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.2020年1月；4(1):69-83.
doi:10.1038/s41551-019-0485-1。 Epub 2019年12月16日。

通过细胞纳米孔化大规模生产功能性mRNA-encapsulated exosomes

杨兆刚 # 1 2, 史俊峰 # 1, Jing Xie（音译） 三, 王一凡 2, 孙景尧 1, 刘桐政 4, 赵亚荣（Yarong Zhao） 三, 赵秀婷 三, 王新美（Xinmei Wang） 1, 马一凡 1, 维西·马尔科克 1, Chiling Chiang（蒋志玲） 5, 伟业邓 2, 陈元新 6, 袁复 6, Kwang J Kwak先生 1, 亚敏范 1, 陈康 7, 长城尹 8, 朱·李 9, 保罗·贝塔尼 10, 何塞·奥特罗 11, 吴璐 10, Kyuson Yun（昆森·云） 12, 安德鲁·S·李 9 13, 温江 2, 乐生腾 14, 贝蒂·Y·S·金 15 16, L詹姆斯·李 17
附属公司

通过细胞纳米孔化大规模生产功能性mRNA-encapsulated exosomes

杨兆刚等人。 国家生物工程. 2020年1月.

勘误表in

  • 作者更正：通过细胞纳米穿孔大规模生成功能性mRNA-encapsulated exosomes。
    Yang Z、Shi J、Xie J、Wang Y、Sun J、Liu T、Zhao Y、ZhaoX、Wang X、Ma Y、Malkoc V、Chiang C、Deng W、Chen Y、Fu Y、Kwak KJ、Fan Y、Kang C、Yin C、Rhee J、Bertani P、Otero J、Lu W、Yun K、Lee AS、Jiang W、Teng L、Kim BYS、Lee LJ。 Yang Z等。 Nat Biomed Eng.2021年8月；5(8):944-945. doi:10.1038/S4151-021-00725-w。 Nat Biomed工程。2021。 PMID：34131325

摘要

外显子作为核酸载体具有吸引力，因为它们具有良好的药代动力学和免疫学特性，并且能够穿透合成药物运载工具无法渗透的生理屏障。然而，将外源核酸，特别是大信使RNA插入细胞分泌的外泌体会导致低产量。在这里，我们报道了一种用于生产大量含有治疗性mRNA和靶向肽的外泌体的细胞无孔化方法。我们用质粒DNA转染各种源细胞，并用局部和瞬态电刺激刺激细胞，以促进携带转录mRNA和靶向肽的外泌体的释放。与体电穿孔和其他外泌体产生策略相比，细胞纳米穿孔产生的外泌体量增加了50倍，超过10倍三-外体mRNA转录物的倍数增加，即使是外体分泌基本水平较低的细胞。在原位磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）缺乏的胶质瘤小鼠模型中，含有mRNA的外泌体恢复了肿瘤抑制功能，增强了对肿瘤生长的抑制并提高了生存率。细胞纳米蒸发可以使外泌体能够用作需要转录操纵的应用的通用核酸载体。

