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.2020年3月26日；10(11):4871-4884.
doi:10.7150/thno.43539。 eCollection 2020。

辐射诱导的细胞外小泡作为“载体”促进肿瘤抗原释放并触发抗肿瘤免疫

万尊林 1, 徐燕燕 2, 陈小川 三, 刘军（Jun Liu） 4, 翁友良 1, 青羊庄 三, 林飞飞 三, 黄宗伟 三, 吴世宏 三, 丁建明 1, 龙晨 5, 邱显欣 6, 张璐蓉（Lurong Zhang） 7, 吴俊新 1, 多琳 8, 邱素芳 三 9
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辐射诱导的细胞外小泡作为“载体”促进肿瘤抗原释放并触发抗肿瘤免疫

万尊林等人。 治疗诊断科技. .

摘要

理论基础：越来越多的证据支持放射治疗在诱导抗肿瘤免疫中的重要性。细胞外小泡（sEVs）在肿瘤抗原的装载和传递中起着重要作用。然而，sEVs在辐射诱导抗肿瘤免疫中的作用尚不清楚。因此，确定sEV在辐射诱导免疫中的作用和调节机制非常重要。方法：照射肿瘤细胞（8 Gy），通过超速离心纯化sEVs。建立小鼠原发性肿瘤和实验性肺转移模型，评估sEVs免疫引发的抗肿瘤免疫。进行蛋白质组学和生物信息学分析，以识别辐射引起的sEV中的改变货物。根据主要组织相容性复合体（MHC）I结合和免疫原性，设计并合成sEV中上调蛋白的肽作为疫苗。结果：在这里，我们证明了来自辐照肿瘤细胞的sEV可以通过增强CD8来触发对原发性肿瘤和实验性肺转移的抗肿瘤免疫+和CD4+T细胞浸润。辐射也可能使sEV富含肿瘤抗原和热休克蛋白。此外，来自辐射诱导sEV的CUB域包含蛋白1（CDCP1）被鉴定为一种新的肿瘤相关抗原，并被开发为可产生抗肿瘤免疫反应的肽疫苗。结论：我们的结果表明，使用辐照肿瘤细胞分泌的sEVs是一种有效的肿瘤抗原传递和提呈途径，并突出了sEVs在辐射引发的抗肿瘤免疫中的作用。

