Ubiquitin-specific protease 3 promotes cell migration and invasion by interacting with and deubiquitinating SUZ12 in gastric cancer

doi:10.1186/s13046-019-1270-4

.2019年6月24日；38(1):277.

doi:10.1186/s13046-019-1270-4。

泛素特异性蛋白酶3通过与SUZ12相互作用和去泛素化促进胃癌细胞迁移和侵袭

吴晓生¹, 刘梦伟¹, 朱慧琼¹, 王静（音译）¹, 魏玉岱¹, 李嘉英¹, 朱丹平², 维美汤¹, 益智笑¹, 林剑娇^三, 张文静⁴, 孙勇（音）¹, 张毅（音）¹, 陈亚英⁵, 李国欣⁶, 李爱民¹, 李翔^7 8, 刘翔（Side Liu）^9 10 11, 王继德^12 13 14

附属公司

¹广东省胃肠病学重点实验室，南方医科大学南方医院消化科，广州，510515，中国。
²中国广州南方剧院总医院临床实验室，510010。
^三中国深圳市龙岗区人民医院消化科，邮编518172。
⁴昆明科技大学医学院云南省第一人民医院肿瘤内科，昆明，650032。
⁵广州医科大学附属第三医院消化科，广州，510150，中国。
⁶南方医科大学南方医院普外科，广州，510515，中国。
⁷中国深圳市龙岗区人民医院消化科，邮编518172。shellyxiang@sina.com。
⁸中国广东省广州市南方医科大学南方医院消化内科，510515。shellyxiang@sina.com。
⁹广东省胃肠病学重点实验室，南方医科大学南方医院消化科，广州，510515，中国。liuside@163.com。
¹⁰中国深圳市龙岗区人民医院消化科，邮编518172。liuside@163.com。
¹¹中国广东省广州市南方医科大学南方医院消化内科，510515。liuside@163.com。
¹²南方医科大学南方医院消化内科广东省消化内科重点实验室，广州，510515。jidewang55@163.com。
¹³中国深圳市龙岗区人民医院消化科，邮编518172。jidewang55@163.com。
¹⁴中国广东省广州市南方医科大学南方医院消化内科，510515。jidewang55@163.com。

PMID： 31234902
预防性维修识别码： PMC6591922型
内政部： 10.1186/s13046-019-1270-4

泛素特异性蛋白酶3通过与SUZ12相互作用和去泛素化促进胃癌细胞迁移和侵袭

吴晓生等。实验临床癌症研究杂志. 2019.

.2019年6月24日；38(1):277.

doi:10.1186/s13046-019-1270-4。

作者

吴晓生¹, 刘梦伟¹, 朱慧琼¹, 王静（音译）¹, 魏玉岱¹, 李嘉英¹, 朱丹平², 维美汤¹, 肖一智¹, 林剑娇^三, 张文静⁴, 孙勇（音）¹, 张毅（音）¹, 陈亚英⁵, 李国欣⁶, 李爱民¹, 李翔^7 8, 刘翔（Side Liu）^9 10 11, 王继德^12 13 14

附属公司

¹广东省胃肠病学重点实验室，南方医科大学南方医院消化科，广州，510515，中国。
²中国广州南方剧院总医院临床实验室，510010。
^三中国深圳市龙岗区人民医院消化内科，518172。
⁴昆明科技大学医学院云南省第一人民医院肿瘤内科，昆明，650032。
⁵广州医科大学附属第三医院消化科，广州，510150，中国。
⁶南方医科大学南方医院普外科，广州，510515，中国。
⁷中国深圳市龙岗区人民医院消化内科，518172。shellyxiang@sina.com。
⁸中国广东省广州市南方医科大学南方医院消化内科，510515。shellyxiang@sina.com。
⁹广东省胃肠病学重点实验室，南方医科大学南方医院消化科，广州，510515，中国。liuside@163.com。
¹⁰中国深圳市龙岗区人民医院消化科，邮编518172。liuside@163.com。
¹¹中国广东省广州市南方医科大学南方医院消化内科，510515。liuside@163.com。
¹²广东省胃肠病学重点实验室，南方医科大学南方医院消化科，广州，510515，中国。jidewang55@163.com。
¹³中国深圳市龙岗区人民医院消化科，邮编518172。jidewang55@163.com。
¹⁴中国广东省广州市南方医科大学南方医院消化内科，510515。jidewang55@163.com。

PMID： 31234902
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内政部： 10.1186/s13046-019-1270-4

摘要

背景：泛素特异性蛋白酶3（USP3）在许多生物过程中起着至关重要的作用。USP3的异常表达可能在肿瘤发展中起重要作用。然而，USP3促进胃癌（GC）转移的机制尚不清楚。

