Arthropod transcriptional activator protein-1 (AP-1) aids tick-rickettsial pathogen survival in the cold

doi:10.1038/s41598-018-29654-6

.2018年7月30日；8(1):11409.

doi:10.1038/s41598-018-29654-6。

节肢动物转录激活蛋白-1（AP-1）帮助蜱类病原体在寒冷中存活

Supreet Khanal公司¹, 维卡斯·坦克¹, 约翰·安德森², Hameeda Sultana公司^1 三, 女孩尼拉坎塔^4 5

附属公司

¹美国弗吉尼亚州诺福克Old Dominion大学生物科学系。
²美国康涅狄格州纽黑文市康涅狄格州农业实验站昆虫学系。
^三美国弗吉尼亚州诺福克Old Dominion大学分子医学中心。
⁴美国弗吉尼亚州诺福克Old Dominion大学生物科学系。gneelaka@odu.edu。
⁵美国弗吉尼亚州诺福克Old Dominion大学分子医学中心。gneelaka@odu.edu。

PMID： 30061607
预防性维修识别码： PMC6065373型
内政部： 10.1038/s41598-018-29654-6

节肢动物转录激活蛋白-1（AP-1）帮助蜱类病原体在寒冷中存活

Supreet Khanal公司等。科学代表. 2018.

.2018年7月30日；8(1):11409.

doi:10.1038/s41598-018-29654-6。

作者

Supreet Khanal公司¹, 维卡斯·坦克¹, 约翰·安德森², Hameeda Sultana公司^1 三, 吉里什·内拉坎塔^4 5

附属公司

¹美国弗吉尼亚州诺福克Old Dominion大学生物科学系。
²美国康涅狄格州纽黑文市康涅狄格州农业实验站昆虫学系。
^三美国弗吉尼亚州诺福克Old Dominion大学分子医学中心。
⁴美国弗吉尼亚州诺福克市老多米尼克大学生物科学系。gneelaka@odu.edu。
⁵美国弗吉尼亚州诺福克Old Dominion大学分子医学中心。gneelaka@odu.edu。

PMID： 30061607
预防性维修识别码： PMC6065373型
内政部： 10.1038/s41598-018-29654-6

摘要

肩胛硬蜱向人类传播多种病原体，包括立克次体细菌、吞噬细胞无浆体。在这里，我们报告了吞噬细胞A.在节肢动物抗冻基因iafgp的调控中使用蜱转录激活蛋白-1（AP-1）作为分子开关。RNAi介导的ap-1表达沉默显著影响了从小鼠宿主获得蜱的iafgp基因表达和A.吞噬细胞负荷。凝胶位移分析提供了细菌和AP-1都影响iafgp启动子和表达的证据。荧光素酶分析显示，抗冻基因上游约700 bp的区域足以使AP-1结合促进iafgp基因表达。此外，存活试验表明，与模拟对照组相比，AP-1缺陷的蜱更容易感冒。此外，这项研究还表明节肢动物AP-1是一些蜱类基因的全球调节器，这些基因对载体中吞噬细胞a.存活至关重要。总之，我们的研究为立克次体病原体及其重要的医学媒介在寒冷中的生存确定了一种新的节肢动物信号模式。

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图1
激活蛋白*激活蛋白-1*mRNA在A类.吞噬细胞-受感染的未受精若虫。(A类)基因组区域我.肩胛骨1108462552178基因组支架来自全基因组鸟枪序列（GenBank登录号DS704943）。粗线顶部的矩形框表示AP-1、HSF-1结合位点或TATA区域。用于生成EMSA探针的序列的位置和位置用粗线下方的灰色条表示。这个*iafgp公司*基因序列分布在两个假定的外显子中(*iafgp公司*-CDS-1和*iafgp公司*-CDS-2），在粗线上显示为闭合的黑框。所有位置编号均对应GenBank，编号为DS704943。基因组区域的示意图没有达到规模。QRT-PCR检测结果显示*激活蛋白-1*幼稚未受精幼虫、若虫、成年雄性和成年雌性蜱的转录本(B类)未感染（UI）和A类.吞噬细胞-感染（I）全部若虫(C类)或唾液腺(天)图中显示了从未饲养的若虫中分离出来的若虫。小组B中的幼虫数据是根据集合蜱类样本（5–7只蜱/池）生成的。在面板B中，每个三角形、圆或倒三角形代表一个勾选样本。在面板C和D中，每个开圈表示来自未感染蜱虫（UI）的样本，而闭圈表示来自A类.吞噬细胞-受感染的蜱虫。的级别*激活蛋白-1*转录物被归一化为蜱类β-actin转录物的水平。使用Student t检验进行统计分析，所有面板（B–D）中小于0.05的P值均被视为显著。