关键词：绝对效应；抗肿瘤免疫；放射治疗；细胞外小泡；肿瘤相关抗原。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
细胞外小泡（sEVs）的特征。（A）通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量的粒度分布。（B）通过透射电子显微镜（TEM）揭示了sEV的形态。（C）特异性sEV表面标记的Western blot分析。
图2
图2
辐射诱导sEVs对原发性肿瘤和实验性肺转移的抗肿瘤免疫。（A）描述sEV纯化和免疫的实验方案。H22细胞和4T1细胞受到8Gy辐射，通过超速离心纯化来自8Gy辐照细胞（8Gy-sEVs）或未辐照细胞（0Gy-sEVs）的sEVs。每隔5天用每种类型的sEV 200μg免疫ICR和BALB/c小鼠四次，并注射肿瘤细胞进行攻击。（B）绿色荧光蛋白（GFP）阳性4T1细胞与淋巴细胞之间的细胞接触在荧光反向显微镜下成像。在4T1肿瘤细胞和淋巴细胞的共同培养中，4T1癌细胞被8 Gy-sEVs免疫小鼠的淋巴细胞紧密包围，尽管在0 Gy-sEVs免疫小鼠或对照组的淋巴细胞中没有观察到这种情况。以乳酸脱氢酶（LDH）释放量（n=4/组）来衡量杀灭效果。（C） 体内生物发光成像。免疫后，将GFP-荧光素酶4T1细胞静脉注射到BALB/c小鼠的尾静脉中。两周后，使用IVIS Lumina III测量4T1实验性肺转移瘤的生长体内成像系统。8 Gy-sEV免疫小鼠的荧光素酶信号低于对照组或0 Gy组（n=6/组）。（D）BALB/c小鼠经尾静脉静脉注射4T1细胞。用0 Gy-sEVs、8 Gy-sEVs免疫BALB/c小鼠，观察其存活率与对照组（n=10/组）的差异。（E）肺转移瘤的图像和苏木精伊红染色以及肺转移结节的统计分析（n=6/组）。（F-G）4T1乳腺癌细胞的原发肿瘤生长和生长曲线（n=6/组）。（H）实验结束时4T1乳腺癌细胞的肿瘤重量（n=6/组）。（一）H22肝癌细胞的原发肿瘤生长和生长曲线（n=6/组）。（J）实验结束时H22肝癌细胞的肿瘤重量（n=6/组）。P（P）-使用双尾Student t检验确定值(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
图3
图3
8 Gy-sEV免疫小鼠CD8和CD4细胞浸润.（A-C）采用抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）-抗小鼠CD3、抗小鼠CD8或异藻蓝蛋白（APC）-抗鼠CD4对BALB/c小鼠的淋巴结、脾脏和血液进行双重染色，并用流式细胞仪检测CD4和CD8。（D-F）实验结束时采集4T1肺转移瘤、4T1原发肿瘤和H22原发肿瘤，并用抗鼠CD8染色（放大200倍成像）。P（P）-使用双尾Student t检验确定值(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
图4
图4
辐射诱导sEV中改变货物的蛋白质组学和生物信息学分析。（A）散点图显示了146个差异表达蛋白在8 Gy-sEV和0 Gy-sev中的分布（fold-change>1.5和P（P）< 0.05). 红点表示上调蛋白，绿点表示下调蛋白。（B）京都基因和基因组百科全书（KEGG）差异表达蛋白质的通路分析。（C）癌症基因组图谱（TCGA）中各种癌症中上调蛋白的表达。颜色的强度表示log2折叠变化（肿瘤与正常）。Y轴显示蛋白质名称，X轴显示肿瘤类型，包括肺腺癌（LUAD）、肺鳞癌（LUSC）、肾肾透明细胞癌（KIRC）、结肠腺癌（COAD）、乳腺浸润癌（BRCA）、头颈部鳞癌（HNSC）、肾嫌色细胞（KICH）、胃腺癌（STAD）、，甲状腺癌（THCA）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、肾肾乳头状细胞癌（KIRP）、前列腺腺癌（PRAD）、肝细胞癌（LIHC）和食管癌（ESCA）。
图5
图5
sEVs中上调蛋白产生的肽触发抗肿瘤免疫。（A）合成了两种来源于CUB结构域蛋白1（CDCP1）的多肽。（B）实验设计。（C）流式细胞术(FCM）对CD8差异的分析+-干扰素γ+对照组（含弗氏佐剂的磷酸盐缓冲盐水（PBS））和肽组（含佛氏佐剂CDCP1肽；n=3/组）的T淋巴细胞。（D）对照组（PBS免疫4次，间隔5天）和肽组（200µg CDCP1肽免疫4次、间隔5天；n=6/组）的原发性4T1肿瘤大小。（E）对照组（PBS免疫4次，间隔5天）和肽处理组（200µg CDCP1肽免疫4次、间隔5天；n=6/组）的初级4T1肿瘤生长曲线。（F）原发性4T1肿瘤重量（n=6/组）。（G-H）实验性转移模型和体内对照组（PBS免疫4次，间隔5天）和肽组（200µg CDCP1肽免疫4次、间隔5天；n=6/组）的肺部成像。P（P）-使用双尾Student t检验确定值(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
图6
图6
热休克蛋白（HSP）70和HSP90在辐射增强sEV中的表达。（A）蛋白质组分析显示受照射4T1细胞sEV中HSP家族上调。（B）Western blot证实辐照4T1细胞sEV中Hsp70和Hsp90上调。
图7
图7
sEVs如何在辐射后实现抗肿瘤免疫的潜在机制。（A）实验设计。从小鼠股骨分离骨髓细胞，并用GM-CSF和IL-4刺激以分化DC。然后，用sEV刺激DC并与CD8共培养+T细胞。Western bolt用于分析CD8+T细胞中激活的信号。（B）检测CD11c+粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素（IL）-4刺激后通过流式细胞术检测树突状细胞。（C）DC吸收sEV。在用DC培养24小时之前，首先用PKH67染料对sEV进行染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。（D）面板说明了用于隔离CD8的选通策略+通过荧光激活细胞分类的T细胞亚群。（E）Western blot显示CD8中激活的信号+T细胞。
图8
图8
辐射诱导的sEV触发抗肿瘤免疫的机制。
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