Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue

doi:10.1016/j.jneumeth.2017.02.002

.2017年3月15日：280:64-76。

doi:10.1016/j.jneumeth.2017.02.002。 Epub 2017年2月13日。

TRIzol沉淀蛋白的优化溶解允许Western blotting分析最大限度地利用脑组织中的数据

阿什利·M·科佩克¹, 菲利普·德里维拉², 迈克尔·J·拉卡尼纳^三, 里查·哈纳姆萨加², 斯泰西·D·比尔博²

附属公司

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学心理与神经科学系；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿科akopec@partners.org。
²美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学心理与神经科学系；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿科。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学心理与神经科学系。

PMID： 28192129
预防性维修识别码：项目编号5392113
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.jnumeth.2017.02.002

TRIzol沉淀蛋白的优化溶解允许Western blotting分析最大限度地利用脑组织中的数据

阿什利·M·科佩克等。神经科学方法杂志. 2017.

.2017年3月15:280:64-76。

doi:10.1016/j.jneumeth.2017.02.002。 Epub 2017年2月13日。

作者

阿什利·科佩克¹, 菲利普·德里维拉², 迈克尔·J·拉卡尼纳^三, 里查·哈纳姆萨加², 斯塔西·D·比尔博²

附属公司

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学心理与神经科学系；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿科akopec@partners.org。
²美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学心理与神经科学系；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿科。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学心理与神经科学系。

PMID： 28192129
预防性维修识别码：项目编号5392113
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.jnumeth.2017.02.002

摘要

背景：同时评估多水平分子加工的技术很有吸引力，因为复杂神经现象背后的分子信号发生在互补水平。TRIzol方法分离RNA和DNA，但由于沉淀蛋白颗粒的溶解效率低，蛋白质提取困难。

新方法：我们优化了一种缓冲液，用于有效溶解TRIzol沉淀脑组织中的蛋白质，用于Western blotting分析，该缓冲液在直接均质脑组织方面比RIPA缓冲液更有效。

结果：通过优化标准裂解缓冲液中的化学品浓度，除了通过直接均质化提高蛋白质产量外，还可以提高溶解过程中的蛋白质产量。总蛋白产量和翻译后修饰分析的有效培养参数非常灵活。重要的是，不同的神经细胞类型和蛋白质类别在可溶性蛋白质样品中有代表性。此外，我们使用分离的小鼠脑组织从其他细胞类型中分离出小胶质细胞，并成功地从这些难以获得的小样本中分离出细胞类型特异性蛋白。

与现有方法的比较：迄今为止，溶解缓冲液主要由SDS或尿素组成；本文的数据表明，裂解缓冲液中常见的组分在直接均质和沉淀后也能增强蛋白质的溶解。

结论：该方法适用于评估单个大脑样本中的基因和蛋白质表达，从而能够更全面地评估神经现象，同时最小化受试者的数量。

关键词：蛋白质沉淀；蛋白质溶解；RIPA缓冲器；三唑；蛋白质印迹。

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数字

**图1。EDTA、NaCl和SDS浓度在三唑沉淀蛋白溶解期间显著改变蛋白质产量**
**（A）**从三个单独的样品（每个样品包含两个合并的大鼠海马样品）中沉淀TRIzol后，用标准裂解缓冲液（1mM EDTA，140mM NaCl，2%SDS，10mM Tris）溶解，平均产生3.4μg/μL蛋白质。**（B）**单独改变EDTA、NaCl和SDS的浓度，而所有其他化学成分保持在标准裂解缓冲液水平，则会显著影响溶解过程中的蛋白质产量。Tris浓度不影响产量。**（C）**（B）中定量数据的代表性考马斯染色凝胶。

**图2。同时优化EDTA、NaCl和SDS浓度可提高三唑沉淀蛋白溶解过程中的蛋白质产量**
**（A）**从六个单独的海马样品中沉淀TRIzol后，用优化的裂解缓冲液（20mM EDTA，140mM NaCl，5%SDS，100mM Tris）溶解，平均产生5.2μg/μL蛋白质，而标准裂解缓冲液的蛋白质产量为3.4μg/微升（图1A）。**（B）**在图1B中确定的优化值附近改变EDTA、NaCl和SDS的浓度不会进一步提高增溶过程中的蛋白质产量。**（C）**（B）中定量数据的代表性考马斯染色凝胶。

**图3。在不同的时间和温度培养条件下，优化的裂解缓冲液比常用缓冲液更有效地溶解三唑沉淀蛋白**
**（A）**与其他裂解缓冲液（RIPA、1%十二烷基硫酸钠和标准裂解缓冲液[见图1]）相比，优化的裂解缓冲液显著提高了溶解过程中的蛋白质产量（100°C下30分钟）。在不同温度下，通过在优化的裂解缓冲液中溶解的蛋白质产量没有显著差异**（B）**或用于不同的时间长度**（C） ●●●●。**量化数据的代表性考马斯染色凝胶如图所示A类′–C′.

