Huntington's Disease Pathogenesis Is Modified In Vivo by Alfy/Wdfy3 and Selective Macroautophagy

doi:10.1016/j.neuron.2019.12.003

.2020年3月4日；105（5）：813-821.e6。

doi:10.1016/j.neuron.2019.12.003。 Epub 2019年12月30日。

Alfy/Wdfy3和选择性巨自噬在体内改变了亨廷顿病的发病机制

附属公司

¹美国纽约哥伦比亚大学神经科学系神经生物学与行为博士项目；美国纽约哥伦比亚大学神经病学系。
²美国纽约哥伦比亚大学神经病学系。
^三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院再生医学中心发育生物学系。
⁴美国纽约哥伦比亚大学病理生物学和分子医学研究生课程。
⁵美国纽约哥伦比亚大学神经科学系神经生物学与行为博士项目。
⁶田纳西大学生理学系，田纳西州孟菲斯，美国。
⁷美国纽约哥伦比亚大学神经科学系神经生物学与行为博士项目；美国纽约哥伦比亚大学神经内科；美国纽约哥伦比亚大学病理与细胞生物学系电子地址：ai.yamamoto@columbia.edu。

PMID： 31899071
预防性维修识别码：第7060123页
内政部： 2016年10月10日/j.neuron.2019.12.003

Alfy/Wdfy3和选择性巨自噬在体内改变了亨廷顿病的发病机制

Leora M福克斯等。神经元. 2020.

.2020年3月4日；105（5）：813-821.e6。

doi:10.1016/j.neuron.2019.12.003。 Epub 2019年12月30日。

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¹美国纽约哥伦比亚大学神经科学系神经生物学与行为博士项目；美国纽约哥伦比亚大学神经病学系。
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^三美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院再生医学中心发育生物学系。
⁴美国纽约哥伦比亚大学病理生物学和分子医学研究生课程。
⁵美国纽约哥伦比亚大学神经科学系神经生物学与行为博士项目。
⁶田纳西大学生理学系，田纳西州孟菲斯，美国。
⁷美国纽约哥伦比亚大学神经科学系神经生物学与行为博士项目；美国纽约哥伦比亚大学神经内科；美国纽约哥伦比亚大学病理与细胞生物学系电子地址：ai.yamamoto@columbia.edu。

PMID： 31899071
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摘要

尽管亨廷顿病（HD）是由HTT基因已知编码突变引起的常染色体显性遗传病，但具有类似三核苷酸重复突变的HD患者的发病年龄可能会有几十年的变化。一个可能的促成因素是患者的遗传异质性，这可能会改变他们对疾病的易感性。我们报告称，尽管自噬适配器蛋白Alfy/Wdfy3杂合性缺失对对照小鼠没有影响，但它显著加快了HD发病年龄和进展。Alfy在成人大脑中是必需的，用于自噬依赖性清除蛋白质沉淀物，其在小鼠和患者成纤维细胞衍生的神经元中的耗竭加速了这种病理特征的异常积累，这种病理特征在成人发病的神经退行性疾病中具有共性。这些发现表明，选择性破坏清除聚集蛋白的能力是致病的驱动因素，而选择性清除聚集蛋白可能会增强抗病性。