方法：利用蛋白质组学、RT-PCR、western blotting、免疫组织化学、免疫荧光、细胞侵袭和迁移分析以及异种移植瘤模型，研究了USP3在体内外对GC进展的影响以及潜在的潜在机制。

结果：与匹配的正常组织相比，GC中USP3的表达上调，预示着不良生存。USP3还促进GC细胞的迁移和上皮-间充质转化（EMT）。此外，TGF-β1诱导USP3表达，USP3敲除抑制TGF-α1诱导的EMT。此外，我们使用等压标签进行相对和绝对定量（iTRAQ），以识别USP3过度表达细胞与对照细胞中差异表达的蛋白质。重要的是，我们发现SUZ12对于USP3介导的GC致癌活性必不可少。我们观察到USP3通过氘化作用与SUZ12相互作用并稳定SUZ12。SUZ12敲除抑制USP3诱导的迁移和侵袭，以及GC细胞中的EMT。临床样本检查证实USP3表达与SUZ12蛋白表达呈正相关，USP3或SUZ12蛋白质水平与E-钙粘蛋白水平呈负相关。

结论：这些发现确定USP3是一个关键的调节器。USP3-SUZ12轴可能促进肿瘤进展，并可能成为人类GC的潜在治疗候选。

关键词：EMT；胃癌；SUZ12；USP3；iTRAQ公司。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
胃癌中USP3的表达与预后不良有关。一人类GC组织和邻近非肿瘤组织中USP3水平的Western blot分析。USP3的表达水平归一化为GAPDH的表达水平。b条通过实时定量RT-PCR检测永生化胃粘膜细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS、BGC-823、MGC-803、HGC-27、MKN28和SGC7901中USP3 mRNA的表达。实验进行得很复杂。*，第页 > 0.05; ****,第页 < 0.001.c（c）通过TMA分析检测87个正常或癌性胃组织样本中USP3的表达。d日根据IHC分析，GC组织中USP3的表达水平显著高于相应的相邻非肿瘤组织****第页 < 0.001之间。**e（电子）**所有患者总生存率的Kaplan-Meier生存分析(**e（电子）**)根据USP3的表达。使用对数秩检验计算第页值。比例尺，200μm in C

图2
USP3的过度表达促进GC细胞的侵袭和转移能力。一载体转染GC细胞与USP3细胞侵袭潜能的比较。b条& (**c（c）**)MGC-803和BGC-823细胞创伤愈合试验的代表性图像。d日& (**e（电子）**)RNA干扰（RNAi）对人类GC细胞系USP3基因mRNA表达和侵袭迁移潜能的影响。**（f）**相控显微镜下观察稳定转染载体或USP3的混合细胞的形态。克用细胞免疫荧光法检测BGC-823细胞中E-cadherin和Vimentin的表达。小时通过Western blot检测载体或USP3转染细胞中上皮标记物和间充质标记物的表达。GAPDH被用作负荷控制。比例尺代表50μm in(**（f）**)和20μm英寸(克)

图3
USP3促进EMT和体内转移。一BCG-823细胞原位移植小鼠的体外全身荧光图像(n个 = 每组3人）。肺转移部位的代表性图像如图所示。b条计算肺部转移位点的数量。**c（c）**转移癌组织用H&E染色。d日通过qRT-PCR测定BCG-823细胞来源的肿瘤中E-cadherin阳性表达，*P（P）* < 0.001之间。**e（电子）**IHC检测E-cadherin在GC肺转移灶中的表达。标尺，100μm inc（c）和**e（电子）**

图4
USP3可影响GC细胞中SUZ12蛋白的表达。一使用三种独立的siRNA的USP3的过表达或USP3的敲除不影响GC细胞中的SUZ12mRNA水平。*，*P（P）* > 0.05.b条越来越多的USP3被转染到GC细胞中，并通过Western blot检测SUZ12的表达。***，*P（P）* < 0.01; ****, P<0.001。**c（c）**通过将三种独立的siRNA转染细胞48 h，实现USP3的敲除。通过Western blot检测USP3和SUZ12的表达。d日用共焦显微镜观察GC细胞中USP3和SUZ12的双重染色，细胞核用Hoechst 33258复染。比例尺代表20μm