图2
比对和系统发育分析*肩胛硬蜱*AP-1与其他正交曲线。(A类)图中显示了AP-1蛋白结构的示意图。领域分析我.肩胛骨AP-1一级氨基酸序列显示在N端存在Jun结构域（1–143 aa），在C端存在bZIP结构域（156–216 aa）。此外，C末端区域存在DNA结合域（161–176 aa）和多肽结合域（175–216 aa）。(B类)我.肩胛骨显示了使用DNASTAR（Lasergene Genomics Suite）中的ClustalW程序进行的AP-1氨基酸序列比对（与其他同源序列）。匹配的残留物以黑色着色。GenBank的登录号我.蓖麻毒素,*三色琥珀*,*微小牛蜱*,*小家鼠*,*褐家鼠*,*猕猴和智人*序列显示在左侧。氨基酸序列的总长度和百分比一致性与我.肩胛骨AP-1位于每个序列的一端。(C类)在DNASTAR中，使用ClustalW慢/准确对齐方法生成系统发生树，使用Gonnet作为蛋白质重量矩阵的默认值。底部的刻度表示每100个氨基酸残基的氨基酸替换。

图3
A类.吞噬细胞和AP-1影响*iafgp公司*发起人。(A类)凝胶位移分析结果显示*iafgp公司*TATA-探针与分离自A类.吞噬细胞-感染若虫与未感染若虫分离的核蛋白孵育后观察到的变化进行比较。生物素化*iafgp公司*TATA-结合区启动子探针（DS704943，18338–18387 bp）和来自未感染或A类.吞噬细胞–EMSA中使用了感染的若虫。楔形物代表核蛋白数量的增加（1、3、5µg）。(B类)生物素化凝胶位移分析*iafgp公司*启动子探针，包含来自未感染或A类.吞噬细胞–显示感染的若虫。(C类)生物素化凝胶位移测定*iafgp公司*显示了包含AP-1结合位点（DS704943，18144–18193 bp）和重组GST或rGST-AP-1蛋白（1,1.5µg，按楔形图所示的递增顺序）的启动子探针。(天)生物素化凝胶位移分析*iafgp公司*含有AP-1结合位点（DS704943，18144–18193 bp）、rGST单独或rGST-AP-1蛋白（1.5µg）和核蛋白（3µgA类.吞噬细胞–显示受感染的若虫。虚线箭头表示自由探针，实线箭头表示偏移。NE表示核提取物，+或−分别表示存在或不存在。

图4
AP-1结合*kat基因*发起人。(A类)使用生物素化AP-1区域探针（DS929842，124879–124830 bp）从凯特含有AP-1结合位点（DS929842，124858–124852 bp）和rGST单独或rGST-AP-1蛋白（1，3，5µg；楔形物表明核提取物的数量在增加）。点箭头表示自由探头，实心箭头表示频带偏移。+表示存在，−表示不存在。(B类)凝胶图像的密度分析(A类)如图所示。计算凝胶位移的相对强度与每个凝胶图像中的对照探针强度。

图5
蜱类抗冻基因上游约700 bp的DNA序列足以驱动*iafgp公司*基因表达。(A类)的示意图*iafgp公司*用于分析蜱细胞中启动子活性的启动子构建体。示意图未按比例绘制~700 bp DNA序列（GenBank中17757–18463的对应位置，编号DS704943）上游*iafgp公司*将包含所有测试结合位点（AP-1、HSF-1、TATA-区）的基因克隆到无启动子pGLuc（pGLuc-P）中_iafgp公司)向量。使用空的pGLuc载体作为对照。将这些构建体转染到蜱细胞中，并进行萤光素酶测定。(B类)从未感染（UI）或A类.吞噬细胞-感染的（I）转染pGLuc-P的ISE6细胞_iafgp公司或显示pGLuc构造。(C类)未感染（UI）或A类.吞噬细胞-感染的（I）转染pGLuc-P的ISE6细胞_iafgp公司或显示pGLuc构造。荧光素酶转录物的水平归一化为β-肌动蛋白转录物水平。开放或深灰色圆圈表示未感染（UI）或A类.吞噬细胞-分别用pGluc单独转染感染（I）细胞。浅灰色或黑色圆圈表示未感染（UI）或A类.吞噬细胞-转染pGLuc-P的感染（I）细胞_iafgp公司分别是。(天)荧光素酶活性测定从培养上清液A类.吞噬细胞-用mock-dsRNA或*ap-1型-*dsRNA并转染pGLuc-P_iafgp公司结构如图所示。在面板B和D中，每个圆圈代表从一个培养井收集的上清液中的荧光素酶活性测量。在面板C中，每个圆圈表示从一个培养孔的细胞生成的样本。使用Student t检验进行统计分析，B–D组的P值小于0.05被视为显著。

图6
的击倒*激活蛋白-1*影响细菌获取和*iafgp公司*蜱类中的基因表达。(A类)QRT-PCR结果显示*激活蛋白-1*以未感染或A类.吞噬细胞-感染小鼠。的级别*激活蛋白-1*(B类)或*iafgp公司*(C类)模拟或模拟成绩单*激活蛋白-1*-显示了从小鼠宿主获得细菌后出现的缺陷蜱。(天)回复后48小时模拟或*应用程序*-1缺陷若虫摄食A类.吞噬细胞-显示感染小鼠。(E类)生物素化凝胶位移分析*iafgp公司*启动子探针，包含AP-1结合位点（DS704943，18144–18193 bp）和核蛋白（2，4，6µg，按图像顶部楔子显示的递增顺序），由A类.吞噬细胞-受感染的模拟或*激活蛋白-1*-显示了不足的刻度。点箭头表示自由探头，实心箭头表示移位。面板A–D中的每个圆圈表示单个勾号。使用Student t检验进行统计分析，A组至D组的P值小于0.05被视为显著。NE表示核提取物，+或−分别表示存在或不存在。