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数字

图1|
图1|。CNP产生大量细胞外小泡（EV），其中含有转录的mRNA。
一CNP生成EV用于靶向核酸递送的示意图。左：CNP系统由一个纳米通道阵列（红色矩形）组成，每个通道的直径为500纳米（顶部插图）。缓冲液中添加的DNA质粒在瞬态电脉冲下通过纳米通道进入附着的细胞。附着的细胞随后释放出大量包含转录mRNA的外泌体，可通过血脑屏障（BBB）和血脑肿瘤屏障（BBTB）收集用于肿瘤靶向递送（右）。b条PBS缓冲液（PBS）中未经处理的MEF产生的每细胞EV数，用脂质体2000（Lipo）转染的Ascl1/Brn2/Myt1l（A/B/M）质粒处理后的MEF，体电穿孔（BEP），细胞纳米电穿孔（CNP），以及只有PBS缓冲物的CNP（CNP/PBS）。cCNP释放EV与传统应激诱导EV释放方法的比较，包括饥饿、缺氧和热处理。饥饿：MEF细胞在无FBS的DEMEM中培养；低氧：MEF细胞在1%氧气的缺氧室中培养2/5%一氧化碳237°C增湿环境下；加热：MEF细胞在42℃培养2h，然后在正常细胞培养条件下转移到37℃。d日不同治疗组（包括PBS、Lipo、BEP、CNP和CNP/PBS组）中小鼠骨髓源性树突状细胞（BMDCs）产生的每细胞EV数。e（电子）CNP转染MEF的外显子释放在CNP后8小时左右达到峰值。（f）用CNP在0到220V的不同电压下对MEF中的外显子浓度进行DLS测量。结果表明，当电压从200到220V时，外显子数量不会增加。克对CNP后从EV中收集的EV-mRNAs进行琼脂糖凝胶分析。CNP/PBS：从10个细胞中获得的总RNA7仅使用PBS缓冲区的CNP后MEF；PTEN公司mRNA：合成200 ngPTEN公司mRNA；CNP/PTEN：从10个7带PTEN质粒的CNP后MEF。小时A、B和M mRNA的qPCR揭示了由CNP产生的外泌体比由其他方法产生的外泌体含有大量转录的mRNA。我对来自CNP转染MEF的EV A、B和M mRNA的qPCR（在培养基中每隔4h更换一次，持续24h）表明，最大的转录物需要最长的时间才能达到峰值浓度。所有数据均来自三个独立的实验，并以平均值±标准误差表示，进行双侧Student t检验进行比较(b、 c、d、f、h).
图2|
图2|。CNP转染后，外显体而非微泡（MV）含有功能转录的mRNA。
一Western blot检测等量（20μg蛋白）的外显体和MV外显体标记物（CD9、CD63和Tsg101）和MV标记物（Arf6）。b条外泌体中包裹的RNA数量与108通过Nanodrop测量，CNP转染MEF，表明大多数RNA包含在外泌体中，而不是MV中。cPBS组（PBS）和CNP组（CNP）的外泌体的冷冻TEM图像显示，这两组外泌物的外观没有差异，但CNP组的外泌物含有较高的RNA含量。d日对外显体和MV中A、B和M mRNA的qPCR分析表明，大多数转录的mRNA都包含在外显体中。e（电子）.体外从CNP转染MEF分泌的外显体和MV中提取的mRNA的蛋白质翻译。（f）CNP组和S-CNP组TLN分析的典型TIRF图像显示，S-CNP可以优化不同mRNA加载到单个外显体中。绿点：Ascl1公司mRNA，红点：溴化氮mRNA，紫色圆点：我的1lmRNA，粉红色箭头：带1 mRNA的外泌体，绿松石色箭头：带2 mRNA的内泌体；黄色箭头：带3 mRNA的外泌体。克CNP组和S-CNP组中具有不同RNA的外显子的百分比。每组选择100张图像进行统计分析。所有其他数据均来自三个独立的实验，以平均值±标准误差表示，进行了双侧Student t检验进行比较(b、 d日).
图3|
图3|。CNP诱导多泡体（MVB）形成。
一外荧光图像显示，在CNP/PBS刺激下，MEF中细胞内小泡形成增加，如PKH26染料的红色荧光点所测。b条与BEP相比，CNP/PBS蒸发的MEFs（CNP）增加了含有CD63-GFP的多泡体（MVB）的数量。插图：3D强度剖面图，其中峰值代表图像中的亮点，指示活动MVB形成。c有或无CNP/PBS刺激的MEF的透射电子显微镜（TEM）图像包含不同数量的MVB和间质小泡（ILV）。MVB的量化(d日)和ILV(e（电子）)在有或无CNP/PBS刺激的MEF中。每组20张TEM图像，进行双侧Student t检验进行比较。（f）Western blot显示，CNP后与外体生物发生相关的蛋白质增加。
图4|
图4|。CNP诱导的胞外体分泌与钙2+CNP后的离子流入