图5
USP3稳定SUZ12。一将标记的USP3质粒转染到GC细胞中。用抗旗帜抗体进行免疫沉淀，以免疫前正常小鼠免疫球蛋白G（nm IgG）作为对照。用抗Myc（SUZ12）抗体进行Western blot分析。b条用抗USP3抗体或对照抗体正常兔免疫球蛋白G（nr-IgG）免疫沉淀GC细胞的细胞裂解物。用抗SUZ12抗体进行Western blotting。所有实验重复3次，得到了类似的结果。**c（c）**将Flag-USP3转染BCG-823细胞。在用环己酰亚胺（CHX；50 mg/mL）处理细胞达到指定的时间间隔后，使用指定的抗体通过western blot（up）检测SUZ12和USP3的表达。通过密度测定法（向下）量化每个时间点内源性SUZ12表达的强度。d日将USP3或载体转染BCG-823细胞48h。细胞经10mmol/L MG132处理或不处理6h后，用抗SUZ12抗体免疫沉淀SUZ12，并用抗泛素免疫印迹法检测SUZ12的多泛素化。IP：免疫沉淀；Wb：蛋白印迹。**e（电子）**将scr或USP3 siRNA转染到BCG-823细胞中48 h，然后用或不用10 mmol/L MG132处理细胞6 h。用抗SUZ12抗体免疫沉淀提取物，并用抗泛素的Western blot检测SUZ12的多泛素化。实验重复了三次，并显示了具有代表性的斑点图像

图6
SUZ12参与USP3诱导的GC细胞迁移和侵袭。一使用Western blot分析检测用USP3过表达质粒转染的GC细胞中SUZ12的表达水平。随后转染SUZ12 siRNA1或Scr siRNA。b条转染USP3 SUZ12 siRNA1或USP3 scr siRNA的融合AGS单层在转染后72小时被刮伤。在伤口形成72小时后拍摄照片。****，P<0.001，USP3 scr siRNA与USP3 SUZ12 siRNA1。**c（c）**通过Matrigel侵袭室评估USP3 SUZ12 siRNA1或USP3 Scr siRNA在GC细胞中的细胞侵袭。计数GC细胞中侵袭细胞的数量。显示的所有值均为三次测量的平均值±SD，重复三次，结果相似。****，*P（P）*<0.001，USP3 Scr siRNA与USP3 SUZ12 siRNA1。d日相控显微镜观察USP3 SUZ12 siRNA1或USP3 Scr siRNA细胞的形态。**e（电子）**显示了淋巴结转移癌组织中USP3和SUZ12表达的典型IHC图像。**（f）**通过Western blot分析检测到，在USP3过度表达细胞中敲除SUZ12抑制AKT/ERK/EMT信号通路。标尺，50μm ind日和200μm英寸**e（电子）**

图7
USP3、SUZ12和E-cadherin蛋白在GC细胞和GC组织中的表达相关。一Western blot分析检测USP3和SUZ12在GC细胞中的表达。Spearman对GC细胞中USP3和SUZ12蛋白水平的相关性分析。b条采用IHC法检测10例正常和癌变胃组织中USP3、SUZ12和E-cadherin的表达水平。**c（c）**& (d日)采用Spearman相关分析确定SUZ12和USP3之间的关系(**c（c）**)SUZ12和E-cadherin之间(d日)USP3和E-cadherin之间(d日)正常和癌变胃组织中的蛋白表达。比例尺，50μm in B

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参考文献

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[2] Balakrishnan M、George R、Sharma A和Graham DY。全球胃癌的变化趋势。目前的肠胃病报告。2017;19(8):36. doi:10.1007/s11894-017-0575-8。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Huang T，Zhou Y，Cheng AS，Yu J，To KF，Kang W.胃癌和其他胃肠道肿瘤中的NOTCH受体：致癌基因还是抑癌基因？摩尔癌症。2016;15(1):80. doi:10.1186/s12943-016-0566-7。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Huang T，Zhou Y，Cheng AS，Yu J，To KF，Kang W.胃癌和其他胃肠道肿瘤中的NOTCH受体：致癌基因还是抑癌基因？摩尔癌症。2016;15(1):80. doi:10.1186/s12943-016-0566-7。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Uen YH，Fang CL，Lin CC，Hseu YC，Hung ST，Sun DP，等。神经酰胺合成酶6预测人类胃癌的预后：它通过失调SOCS2/JAK2/STAT3通路发挥癌蛋白的功能。霉菌致癌。2018;57(12):1675–1689. doi:10.1002/mc.22888。-内政部-公共医学

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[7] Yan C，Su H，Song X，Cao H，Kong L，Cui W.Smad泛素化调节因子1（Smurf1）通过Kisspeptin-1的泛素依赖性降解促进甲状腺癌细胞增殖和迁移。细胞生理学和生物化学：国际实验细胞生理学、生物化学和药理学杂志。2018;49(5):2047–2059. doi:10.1159/000493715。-内政部-公共医学

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[9] Bedekovics T、Hussain S、Feldman AL、Galardy PJ。UCH-L1在生发中心B细胞中诱导，并确定患有侵袭性生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者。鲜血。2016;127(12):1564–1574. doi:10.1182/bloud-2015-07-656678。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Bedekovics T、Hussain S、Feldman AL、Galardy PJ。UCH-L1在生发中心B细胞中诱导，并确定患有侵袭性生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者。鲜血。2016;127(12):1564–1574. doi:10.1182/bloud-2015-07-656678。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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