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.2018年1月9日；22(2):523-534.
doi:10.1016/j.celrep.2017.12.053。

Foxo1诱导转录抑制因子Zfp125引起肝脂肪变性和高胆固醇血症

古斯塔沃·W·费尔南德斯 1, 芭芭拉·M·L·C·博科 1, 塔蒂亚娜·丰塞卡 2, 伊丽莎白·A·麦卡尼奇 2, Sungro Jo公司 2, 拉托亚·J·拉蒂 2, InSug奥沙利文 三, 特里·甘特曼 三, Naillow Z Preite公司 4, 罗宾·M·沃伊特 4, 克里斯托弗·福赛斯 4, 阿里·克沙瓦尔齐安 4, Richárd Sinkó 5, Allison B Goldfine公司 6, 玛丽·E·帕蒂 6, 米里亚姆·O·里贝罗 7, Balázs Gereben先生 5, 安东尼奥·比安科 8
附属机构

Foxo1诱导转录抑制因子Zfp125引起肝脂肪变性和高胆固醇血症

古斯塔沃·W·费尔南德斯等。 单元格代表. .

摘要

2型脱碘酶基因（Alb-D2KO）的肝特异性破坏导致小鼠对饮食诱导的肥胖和肝脂肪变性产生抵抗。在这里，我们报告称，这可以通过肝脏锌指蛋白-125（Zfp125）表达减少约60%来解释。Zfp125是一种Foxo1诱导的转录阻遏物，通过减少肝脏甘油三酯分泌和肝细胞胆固醇流出，导致AML12小鼠肝细胞系中的脂质积聚和小鼠肝脂肪变性。Zfp125通过抑制参与脂蛋白结构、脂质结合和转运的18个基因发挥作用。ApoE启动子包含一个功能性Zfp125结合元件，该元件也存在于被Zfp125抑制的17个其他脂质相关基因中。虽然Zfp125的肝脏特异性敲除导致“Alb-D2KO-like”代谢表型，但Alb-D2KO小鼠中Zfp125表达的肝特异性正常化拯救了该表型，恢复了饮食诱导肥胖、肝脂肪变性和高胆固醇血症的正常易感性。