一用PBS缓冲液测量BEP-和CNP-孔MEF中碘化丙啶（PI）在膜孔中扩散的纵向荧光强度。细胞附着表面（顶部插入物）PI强度的快速增加表明形成了一系列大孔，而对侧细胞表面（底部插入物）的PI增加较慢，表明形成了较小的孔。BEP-porated MEF显示PI强度中度增加。b条CNP后细胞的荧光图像显示，转染后1至2分钟，CNP期间形成的膜孔闭合。PI在CNP后的指定时间点应用于单元格。c.细胞荧光强度测量进一步证实CNP后2分钟内膜孔闭合。n=每组20个细胞。d日CNP后不同钙离子浓度下MEF产生的每个细胞外显子数。e（电子）.缓冲液中不同钙离子浓度下CNP后的细胞内钙离子浓度。（f）CNP后胞外体释放与细胞内钙离子浓度的相关性。克在钙螯合剂EGTA存在下CNP后，MEF在不同钙离子浓度下产生的每个细胞的外显子数。小时在含有EGTA的缓冲液中，在不同钙离子浓度下，CNP后细胞内的钙离子浓度。我在有EGTA存在的情况下，CNP后胞外体释放与细胞内钙离子浓度的相关性。所有其他数据均来自三个独立的实验，以平均值±标准误差表示，进行了双侧Student t检验进行比较(d、 e、g、h).
图5|
图5|。CNP通过HSP-P53-TASP6信号通路增加外体释放。
一.模拟5个选定位置的温度变化。200 V和10 ms脉冲在功率密度为~1×10的纳米通道出口中产生了局部“热点”14宽/米三与环境温度相比，峰值温度高达60°C。脉冲结束后，由于纳米通道内的加热流体体积极小（V），“热点”迅速消失纳米通道≈ 1 × 10−12厘米三)与纳米通道外的本体溶液相比（V大量的≈0.1厘米三).b条.连接到CNP设备表面的MEF（绿色）的自顶向下图像。在CNP转染之前（0s），红点显示纳米通道位置和室温。CNP电脉冲（CNP）使纳米通道/细胞表面界面的温度急剧升高。c纳米通道的横截面图显示了CNP脉冲之前（0s）、期间和之后（1s）纳米通道内的温度变化。d日.电池-阳极通道界面的温度瞬时（<1s）增加至~60°C。e（电子）未处理（PBS）和CNP/PBS刺激（CNP）MEF中HSP90和HSP70的Western blot。（f）.外体浓度为10的动态光散射（DLS）测量8含或不含HSP抑制剂的CNP刺激MEF表明HSP70和HSP90对外泌体的产生至关重要。NVPHSP990:HSP90抑制剂；VER155008:HSP70抑制剂。克Western blot结果显示，CNP增加了P53 WT MEF中P53和TSAP6蛋白的表达，但不影响P53−/−MEFs中P53或TSAP6蛋白质的表达。小时外显子浓度的动态光散射（DLS）测量表明，敲除P53可以部分阻断CNP后外显子的释放。我CNP如何在CNP转染细胞中触发外显子释放的拟议机制示意图。数据来自三个独立实验，以平均值±标准误差表示。为了进行比较，进行了双侧学生t检验。
图6|
图6|。体外用于小鼠基因治疗和免疫原性评估的CNP生成外泌体的研究。
一克隆到CD47跨膜蛋白N末端的GBM靶向肽的示意图。b条外泌体下拉实验的Western blots显示，FLAG珠可以下拉克隆的N端FLAG-CD47，表明CD47的N端位于外泌体内。c胶质瘤（GL261）细胞对CNP生成的外泌体的摄取增加，外泌体包被与CD47相连的脑肿瘤靶向肽。外泌体：未涂层外泌物。Exo-T：由转染CREKA-CD47质粒的CNP刺激BMDCs产生的外显体。d日流式细胞术检测GL261摄取PKH26标记的Exo-T的荧光强度，进一步证实Exo-T在GL261细胞中的摄取最佳。e（电子）PBS、外来体或外来T处理后24小时GL261细胞中PTEN染色的代表性共聚焦显微镜图像。（f）流式细胞术检测GL261与外泌体孵育24小时后PTEN染色的荧光强度，表明外泌T组PTEN蛋白表达较强。克PKH26标记的Exo-T囊泡（红色）与不同内吞标记物（绿色）共定位的代表性免疫染色图像。结果表明，大多数Exo-T与A488-Tf共定位，表明Exo-T主要通过依赖于网格蛋白的内吞作用被摄取。A488-Tf：氯菊酯依赖性内吞标记物；A488-CT-B：小泡依赖性内吞标记物；FITC-右旋糖酐：大胞饮标记物。小时流式细胞术检测GL261在不同抑制条件下摄取PKH26标记的Exo-T的荧光强度，进一步证实Exo-T主要通过氯氰菊酯依赖的内吞作用摄取。蔗糖：氯菊酯依赖性内吞抑制剂；Filipin：Caveolae依赖性内吞抑制剂；和Wortinin：大胞饮抑制剂。我经空脂质体胺（E-Lipo）、exosome和Exo-T处理的GL261细胞活性表明Exo-T具有良好的生物相容性。