**图4。使用优化的裂解缓冲液进行溶解，可在长达18小时的孵育中保留磷酸特异性信号**
**（A）**尽管延长了孵育时间，总ERK1/2蛋白没有变化，这与相同孵育期间总蛋白没有变化一致（图3C）。**（B）**磷酸特异性ERK1/2信号通过在较低温度下培养18小时而显著增强。定量数据的典型Western blot如图所示A类′**–B类**′. 在B类′，总ERK1/2呈红色，磷酸化ERK1/2（pERK）呈黄色（绿色覆盖在红色上），在42kDa带中识别度最高（箭头）。

**图5。直接均质和沉淀样品中最优裂解缓冲液蛋白质产率的比较**
**（A）**使用优化的裂解缓冲液（Opt.Homog）直接均质额叶皮层，每毫克组织比RIPA缓冲液（RIPA Homo）分解的蛋白质要多得多。**（A）**′)代表性考马斯染色凝胶用于标准化起始组织块。箭头所示为高分子量蛋白带，仅当组织在优化的裂解缓冲液中均质化时才存在，而不是RIPA缓冲液。**（B）**与优化的裂解缓冲液用于直接均质（Opt.Homog）相比，优化的三唑沉淀蛋白（Opt.Precip）裂解缓冲液增溶可从海马样品中获得约70%的蛋白质。**（B）**′)代表性考马斯染色凝胶标准化起始组织质量。重要的是，匀浆和沉淀的蛋白质样品都能分辨出RIPA缓冲液匀浆蛋白质中不存在的蛋白质带。**（C）**将（A）和（B）的蛋白质产量归一化为同一动物体内优化的裂解缓冲液匀浆（Opt.Homog）。溶解产生的蛋白质产量（Opt.沉淀）相当于RIPA缓冲液匀浆中的蛋白质产量（RIPA同源物）。

**图6。脑组织中的三唑沉淀蛋白代表多种细胞类型和蛋白质类别**
**（A）**沉淀蛋白的Western blot分析检测到脑组织中固有的不同细胞类型。NeuN=神经元，GFAP=星形胶质细胞，Olig2=少突胶质细胞，Iba1=小胶质细胞，PV=抑制性中间神经元。**（B）**沉淀蛋白中有不同的蛋白质类别，包括突触蛋白（PSD95，VGlut1）、膜结合蛋白（Iba1）、核蛋白（NeuN）、细胞质蛋白（图4中的肌动蛋白和ERK1/2）和分泌蛋白（IL-10）。**（C）**在优化的裂解缓冲液中溶解后，成功分析来自单个细胞悬浮液特定群体的蛋白质（即CD11b+群体中的小胶质细胞和CD11b−群体中的其他神经细胞类型）。CD11b+群体含有Iba1，但不含NeuN蛋白，而CD11b−群体含有NeuN，但不包含Iba1蛋白。

**图7。蛋白质沉淀和溶解过程的图示**
组织在TRIzol中均质，一部分酚乙醇溶液（RNA分离后）用于蛋白质沉淀，而剩余部分可无限期储存在−20至−80°C。异丙醇沉淀蛋白质，然后造粒并用95%乙醇洗涤。将颗粒干燥，悬浮在优化的裂解缓冲液中（20mM EDTA、140mM NaCl、5%SDS、100mM Tris pH 8.0、50mM NaF、1mM活化NaOv、Roche蛋白酶抑制剂），并在50°C下培养1-18小时。温度和孵育时间是灵活的，只要所有样品都经过一致处理，实验者就可以确定。

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1. Aakalu G，Smith WB，Nguyen N，Jiang C，Schuman EM.海马神经元局部蛋白质合成的动态可视化。神经元。2001;30:489–502.-公共医学
1. Adams JP、Sweatt JD。分子心理学：ERK-MAP激酶级联在记忆中的作用。《药物毒理学年鉴》。2002;42:135–63.-公共医学
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1. Arakawa T，Timasheff SN。二价阳离子盐对蛋白质盐析和盐析的机理：水合和盐结合之间的平衡。生物化学。1984;23:5912–23.-公共医学
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[9] Arnold U，Ulbrich-Hofmann R.脱氧胆酸钠/三氯乙酸从含盐酸胍溶液中定量沉淀蛋白质。分析生物化学。1999;271:197–9.-公共医学

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