关键词：阿尔菲；亨廷顿病；Wdfy3；自噬；直接转换；老鼠；神经退行性变；患者成纤维细胞；蛋白病；选择性自噬。

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利益声明作者声明没有竞争利益。

数字

图1。 — **图1.清除成人大脑中聚集的mHtt需要Alfy**
**（A）**创建Alfy iKO小鼠的示意图。两轮繁殖产生了iKO小鼠，这些小鼠是条件Alfy等位基因（Alfy^{飞行/飞行})肌动蛋白杂合^{CreERTM公司}。实验组是通过使用这些iKO小鼠创建的，并交叉回Alfy^{液氧磷/液氧磷}老鼠。然后用veh或+tam处理后代。另请参见图S1。**（B）**车辆PCR基因分型与.+tam Alfy iKO小鼠。在7 m/o剂量下处理的11 m/o iKO小鼠的皮层（ctx）、小脑（cb）和纹状体（str）基因组DNA。通过PCR产物大小的变化检测到外显子5的C介导切除（477对410 bp）。n=3只小鼠/治疗组。**（C）** 现场在6 m/o Alfy iKO小鼠中最后注射后1周，使用与Alfy第5外显子互补的探针进行杂交。n=3只小鼠/治疗组。**（D-F）**11 m/o Alfy iKO小鼠的洗涤剂可溶性脑裂解物的Western blot分析**（D）**不同的大脑区域或**（E）**小鼠全脑裂解物，定量**（F）**n=3只小鼠/治疗组。**（G）**自吞噬体富集的组织分馏显示，在Alfy诱导缺失后的1年内，基础大自噬没有显著变化。显示大脑和肝脏的分馏。针对Alfy、p62、Tom20和LC3检测代表核后上清液（PNS）、细胞液（cytosol）和自噬空泡（AV）的组分。请注意，尽管阿尔菲（Alfy）去世，但p62缺乏积累。n=6-7只小鼠/基因型。**（H）**创造HDAlfy小鼠的遗传杂交和治疗方案的简略示意图。Alfy iKO和HD103Q小鼠相互杂交，引入六种必要的基因修饰，以创造繁殖者，最终形成HDAlfy小鼠。用+tam治疗HDAlfy小鼠，以修改Alfy水平和dox，以调节外显子1Htt103Q转基因的表达。另请参见图S1。**（一）**HDAlfy小鼠的治疗方案。给7m/o小鼠注射tam，然后在最后一次注射后一周用dox或对照溶液治疗长达4个月。在指定的时间点收集小鼠进行分析。**（J，K）**骨料清理需要Alfy。**（J）**治疗前和治疗后4个月HDAlfy纹状体EM48染色。将Dox治疗小鼠与缺乏Alfy（+tam+Dox）的HD基因抑制小鼠进行比较。**（K）**使用或不使用Alfy在dox后2和4个月对EM48阳性Htt矿床进行体视学评估。数据显示为7 m/o HDAlfy小鼠的百分比（无治疗）。方差分析显示Alfy（F(_1,20个)=7.032，p=0.0153），Alfy和dox治疗时间（F_(1,2)=4.001，p=0.0346）（n=4-5只小鼠/基因型/年龄）。尽管在2个月和4个月的dox治疗后，总负荷显著降低（2个月：F_(1,6)=8.632，p=0.0260；4个月：F_(1,8)=6.347，p=0.0358），删除Alfy阻碍了这一许可。

图2。 — **图2 Alfy杂合缺失加速了HD小鼠模型中聚集物的积累**
**（A）**创建BACHDAlfy小鼠和实验同窝小鼠，野生型（WT），AlfyHet和BACHD。（B） BACHD的代表性免疫印迹**（B）**和BACHDAlfy（BA）小鼠探测Htt（3B5H10）和Alfy。阿尔菲水平由右侧vinculin（vinc）校正。**（C-F）**耗尽Alfy会加速BACHD小鼠mHtt的积累。**（C、D）**针对12 m/o中EM48表位的免疫组织化学**（C）**皮质和**（D）**纹状体。黑色箭头表示细胞质和核周点状结构；白色箭头表示弥漫的细胞质或神经炎染色。比例尺=10 m。**（E、F）**皮层和纹状体中S830-阳性mHtt点状突起。**（E）**12米/盎司小鼠皮层中的S830-阳性结构。纹状体也有类似的结构（未显示）。**（F）**总负荷的体视量化。方差分析显示，与BACHD相比，BACHDAlfy大脑中的聚集体显著增加（皮质：F_(1,11)=15.920，p=0.0021；纹状体：F_(1,11)=9.058，p=0.0119），年龄无显著影响（皮层：F_(1,11)=0.242，p=0.6324；纹状体：F_(1,11)=0.520，p=0.4857）。数据显示为平均值±标准偏差。与聚集蛋白质不同，洗涤剂可溶性蛋白质不受影响（见图S2）。