图7
击倒*激活蛋白-1*影响的表达*iafgp公司*基因和A类.吞噬细胞ISE6细胞负荷*在体外*. (A类)QRT-PCR结果显示*激活蛋白-1*未感染或A类.吞噬细胞-感染ISE6细胞48小时p.i.QRT-PCR结果显示*激活蛋白-1*(B类)或*iafgp公司*(C类)用mock或*激活蛋白-1*-显示dsRNA。(天)模拟或*应用程序*-图中显示了24小时p.i.时1个沉默的ISE6细胞。(E类)生物素化凝胶位移分析*iafgp公司*-含有AP-1结合位点（DS704943，18144–18193 bp）和核蛋白（0.5，1µg）的启动子探针A类.吞噬细胞-受感染的模拟或*激活蛋白-1*-图中显示了沉默的ISE6细胞。点箭头表示自由探头，实心箭头表示移位。面板A–D中的每个圆圈表示从一个蜱细胞培养物中产生的RNA/DNA样本。采用Student t检验进行统计分析，P值小于0.05被认为具有显著性。NE表示细胞核提取物，+或−分别表示存在或不存在。

图8
的静音*激活蛋白-1*通过RNAi减少若虫*iafgp公司*蜱在低温下的表达和存活。(A类)QRT-PCR结果显示*激活蛋白-1*未感染或A类.吞噬细胞-感染蜱在10±1°C温度下孵育8小时。生物素化凝胶位移分析*iafgp公司*塔塔公司(B类)探针（DS704943，18338–18387 bp）或含有AP-1结合的探针(C类)从未感染（UI）或A类.吞噬细胞-感染（I）若虫在10±1°C下孵育8小时。点箭头表示自由探头，实心箭头表示移位。NE表示核提取物，+或−分别表示存在或不存在。QRT-PCR分析显示减少*激活蛋白-1*(天)或*iafgp公司*(E类)mRNA水平*激活蛋白-1*-dsRNA–注射未感染的若虫蜱与模拟处理的对照组进行比较。(F类)模拟或*激活蛋白-1*-dsRNA–在LT处注射若虫蜱₅₀显示时间点。(**G公司**)通过模拟或*激活蛋白-1*-dsRNA–LT时注射的蜱₅₀显示了时间点（−20°C，25分钟）。在面板A、D、E和G中，每个圆圈代表一个单独的刻度。然而，在面板F中，每个圆圈代表一个实验，每组10次。使用Student t检验进行统计分析，面板A和D–G中小于0.05的P值被认为是显著的。

图9
模型显示A类.吞噬细胞介导的AP-1-IAFGP信号在蜱类耐寒性中的作用。(A类)感染后，A类.吞噬细胞（显示为蜱细胞内的桑椹菌）和冷休克上调*激活蛋白-1*导致AP-1蛋白产量增加的基因表达。(B类)AP-1产量的增加促进了A类.吞噬细胞在蜱类中生存。此外，AP-1易位到细胞核并与*iafgp公司*发起人(C类)增加蜱类抗冻基因的表达，从而增加IAFGP的产量(天)蛋白质。(E类)IAFGP保护的产量增加A类.吞噬细胞和寒冷的蜱细胞。示意图未按比例显示。

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1. Anderson，J.F.和Magnarelli，L.A.蜱类生物学。Infect Dis Clin North Am22，195–215，v（2008）。-公共医学
1. Dumler JS等。人类粒细胞无浆体病和无浆吞噬细胞。新发传染病。2005;11:1828–1834. doi:10.3201/eid1112.050898。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Sonenshine，D.E.&Roe，R.《蜱类生物学》，第二版。牛津大学出版社2（2014）。
1. Needham GR，Teel PD。硬蜱的非现场生理生态学。昆虫学年度回顾。1991;36:659–681. doi:10.1146/annurev.en.36.010191.003303。-内政部-公共医学
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[4] Dumler JS等。人类粒细胞无浆体病和无浆吞噬细胞。新发传染病。2005;11:1828–1834. doi:10.3201/eid1112.050898。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[7] Needham GR，Teel PD。硬蜱的非现场生理生态学。昆虫学年度回顾。1991;36:659–681. doi:10.1146/annurev.en.36.010191.003303。-内政部-公共医学

[8] Needham GR，Teel PD。硬蜱的非现场生理生态学。昆虫学年度回顾。1991;36:659–681. doi:10.1146/annurev.en.36.010191.003303。-内政部-公共医学

[9] Sonenshine，D.E.《蜱类生物学》，第2卷。纽约：牛津大学出版社（1993）。

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