关键词：胆固醇；脱碘酶；肝细胞；肝脏；脂肪变性；转录抑制因子；甘油三酯；锌指蛋白125。

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数字

图1。
图1.组织分布和稳定表达兹夫普125在AML12细胞系中
（A） 用A-Zfp125探针检测细胞和小鼠组织的Western blot；每个轨道装载30μg总蛋白。（B）Zfp125型细胞中的mRNA水平。（C-F）用ORO染色的代表细胞；在（C）EV和（D）中Zfp125，用对照培养基处理细胞；（E）EV和（F）Zfp125，用油酸（OA）处理细胞。（G） 从细胞中提取的ORO的吸光度；ST，标准介质。（H） 细胞胆固醇含量。（一） 细胞甘油三酯含量。（J） 通过qRT-PCR评估细胞中的mRNA水平。（K） 细胞声波的Western印迹a-Gapdh公司和a-Mttp；1、2、5和6来自保存在标准培养基上的细胞；3、4、7和8来自保存在含有油酸的培养基上的细胞。（五十） 量化百万吨/年带如（K）所示，用标准化盖普德。（M） 细胞声波的Western印迹a-肌动蛋白和a-Apoa4；车道如（K）所示。（N） 量化阿波阿4带如（M）所示，用标准化肌动蛋白。（O）阿波罗条件培养基中的水平。（P） 细胞中的胆固醇流出。（Q） 培养基/细胞中FA（游离+并入甘油三酯）的百分比。TG、甘油三酯。数值为3-12个独立样本的平均值±SEM。基因缩写见表S6*与相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2。
图2……的影响Zfp125型AML12细胞系中的敲除
（A）Zfp125型细胞中的mRNA水平。（B-E）ORO染色的代表性细胞；in（B）非目标siRNA和（C）Zfp125型siRNA，用对照培养基处理细胞；在（D）非目标siRNA和（E）中Zfp125型siRNA，用油酸（OA）处理细胞。（F） 从细胞中提取的ORO的吸光度；ST，标准介质。（G） 总胆固醇含量。（H） 总甘油三酯含量。（一） 通过qRT-PCR评估mRNA水平。（J）阿波罗条件培养基中的水平。（K） 细胞声波的Western印迹a-Gapdh公司和a-Apoa4；1、2、5和6来自保存在ST上的细胞，而3、4、7和8来自保存在OA培养基上的细胞。（L） 量化载脂蛋白4带如（K）所示，用标准化盖普德。数值为3-12个独立样本的平均值±SEM。表S6中提供了基因缩写。*p<0.05、**p<0.01和**p<0.001与相应对照组比较。
图3。
图3。。Zfp125型是转录抑制物
（A） 假定Zfp125型上的绑定站点百万吨/年发起人。（B） a-FLAG抗体染色质免疫沉淀AML12细胞并进行qRT-PCR；结果是用IgG抗体对输入进行了倍增。（C） 用小鼠转染AML12细胞阿波携带小鼠片段的启动子-报告子结构阿波启动子缺乏下游内含子（-980/+93bp）或其截断变异体（-432/+93bp.）。荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶活性；粗箭头表示Zfp125型预测的结合位点。数值为3-12个独立样本的平均值±SEM。基因缩写见表S6*与相应对照组相比，p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
图4。
图4。。Zfp125型在肝脏和AML12细胞系中的表达
（A）Zfp125型24小时内对照小鼠肝脏中的mRNA；ZT、Zeitgeber。（B）Zfp125型对照组、禁食36小时或参考组小鼠肝脏中的mRNA。（C）Zfp125型用20 nM或200 n M胰岛素处理6小时的细胞中的mRNA水平。（D）用a-肌动蛋白和a-Zfp125。（E） 量化Zfp125型（D）中所示的频带，用标准化肌动蛋白。（F）Zfp125型CA感染细胞的mRNA水平福克斯1并控制±20 nM胰岛素6小时。（G）推测福克斯1绑定站点Zfp125型发起人。（H） AML12细胞的染色质免疫沉淀a-Foxo1公司抗体追踪qRT-PCR；结果是用IgG抗体对输入进行了倍增。（一）Zfp125型LIRKO和LIRFKO小鼠肝脏中的mRNA水平。（J）福克斯1Alb-D2KO和对照小鼠肝脏中的mRNA水平。在胰岛素实验中，用0.1%的FBS隔夜饥饿细胞血清，然后注射胰岛素。基因缩写见表S6。数值为3–10个独立样本的平均值±SEM*与对照组相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001*与所有组相比，p<0.05和**p<0.01。
图5。
图5.瞬态表达式的影响Zfp125型在小鼠肝脏中
（A）Zfp125型肝脏mRNA水平。（B-E）ORO染色的代表性肝脏切片。脂滴用箭头表示。（B和D）EV（B）和Zfp125型（D） 放大20倍。（C和E）EV（C）和Zfp125型（E） 放大40倍。（F） 肝切片ORO染色的定量分析；值是平均强度/图像面积。（G） 通过qRT-PCR评估肝脏基因的mRNA水平。（H）阿波罗用ELISA测定血浆中的水平。（I） 小鼠肝脏的蛋白质印迹a-Gapdh公司和a-Apoa4。（J） 量化阿波阿4（I）中所示的频带，用标准化加普德。（K） 小鼠肝脏的蛋白质印迹a-Gapdh公司和a-Ldlr公司。（五十） 量化Ldlr公司带如（K）所示，用标准化盖普德。（M） 肝脏甘油三酯含量。（N） 肝脏胆固醇含量。（O） 血浆甘油三酯水平。（P） 血浆总胆固醇水平。（Q） 血浆VLDL和LDL胆固醇水平。（R） 高密度脂蛋白胆固醇的血浆水平。（S） 瞬时表达小鼠血浆甘油三酯Zfp125型注射TritonWR1339后的病媒（5天）或EV（5天后）。线性回归线（EV的r=0.995和a=2.1±0.10；EV的r=0.988和a=1.6±0.13Zfp125）坡度差异显著（p=0.033）。TGSR，甘油三酯分泌率。数值为3–10个独立样本的平均值±SEM。表S6中提供了基因缩写。*p<0.05、**p<0.01和**p<0.001与相应对照组比较。
图6。
图6.瞬态击倒的影响Zfp125型在小鼠肝脏中
（A）Zfp125型Alb-D2KO或对照小鼠肝脏中的mRNA水平。（B）Zfp125型非靶siRNA转染对照肝、Alb-D2KO肝或转染对照肝脏的mRNA水平Zfp125型小干扰RNA；动物每天注射脂质体5天。（C） 接受手术的动物的德尔塔体重兹夫普125HFD 15天期间的mRNA操作；如图所示，在第10天开始腹腔注射脂质体。（D-I）ORO染色的代表性肝脏切片。（D） 对照+非靶siRNA HFD、（F）Alb-D2KO HFD和（H）对照+Zfp125型10倍放大的siRNA HFD。（E） 对照+非靶siRNA HFD、（G）Alb-D2KO HFD和（I）对照+Zfp125型放大20倍的siRNA HFD。（J） 肝脏甘油三酯含量。（K） 肝脏胆固醇含量。（五十） 血浆甘油三酯水平。（M） 血浆总胆固醇水平。（N） 血浆VLDL和LDL胆固醇水平。（O） 高密度脂蛋白胆固醇的血浆水平。数值为4–16个独立样本的平均值±SEM。表S6中提供了基因缩写。*p<0.05、**p<0.01和**p<0.001与相应对照组比较。
图7。
图7.瞬态表达式的影响Zfp125型在Alb-D2KO小鼠肝脏中
（A）Zfp125型对照组的mRNA水平，表达Alb-D2KO的EV，或表达Alb-D2KO的Zfp125型矢量；动物每天注射脂质体5天。（B） 动物体重增量Zfp125型HFD 15天期间的mRNA操作；如图所示，在第10天开始腹腔注射脂质体。（C-H）ORO染色的代表性肝脏切片。（C） 对照HFD、（E）Alb-D2KO+EV HFD和（G）Alb-D2KO+兹夫普125放大10倍的HFD。（D） 控制HFD，（F）Alb-D2KO+EV HFD。和（H）Alb-D2KO+Zfp125型放大20倍的HFD。（一） 肝脏甘油三酯含量。（J） 肝脏胆固醇含量。（K） 血浆甘油三酯水平。（L） 血浆总胆固醇水平。（M） 血浆VLDL和LDL胆固醇水平。（N） 高密度脂蛋白胆固醇的血浆水平。（O） 新生儿Dio2表达影响Foxo1基因甲基化状态（DMR）的拟议机制Zfp125型表达，解释Alb-D2KO小鼠的代谢表型。数值为4-9个独立样本的平均值±SEM。基因缩写见表S6*与相应对照组相比，p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
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