图3： — **图3:。加速聚集与HD症状加速发作相关**
**（A）**从加速转盘上掉落的延迟。数据显示为平均值±SD。在男性和女性中，RM-ANOVA显示了基因型的显著总体影响（男性：F_(3,188)=88.171，p<0.0001；雌性：F_(3,171)=80.182，p<0.0001）和年龄（男性：F_(3,188)=6.768，p=0.0002；雌性：F_(3,171)=4.283，p=0.0061）。只有女性的基因型与年龄之间存在交互作用（F_(3,171)=3.017，p=0.0023）。Fisher PLSD显示，与BACHD相比，BACHDAlfy在所有年龄段的男性（3 m/o，p=0.0446；4 m/o，p=0.0097；5 m/o，p=0.0033；8 m/o，p=0.0119）和女性（4 m/o、p=0.0538；4 m/o，p=0.0006；5 m/o，p=0.0008；8 m/o，p=0.2809）表现明显较差。WT和AlfyHet小鼠之间没有发现显著差异（雄性：3 m/o，p=0.8627；4 m/o，p=0.8629；5 m/o，p=0.9630；8 m/o，p=0.7559；雌性：3 m/o，p=0.9556；4 m/o，p=0.7554；5 m/o，p=0.4554；8 m/o，p=0.6852）。**（B）**在露天竞技场上行驶的距离。数据显示为平均值±标准差。方差分析显示，9 m/o时，男性和女性的基因型总体影响显著（男性：F_（3,37）=3.660，p=0.0209；雌性：F_(3,43)=3.953，p=0.0141）和12 m/o（雄性：F_(3,39)=9.025，p=0.0001；雌性：F_(3,34)=6.724，p=0.0011）。Fisher’s PLSD证实，BACHD小鼠在12 m/o时出现运动障碍（9 m/o，p=0.1930；12 m/o p=0.0141），而BACHDAlfy在9 m/o时则出现运动障碍。相反，BACHD（9 m/o，p=0.0064；12 m/o p=0.0025）和BACHDAlfy雌性（9 m/o，p=0.0088；12 m/o p=0.0034）在这些年龄段都是低运动能力，彼此之间没有差异（9 m/o，p=0.7780；12 m/o p=0.9202）。WT和AlfyHet也无法区分（雄性：9 m/o，p=0.7136；12 m/o，p=0.5596；雌性：9 m/o，p=0.3830；12 m/o，p=0.8289）。**（C）**GFAP染色显示BACHDAlfy与BACHD相比具有广泛的反应性。比例尺=10μm，插入=25μm。图像代表了n=3-4只小鼠/基因型。另请参见图S3。

图4。 — **图4 ALFY缺失增加了直接从HD患者成纤维细胞重新编程的人类神经元内源性mHtt聚集**
**（A）**使用富含脑的microRNAs miR-9/9*−124，结合富含纹状体的因子，描绘了分离出的人类成纤维细胞转化为类似中等棘神经元（MSN）的细胞的示意图。重放后给予抗Alfy的shRNA（shALFY）或对照序列（shCTRL）。**（B）**诱导后第19天（PID）转化成纤维细胞的代表性图像，TUBB3免疫染色（绿色）和DAPI核染色（蓝色）。**（C-F）**mHtt内含物阳性MSN的百分比。用（C）shCTRL或（D）shALFY处理的HD-MSN在PID 19处用MW8抗体进行免疫染色。**（E）**与未受影响的患者成纤维细胞相比，mHtt包涵体阳性MSN的量化。数据显示为平均值±sem，带有单个数据点。方差分析显示shALFY（F_(5,12)=19.88，P<0.0001）。*后hoc*Tukey的测试比较结果表明。N=400个细胞/基因型/shRNA的平均值。（F）不同患者成纤维细胞系中mHtt包涵体阳性MSN百分比的量化。在每个成纤维细胞系中进行配对t检验。n=219-450个细胞/细胞系/shRNA.***，p<0.001；**，p<0.01；*，p＜0.05；n.s.=不重要。另请参见图S4。

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