势。

**图5。**
MeCP2与LAD和层粘连蛋白（Zone2，LAD与层粘连之间的界面）相互作用。**（A）**日志₂LmnB1 DamID（黑色）、LaminA（蓝色）和Lap2βDamID的MEF（mm9构建）chr 12的比率图(*预打印*).（B）维恩图显示了Lamin A和Lap2β层相关结构域（LAD）之间的重叠程度。**（C）**日志₂人类成纤维细胞（hg19-build）chr 8的MeCP2占用率比率图（ChIP）为红色，LmnB1 DamID为黑色（10，70）。**（D）**维恩图显示了LAD中MeCP2域的百分比（以基覆盖率表示）和受MeCP2约束的LAD的百分比（在基覆盖率中）。**（E）**MeCP2剖面锚定在尺寸为100 kb或更大的LAD的所有边界上，并从LAD外部（左侧）指向LAD内部（右侧）。折线图表示所有边界剖面的平均趋势。

图S2。 — **图S2.全基因组Lamin A（蓝色）和Lap2β（绿色）DamID对数₂比率图。**

**图6。**
CBX1和SMCHD1在LAD上富集，但不与层粘连蛋白相互作用（3区，富集LAD）。**（A）**日志₂Lap2βDamID（绿色）、CBX1（也称为Hp1β，粉红色）和SMCHD1 DamID的MEF的比率图（71）。**（B）**Venn图显示CBX1占据的与薄层相关结构域（LAD）重叠的基因组结构域的百分比（以碱基覆盖率计）。**（C）**CBX1剖面锚定在尺寸为100 kb或更大的LAD的所有边界上，并从LAD外部（左侧）指向LAD内部（右侧）。折线图表示每个要素所有边界轮廓的平均趋势。**（D）**维恩图显示SMCHD1占据重叠LAD的基因组域的百分比（在碱基覆盖率中）。**（E）**SMCHD1剖面锚定在尺寸为100 kb或更大的LAD的所有边界上，并从LAD外部（左侧）指向LAD内部（右侧）。折线图表示每个要素所有边界轮廓的平均趋势。

图7。 — **图7：内核膜（INM）/层压板/层压板相关域（LAD）界面局部蛋白质组的假定模型。**
该模型根据本研究和以往研究的数据，将核外围划分为三个区域。1区距离染色质最远，包含不与LAD相互作用的蛋白质，例如核孔复合体、一些nesprin和LEM域蛋白质的调节器。然后，区域1过渡到区域2，区域2由穿过薄层/LAD界面的层粘连蛋白（灰色阴影）和跨膜蛋白（蓝绿色）组成。在这个区域，我们还发现了一组独特的染色质/DNA结合蛋白，它们显示了与INM/lamina网络和LAD（紫色和金色）的相互作用。尽管在我们的数据集中没有发现BANF，但基于大量体内和体外研究，证明其作为染色质和核膜之间的连接物的位置，BANF被包括在该区域中。因此，2区由层粘连支架、一些INM蛋白和DNA相互作用蛋白的特定子集组成，这些蛋白质可能促进LAD与核层粘连的相互作用。最后，区域3显示了在我们的屏幕中识别的LAD特异性蛋白质（红色）。它们富含染色质结合和修饰蛋白。

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1. Cockell M，Gasser SM（1999），核隔室和基因调控。当前操作基因开发9:199-205。10.1016/s0959-437x（99）80030-6-内政部-公共医学
1. Cremer T、Kreth G、Koester H、Fink RH、Heintzmann R、Cremer M、Solovei I、Zink D、Cremers C（2000）《染色体区域、染色体间域室和核基质：功能核结构的综合视图》。《真核生物基因实验评论》10:179-212。10.1615/critereveukargeneexpr.v10.2.60-内政部-公共医学
1. Misteli T（2007）《超越序列：基因组功能的细胞组织》。手机128:787–800。2016年10月10日/j.cell.2007.01.028-内政部-公共医学
1. Wong X，Lupercio TR，Reddy KL（2014）《净收益与损失：改变核膜蛋白质组在基因组调控中的作用》。Curr Opin细胞生物学28:105–120。10.1016/j.ceb.2014.04.005-内政部-公共医学
1. Dekker J，Marti-Renom MA，Mirny LA（2013）《探索基因组的三维组织：解释染色质相互作用数据》。Nat Rev Genet第14版：390–403页。10.1038/编号3454-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[6] Misteli T（2007）《超越序列：基因组功能的细胞组织》。手机128:787–800。2016年10月10日/j.cell.2007.01.028-内政部-公共医学

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[8] Wong X，Lupercio TR，Reddy KL（2014）《净收益与损失：改变核膜蛋白质组在基因组调控中的作用》。Curr Opin细胞生物学28:105–120。10.1016/j.ceb.2014.04.005-内政部-公共医学

[9] Dekker J，Marti-Renom MA，Mirny LA（2013）《探索基因组的三维组织：解释染色质相互作用数据》。Nat Rev Genet第14版：390–403页。10.1038/编号3454-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Dekker J，Marti-Renom MA，Mirny LA（2013）《探索基因组的三维组织：解释染色质相互作用数据》。Nat Rev Genet第14版：390–403页。10.1038/编号3454-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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