j个.GL261细胞活力通过脂质体、exosome和包含Exo-T的PTEN公司mRNA。k.小鼠全身注射PKH26标记的外泌体的循环半衰期。CD47蛋白的过度表达大大延长了外泌体的循环半衰期，这不受CREKA肽插入的影响。外显子C：来自CNP/CD47质粒转染BMDCs的外显子体。Exo-T：来自CNP/CREKA-CD47质粒转染BMDC的外显子。插图：证实转染CREKA-CD47质粒的BMDCs外显子中CD47蛋白的表达。我.AST、ALT、肌酐、BUN、IL6和TNFα水平通过ELISA测定，并给药不同剂量的CREKA-CD47靶向外泌体（Exo-T）。所有数据均来自三个独立的实验，并以平均值±标准误差表示，进行双边Student t检验进行比较(d、 f、h、i、j、k、l).
图7|
图7|。体内CNP生成的外泌体对U87原位胶质瘤模型的治疗效果。
一.体内成像显示裸鼠原位移植U87肿瘤中PKH-26标记的Exo-T优先聚集。活体荧光显微镜也证实了Exo-T在脑瘤中的靶向递送(b条)这表明，与未涂层外显体（外显体）或TurboFect纳米颗粒（Turbo）相比，外显T在肿瘤基质中的积累显著增加。c量化不同时间点肿瘤部位的胞外体强度。每只动物10张图片，每组3只小鼠。d日,e（电子）组织分布分析表明，Exo-T表现出增加的脑靶向性，肝和脾蓄积量较低。f、 克PBS抑制肿瘤生长，PTEN公司含有外显体（exosome）、外显T、空外显T（E-Exo-T）或通过尾静脉注射治疗的TurboFect纳米颗粒（Turbo）的mRNA。n=每组3只小鼠。小时.PTEN公司mRNA Exo-T延长了U87胶质瘤小鼠的生存期（p<0.001，Bonferroni校正后的Log-rank检验）。每组n=8只小鼠。我对不同处理的残留GBM肿瘤组织进行PTEN、Ki67和H&E染色显示，Exo-T恢复了肿瘤组织中PTEN的表达并抑制了细胞增殖。j个.ImageJ软件对IHC图像进行Ki67强度测量。k.ImageJ软件对IHC图像进行PTEN强度测量。除非另有说明，否则数据来自三个独立实验，并以平均值±标准差表示。所有数据来自三项独立实验，均以平均值？标准差表示，进行双边Student t检验进行比较(c、 e、g、h、j、k).
图8|
图8|。体内CNP产生的外泌体在GL261原位神经胶质瘤模型中的治疗效果。
一.体内成像显示PKH-26标记的Exo-T在C57BL/6小鼠原位移植GL261肿瘤中优先积聚。活体荧光显微镜也证实了Exo-T在脑瘤中的靶向递送(b条)这表明，与未涂层外泌体（外泌物体）或PEG-脂质体纳米粒（脂质体）相比，外泌T在肿瘤基质中的积累显著增加。c量化不同时间点肿瘤部位的胞外体强度。d日正常组织区和肿瘤区内与PHK26结合的PBS（顶行）和Exo-T（底行）的分布；比例尺：500μm。e（电子）,（f）组织分布分析表明，Exo-T表现出增加的脑靶向性，肝和脾蓄积量较低。克/小时PBS抑制肿瘤生长，PTEN公司通过尾静脉注射含有外显体（exosome）、外显T、空外显T（E-Exo-T）或聚乙二醇脂质体纳米粒（脂质体）的mRNA。n=每组3只小鼠。我.PTEN公司mRNA Exo-T延长了GL261胶质瘤小鼠的生存期（p<0.001，Bonferroni校正后的Log-rank检验）。n=每组8只小鼠。j、 k个.蛋白质斑点(j个)和qPCR(k)在GBM肿瘤中，PTEN蛋白和mRNA水平分别降低，提示在PTEN公司-无GL261 GBM肿瘤。n=每组3只小鼠。我不同处理后残留GBM肿瘤组织的PTEN、Ki67和H&E染色显示Exo-T可恢复PTEN公司表达并抑制肿瘤组织中的细胞增殖。米.ImageJ软件对IHC图像进行Ki67强度测量。n个.ImageJ软件对IHC图像进行PTEN强度测量。除非另有说明，否则数据来自三个独立实验，并以平均值±标准误差表示。为了进行比较，进行了双侧学生t检验(c、 f、h、i、k、m、n).
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中的注释

  • 功能性细胞外小泡丰富。
    Zickler AM，El Andaloussi S.公司。 Zickler AM等人。 Nat Biomed Eng.2020年1月；4(1):9-11. doi:10.1038/s41551-019-0507-z。 《Nat Biomed Eng.2020》。 PMID：31937938 没有可用的摘要。

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